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文档简介

实时荧光定量PCR——TaqMan探针法

2021/5/91

序列选取应在基因的保守区段;避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构;典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%;引物之间的TM相差避免超过2℃;引物的3’端避免使用碱基A,引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子;

Taqman探针技术要求片段长度在50bp-150bp;引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。TaqMan技术引物设计原则2021/5/92TaqMan探针设计原则先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针;探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性;探针的DNA折叠和二级结构;尽量避开二级结构;

Tm值在65-70℃,通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃),以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合,GC含量在40%-70%;探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用;整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针;为确

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