核酸的体外扩增与基因芯片技术

核酸的体外扩增与基因芯片技术第一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

第一节

聚合酶链反应

PolymeraseChainReaction第二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日聚合酶链反应

(PolymeraseChainReaction,PCR)

1983年,美国PECetus公司的KaryMullis建立了PCR技术,使人们能够通过试管内的数小时反应将特定的DNA片段扩增数百万倍,KaryMullis因此获1993年度诺贝尔化学奖.第三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日KaryMullis(1985)发明过程

Mullis在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:

“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。发展过程：开始使用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。第四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家MichaelSmith共获第五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日参与DNA复制的物质底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):

解开成单链的DNA母链引物(primer):

提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合

其他的酶和蛋白质因子：第七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日5Primer15Primer2Cycle2Cycle155

55

5

5TemplateDNA55

555

5

55一、基本工作原理第八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日Cycle355

555

5

555

5

55

555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第九页，共七十八页，编辑于2023年，星期日（一）原理：双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA－－－变性↓与一对寡核苷酸引物（5’，3’）降低温度退火

DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火↓适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA－－延伸↓第二轮：变性—退火—延伸呈指数增长理论值：一轮一倍10轮210=1000倍

20轮22030轮230

理论模板扩增30轮1ng-----------1g

实际模板扩增30轮1ng-----------10g第十页，共七十八页，编辑于2023年，星期日模板DNA

特异性引物耐热DNA聚合酶

dNTPs

含Mg2+

的缓冲液二、PCR体系基本组成成分第十一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日1.TaqDNA聚合酶：

水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶①5’3’DNA聚合酶活性；②无3’5’外切酶活性，

35轮0.25%错配，与原始模板有差别；最适聚合酶温度72℃，选择72℃延伸

第十二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日pfuDNA聚合酶

耐热5’3’DNA聚合酶活性3’→5’外切酶活性精确度：pfu>Taq

但pfu扩增效率通常比Taq酶略差文献报道：Taq+pfu会起到较好效果第十三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

2.引物

人工合成短寡核苷酸15bp-30bp→Tm=55℃-60℃，

Tm值要相近◆设计原则：(P62)

（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同

3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同正链5'—————3'——上游Primer

——下游Primer负链3'—————5'

例如：

IL-3正链

5'GCTCCATGACCCAG-----------GCGATCTTTTGAGTCCAA3'

负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'

上游~：与其相同下游~：先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'

所以负链Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'第十四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer

一般不要超过3个互补bp

如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

第十五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

修饰如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果突变：

AGCTCCATGACCCAG

5'CGCTCCATGACCCAG3'注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸（4）Primer5’末端可修饰、突变:第十六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

3.模板：可选：DNAmRNA→逆转录→cDNADNA包括：质粒噬菌体染色体DNA

较小较大①目的gene是单拷贝变性较易变性较难②非常大，变性难模板用量

Plasmid:lngChromosome:300-500ng

注意：防止交叉污染第十七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

模板可以是DNA，也可以是RNA。RNA逆转录成cDNA再进行正常的PCR循环。标本取材：病原体：病毒、细菌、真菌等病理生理：细胞、血液、尿液等法医：血斑、精液、毛发第十八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日4.dNTP：四种脱氧核苷酸，基本原料终浓度：50M注意：不稳定，保存时间长会失效第十九页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

5.Mg2+

TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+

不同的酶需不同Mg2+Taq：较少，Mg2+

对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍第二十页，共七十八页，编辑于2023年，星期日（1）变性温度：94-95℃Templete：GC比例高、长度很长，则变性T↑（2）退火：温度越高，扩增特异性越好取决于Tm值：Tm↑退火T↑；

Tm↓退火T↓若Tm较高，可使退火和延伸在同一温度（3）延伸：1000nt---1min一般：40－60s6.温度和时间：第二十一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日三、PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C第二十二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR反应的步骤⑴在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，人工合成的两个DNA引物，四种脱氧单核苷酸（dNTP），一种耐热的多聚酶和Mg2+。⑵将上述溶液加热，使模板DNA在高温下（如95℃）

变性，双链解开为两条单链；⑶然后降低反应温度，使两条引物在低温下（55℃）分别与两条模板互补退火，形成局部双链；⑷再升高反应温度至中温（72℃），此时多聚酶以dNTP为原料，以两引物为复制的起点，在两条模板上合成新的DNA子链(延伸)。⑸如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段。第二十三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

PCR实验中应注意的事项防止样品的污染和结果的假阳性：分装试剂，减少重复取样采用一次性吸头无菌操作实验对照：阳性对照、阴性对照、试剂对照第二十四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第二十五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定四、PCR的主要用途第二十六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR技术的应用一、基础研究中的应用二、临床研究中的应用第二十七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR技术在临床疾病的诊断中的用途一、PCR检测性病病原体二、PCR检测肝炎病毒三、PCR检测消化道、呼吸道致病菌四、PCR检测寄生虫五、PCR在遗传性疾病诊断中的应用六、PCR在肿瘤疾病诊断中的应用第二十八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR技术在基础研究中的应用一、目的基因的克隆

RT-PCR、Nested-PCR、RACE与反转录反应相结合,直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片断利用特异性引物从基因组DNA或者cDNA获得已知目的基因片断利用随机引物从cDNA或者基因组文库中克隆基因二、体外突变嵌和、缺失、点突变第二十九页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR扩增产物的检测琼脂糖凝胶电泳

溴化乙锭（嵌入）染色

紫外光检测

分子量参照第三十页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR产物电泳第三十一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日五、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术第三十二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第三十三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日Real-timePCR

利用实时荧光定量PCR的原理，对DNA靶分子的起始拷贝数进行定量的核酸检测系统。该方法精确、灵敏、污染途径小。是国际公认的核酸分子定量的标准方法。它是在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它已逐渐代替了Northernblot以及RT-PCR技术。第三十四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日实时PCR技术原理第三十五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日PCR引物实时PCR技术原理第三十六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日引物之间一段带有标记寡核苷酸链，称作探针第三十七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日报告基团淬灭基团第三十八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日无荧光信号产生能量激发光完整的探针：5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移）

第三十九页，共七十八页，编辑于2023年，星期日变性(95ºC)第四十页，共七十八页，编辑于2023年，星期日退火(60ºC)第四十一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日延伸(72ºC)第四十二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第四十三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第四十四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日?第四十五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日5′→3′外切酶活性将探针5′端连接的荧光基团从探针上切割下来第四十六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第四十七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第四十八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第四十九页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第五十七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

实时(Real-time)

PCR的优点实时PCR反应可以在PCR扩增进展过程中监测到每一个循环后PCR产物的积聚情况,而且能对反应产物进行自动化定量分析与传统PCR反应相比,实时PCR不需要进行凝胶电泳分析,这样可以减少污染的机会,降低假阳性结果第五十八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日基因文库

GeneLibrary第二节第五十九页，共七十八页，编辑于2023年，星期日基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。第六十页，共七十八页，编辑于2023年，星期日基因组DNA文库第六十一页，共七十八页，编辑于2023年，星期日cDNA文库第六十二页，共七十八页，编辑于2023年，星期日mRNAcDNA

双链cDNA

重组DNA分子cDNA文库

反转录酶

载体

受体菌

复制*从cDNA文库获取目的基因

逆转录酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT第六十三页，共七十八页，编辑于2023年，星期日第三

节

基因芯片技术BiologicalChipTechnology第六十四页，共七十八页，编辑于2023年，星期日

生物芯片生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。第六十五页，共七十八页，编辑于2023年，星期日生物芯片的分类(1)DNA芯片(Genechip,DNAchip,DNAmicroarray)(2)蛋白质芯片(Proteinchip)(3)芯片实验室(Lab-on-a-chip)第六十六页，共七十八页，编辑于2023年，星期日基因芯片：是指将大量探针分子固定在物体表面，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，进而获取样品分子的数量和系列信息。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。基因芯片第六十七页，共七十八页，编辑于2023年，星期日蛋白质芯片：是以蛋白质代替DNA作为检测对象，比基因芯片更进一步接近生命活动的物质层面，因而有着比基因芯片更加直接的应用前景。蛋白质芯片第六十八页，共七十八页，编辑于2023年，星期日芯片实验室：是生物芯片技术发展的最终目标。