第三章基因工程设计策略及操作流程2

外源DNA

载体DNA

重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达

表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞3.4基因的重组与转移当前第1页\共有98页\编于星期三\8点3.4.1基因的体外连接重组含目的基因的外源DNA在体外通过限制性内切酶和DNA连接酶的作用与载体连接，获得重组DNA的过程，称为基因的体外连接重组。基因的体外重组有两种方式：插入式和置换式。当前第2页\共有98页\编于星期三\8点基因体外重组的类型当前第3页\共有98页\编于星期三\8点插入式是用一种限制性内切酶消化载体，在载体上此酶只有一个识别序列，实现外源片段插入载体的切口；置换式可用两种限制性内切酶或是在载体上有两个识别序列的一种限制性内切酶处理载体，载体被切成大小不等的两个片段，把外源DNA与载体大片段连接，即置换了载体中原有的小片段，形成重组DNA分子。当前第4页\共有98页\编于星期三\8点形成重组DNA的实质就是催化外源DNA与载体DNA间高效地形成3′,5′-磷酸二酯键，连接方式有很多种，具体使用时要根据外源DNA与载体DNA末端的性质选择合适的方法，以保证连接效率。当前第5页\共有98页\编于星期三\8点DNA连接酶当前第6页\共有98页\编于星期三\8点（1）互补黏性末端的连接互补黏性末端的产生是由于外源DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割或是用两种同尾酶切割，但用同尾酶切割后产生的重组DNA分子丧失了原有的两种限制性内切酶的识别序列。当前第7页\共有98页\编于星期三\8点黏性末端的连接当前第8页\共有98页\编于星期三\8点A两段DNA的连接依靠粘性末端当前第9页\共有98页\编于星期三\8点BDNA片断与载体的连接依靠粘性末端当前第10页\共有98页\编于星期三\8点当前第11页\共有98页\编于星期三\8点ligasenick当前第12页\共有98页\编于星期三\8点C载体与载体的连接当前第13页\共有98页\编于星期三\8点

20μL的互补黏性末端连接反应体系为：

2μLT4DNA连接酶缓冲液或E.coliDNA连接酶缓冲液

5μL外源DNA片段

5μL载体DNA片段

1μLT4DNA连接酶或E.coliDNA连接酶

其它用ddH2O补齐

充分混匀后，16℃过夜连接连接体系当前第14页\共有98页\编于星期三\8点连接效率的检测可用琼脂糖凝胶电泳法，以载体酶切片段、外源DNA酶切片段为对照，若只出现两条与对照带相同的条带，表明连接反应失败；若出现一系列新带，表明发生连接。为了保证连接效率，减少连接过程中的副产物，连接时要注意以下几点：接反应中外源DNA片段和载体DNA片段的浓度、防止载体自身环化、产生两种重组DNA分子。当前第15页\共有98页\编于星期三\8点载体去磷酸化当前第16页\共有98页\编于星期三\8点双酶切法当前第17页\共有98页\编于星期三\8点5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’（2）平末端的连接当前第18页\共有98页\编于星期三\8点如果把由两种不同限制性内切酶切割产生的平末端DNA片段进行连接，得到的连接产物就丧失了原有的识别序列。如果将由同一种限制性内切酶产生的平末端DNA片段进行连接，得到的连接产物仍保留原有的识别序列或是出现一个新的识别序列。当前第19页\共有98页\编于星期三\8点平末端片段的连接当前第20页\共有98页\编于星期三\8点（3）末端修饰后的连接①片段末端同聚物加尾法：一个为平末端和一个为黏性末端的DNA片段之间的连接，也可以两个平末端DNA片段间的连接。需要末端转移酶（terminaltransforase）催化，在酶的作用下按照5′→3′方向将四种脱氧核苷酸分子的任意一种依次添加到DNA片段的3′-OH末端，形成同聚物poly(dC)或poly(dG)或poly(dT)或poly(dA)。当前第21页\共有98页\编于星期三\8点待连接的DNA片段末端加上长度约10-40个核苷酸的互补的同聚物尾巴后，在T4DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子，重组DNA分子中有缺口的部分可待其转入受体细胞后，利用受体细胞中的DNA聚合酶和DNA连接酶将缺口填补起来。当前第22页\共有98页\编于星期三\8点片段末端同聚物加尾法能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来当前第23页\共有98页\编于星期三\8点②黏性末端修饰为平末端适用于两个DNA片段末端为非互补黏性末端的情况，也可用于一个片段为平末端另一片段为黏性末端的情况。将黏性末端改为平末端需要在核酸外切酶Ⅶ（exonucleaseⅦ，ExoⅦ）的作用下，将双链DNA片段的5′或3′端突出部分的单链断裂，使黏性末端的DNA片段变为平末端。当前第24页\共有98页\编于星期三\8点黏性末端修饰为平末端当前第25页\共有98页\编于星期三\8点（4）末端加连杆的连接连杆又叫衔接物(linker)，是指用化学法合成的由10-12个核苷酸组成，具有一个或数个限制性酶识别位点的寡核苷酸片段。将连杆加在待连接的DNA分子的末端，然后用在连杆中具有识别位点的限制性内切酶处理，即可得到具有互补黏性末端的两种DNA片段，再在DNA连接酶作用下实现连接。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：当前第26页\共有98页\编于星期三\8点这种方法适合于具有平末端的两种DNA片段，或是具有平末端和黏性末端的两种DNA片段，也适用于非互补黏性末端的两种DNA片段的连接。当前第27页\共有98页\编于星期三\8点末端加连杆当前第28页\共有98页\编于星期三\8点当前第29页\共有98页\编于星期三\8点1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’

GGCC-p5’

BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用（5）DNA接头(adapter)连接法当前第30页\共有98页\编于星期三\8点Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’

HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-

GGCC--CCGG

-GGCCCTAG-P5’

5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGG

GGCCCTAG-P5’

CCGGGATCCCGG-OH

GGCCCTAGGGCC-P5’

接头自我连接当前第31页\共有98页\编于星期三\8点当前第32页\共有98页\编于星期三\8点3.4.2重组分子的转移重组分子构建完成后，必须导入到合适的受体细胞，才能实现复制、扩增和表达。受体细胞又称为宿主细胞，是指能够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。当前第33页\共有98页\编于星期三\8点将重组分子导入受体细胞的方法有很多种，如转化、转染、显微注射和电穿孔等多种方式，在转移重组分子时根据受体细胞的区别选择合适的导入方法。一般原核细胞和低等真核细胞作受体时主要用转化和转染法，而高等动植物的真核细胞作受体时主要用显微注射和电穿孔法。当前第34页\共有98页\编于星期三\8点感受态制备过程培养大肠杆菌OD600至Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的0.1mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的0.1mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的0.1mMCaCl2重悬当前第35页\共有98页\编于星期三\8点（1）重组分子转入原核细胞

热激法转化（Ca2+有助于转化）往感受态细胞中加入重组DNA分子置冰浴中培养30min后42℃热休克90s实现感受态细胞对重组DNA分子的吸收。当前第36页\共有98页\编于星期三\8点（2）重组分子转入真核细胞酵母作为受体细胞的转化与细菌类似，先去除细胞壁游离出原生质球，接着在有CaCl2和聚乙二醇的溶液中，重组DNA很容易被受体细胞吸收。当前第37页\共有98页\编于星期三\8点哺乳动物细胞作为受体细胞可用磷酸钙沉淀法、病毒颗粒转染法、DEAE-葡聚糖转染法、电穿孔法和显微注射法等将外源基因导入。外源基因导入植物细胞还可利用农杆菌介导的Ti质粒载体转化法。当前第38页\共有98页\编于星期三\8点作业 1.如何将两端平齐末端的DNA进行连接？都有哪些可能的方法？2.如何保证克隆在载体上的目的基因片段的方向性？3.试比较转化、转导和转染。4.受体细胞应满足的条件有哪些？5.请写出真核生物电穿孔、显微注射、农杆菌转化法的全过程。当前第39页\共有98页\编于星期三\8点3.5重组体的筛选3.5.1遗传表型筛选法遗传表型筛选法是比较直接的筛选方法，是根据转化子接受了重组DNA而与非转化子在表型上存在差异进行区分的一种方法。主要包括抗药性筛选、插入失活筛选和显色互补筛选。当前第40页\共有98页\编于星期三\8点（1）载体表现特征筛选抗药性筛选利用载体DNA分子上携带的抗药性基因进行筛选。抗药性基因主要有氨苄抗性基因（ampr）、氯霉素抗性基因（cmpr）、卡那霉素抗性基因（kanr）、四环素抗性基因（tetr）、链霉素抗性基因（smr）等。当前第41页\共有98页\编于星期三\8点插入失活筛选法可弥补抗药性筛选的不足，可直接筛选出含重组质粒的受体细胞。这种方法利用质粒载体的双抗药性。当前第42页\共有98页\编于星期三\8点插入失活筛选当前第43页\共有98页\编于星期三\8点-半乳糖苷酶

乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。蓝白班筛选当前第44页\共有98页\编于星期三\8点互补而产生的lacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）存在时产生蓝色沉淀物，使菌落显蓝色。如果外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，无法实现互补，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。当前第45页\共有98页\编于星期三\8点-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。当前第46页\共有98页\编于星期三\8点蓝白斑筛选当前第47页\共有98页\编于星期三\8点（2）插入序列表现特性筛选如果重组DNA分子中的插入序列在受体细胞中能够实现功能性表达，则可赋予受体细胞表现出插入序列编码的表型特征，可利用此特点筛选含有重组子的转化细胞。当前第48页\共有98页\编于星期三\8点从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。分子量Marker载体重组克隆3.5.2结构特征筛选法（1）凝胶电泳筛选凝胶电泳筛选法是利用了重组质粒和非重组质粒在分子大小上存在差异的性质。将平板上长出的菌落进行质粒提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳。当前第49页\共有98页\编于星期三\8点（2）菌落PCR筛选菌落PCR筛选是利用质粒上的引物对质粒DNA进行PCR扩增来鉴定重组子菌落。在多数载体DNA分子中，外源DNA插入位点两侧的序列是已知的。如果受体细胞中含有的是重组质粒，以插入位点两侧序列的互补序列为引物进行PCR反应，则可获得外源DNA。接着进行琼脂糖凝胶电泳在外源DNA的位置就应该有对应的条带。当前第50页\共有98页\编于星期三\8点如果受体细胞中是非重组质粒，以插入位点两侧序列的互补序列为引物进行PCR，则在琼脂糖凝胶电泳检测时无法获得与外源DNA相符的条带。当前第51页\共有98页\编于星期三\8点（3）酶切鉴定

酶切鉴定是利用重组质粒中外源DNA可选用适当的限制性内切酶再回收的原理。将平板上长出的菌落增殖培养后提取质粒，对提取的质粒分子进行酶切反应，接着用琼脂糖凝胶电泳。当前第52页\共有98页\编于星期三\8点重组质粒会得到两条带，一条是与线性载体大小一致，另一条带与插入的外源DNA大小一致，但非重组质粒仅有一条带，其位置与线性载体一致。当前第53页\共有98页\编于星期三\8点ABA或B当前第54页\共有98页\编于星期三\8点当前第55页\共有98页\编于星期三\8点不同克隆的酶切结果当前第56页\共有98页\编于星期三\8点3.5.3核酸分子杂交筛选法核酸分子杂交法是利用特异的核酸探针与待测核酸进行杂交，检测待测核酸中是否存在与探针互补的DNA片段。此法也可用于鉴别期望重组子和非期望重组子。在杂交前先将待测核酸变性，将其固定在硝酸纤维素膜上或尼龙膜上。当前第57页\共有98页\编于星期三\8点然后用探针与之孵育，洗去多余的探针，若最终有显示的条带则证明含有目的基因，反之则无。核酸分子杂交法根据待测核酸来源和固相支持物的不同可分为Southern杂交法、Northern杂交法、斑点印迹杂交法和菌落印迹原位杂交法。当前第58页\共有98页\编于星期三\8点当前第59页\共有98页\编于星期三\8点Southernblot筛选结果当前第60页\共有98页\编于星期三\8点Southern杂交是将待测DNA分子酶切后变性，转移至适当的滤膜上用已标记的单链DNA或RNA探针杂交以检测这些被转移的DNA片段。Northern杂交是将RNA分子变性及电泳分离后再用探针进行检测。当前第61页\共有98页\编于星期三\8点斑点印迹杂交是将变性的DNA或RNA核酸样品直接转移到适当的杂交膜上，然后加探针进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异的DNA片段或RNA片段。菌落原位杂交是直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出含有目的基因的菌落或噬菌斑。当前第62页\共有98页\编于星期三\8点当前第63页\共有98页\编于星期三\8点3.5.4免疫化学筛选法免疫化学筛选法是用抗体作为探针，而非DNA或RNA探针来鉴定目的基因的表达产物。免疫化学筛选法分为放射性抗体筛选、非放射性抗体筛选法和免疫沉淀筛选法。当前第64页\共有98页\编于星期三\8点（1）放射性抗体筛选在放射性抗体筛选法中，先将待检测的菌落或噬菌体按原位印迹到硝酸纤维素膜上，裂解细胞使目的蛋白抗原释放并结合在膜上，然后与第一抗体反应生成抗原-抗体复合物。当前第65页\共有98页\编于星期三\8点接着再用放射性125I标记了的第二抗体（抗第一抗体中特异性抗原决定簇的抗体）直接检测，去除过剩的第二抗体，薄膜干燥后放射性自显影，即可显示出是否有所需的重组体。当前第66页\共有98页\编于星期三\8点放射性抗体检测法过程当前第67页\共有98页\编于星期三\8点（2）非放射性抗体筛选由于放射性物质的半衰期短和安全问题，研究人员开发出了非放射性标记物。如第二抗体可用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶相偶联，检测目的蛋白抗原-抗体复合物，或者也可用于辣根过氧化酶偶联的抗生物素蛋白来检测与生物偶联的第二抗体等。当前第68页\共有98页\编于星期三\8点待测基因产物蛋白一抗二抗酶

待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶

当前第69页\共有98页\编于星期三\8点（3）免疫沉淀筛选免疫沉淀筛选法是把与目的基因产物相对应的标记抗体加在有转化子菌落的培养基中。利用抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的原理，如果在菌落周围有白色圆圈，说明发生了抗体-抗原反应，表明该菌落产生与抗体相对应的抗原蛋白（目的基因产物）。当前第70页\共有98页\编于星期三\8点对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。当前第71页\共有98页\编于星期三\8点3.5.5转译筛选法利用克隆的DNA同所编码的蛋白质产物之间的对应关系进行筛选，分为杂交抑制转译筛选和杂交选择转译筛选。当前第72页\共有98页\编于星期三\8点作业 1．举例说明插入失活的基本原理。2.何谓ɑ-互补？何谓安慰性诱导物？3.如何用PCR来检测目的基因是否被克隆？他是基于什么原理？当前第73页\共有98页\编于星期三\8点3.6克隆基因的表达3.6.1克隆基因的表达系统基因工程的表达系统分为原核和真核两类，常用的原核细胞表达系统有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌等，真核表达系统有酵母、丝状真菌、昆虫细胞和哺乳类细胞。当前第74页\共有98页\编于星期三\8点原核生物作表达系统具有生长迅速、培养条件简单等优点，但大多缺乏转录后加工和对蛋白质进行糖基化、磷酸化等修饰的能力。真核细胞作宿主表达系统虽能去除外源基因中的内含子，并可对蛋白质进行翻译后加工，但其选择标记少、转化效率低。当前第75页\共有98页\编于星期三\8点克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。当前第76页\共有98页\编于星期三\8点3.6.2克隆基因在转录水平的表达与调控转录是基因表达的第一步，也是基因表达调控的主要层次。基因在转录水平上的调控主要在转录的起始阶段和终止阶段，调控方式有顺式作用和反式作用两类，每一类中又有正调控和负调控两种形式。当前第77页\共有98页\编于星期三\8点顺式调控是一段非编码DNA序列对基因转录的调控作用，反式调控是一种蛋白质作用于某一顺式作用元件来影响基因的转录。正调控促进转录的进行，而负调控是抑制转录的发生。当前第78页\共有98页\编于星期三\8点(1)原核的转录起始与转录终止RNA聚合酶与启动子的直接结合；强启动子如Lac、Trp。当前第79页\共有98页\编于星期三\8点当前第80页\共有98页\编于星期三\8点转录终止有两种类型一种是不依赖于ρ因子的终止另一种终止机制是依赖于ρ因子的终止当前第81页\共有98页\编于星期三\8点(2)真核的转录起始与转录终止真核生物的启动子由核心启动子元件和上游启动子元件两部分构成。核心启动子元件是保证基础水平转录所必须的最少的DNA序列，包括转录起始位点和TATAbox。上游启动子元件决定着转录起始的频率与效率，包括GCbox和CAATbox。在转录起始时需要其他的蛋白质因子参与，这些蛋白质因子称为转录因子。当前第82页\共有98页\编于星期三\8点真核生物的RNA聚合酶有三种，其中RNA聚合酶Ⅱ负责mRNA的合成，对应的转录因子为转录因子II，为反式作用因子。反式作用因子与启动子亲和力高，则表明此启动子有很高的转录起始效率。增强子是顺式正调控元件，对基因转录有极强的激活作用。当前第83页\共有98页\编于星期三\8点3.6.3克隆基因在转录后水平的调控真核生物的mRNA加工包括三个内容：5′端加帽、3′端加尾、RNA剪接。由于原核生物没有切除内含子的能力，因此当用原核生物表达真核基因时，应先从真核细胞中分离mRNA并反转录为cDNA，cDNA有完整的编码序列但无内含子，将cDNA与载体连接导入原核细胞中表达。当前第84页\共有98页\编于星期三\8点3.6.4克隆基因在翻译水平的表达与调控翻译是基因表达的最后一个阶段，翻译的效率会受翻译起始复合物的形成、mRNA的稳定性、密码子偏爱性、反义RNA、翻译起始因子的修饰等因素影响。当前第85页\共有98页\编于星期三\8点(1)原核生物在翻译起始的调控起始密码子AUGSD序列融合蛋白被认为是避免细菌蛋白酶破坏的最好选择在插入真核基因时，阅读框应与原核DNA片段的密码子阅读框一致，翻译时才不致产生阅读框改变的情况当前第86页\共有98页\编于星期三\8点（2）真核生物在翻译起始的调控mRNA5′端先与翻译起始因子中的CBP（capbindingprotein，帽子结合蛋白）结合然后eIF-4A和eIF-4B与之结合，为小亚基提供结合位点，形成40S-Met-tRNAiMet-eIF-3与eIF-4A和eIF-4B形成复合物接着此复合物从帽子结构开始沿着mRNA扫描，寻找起始密码子AUG。当前第87页\共有98页\编于星期三\8点作为起始密码子的AUG两侧翼序列有两个保守碱基，AUG上游3个碱基位必定是A，少数情况下是G，而下游4个碱基位必定是G。这段序列（NNPuNNAUGG）对翻译很重要，称为Kozak序列。当扫描时遇到了具有Kozak序列的AUG时，复合物在此处停留下来，60S大亚基结合，形成翻译起始复合物。当前第88页\共有98页\编于星期三\8点（3）反义RNA反义RNA是翻译水平上的一种新的调控方式。反义RNA是能与mRNA5′端互补的RNA分子。反义RNA分子以碱基互补配对方式与mRNA成为杂合分子，阻止了mRNA的翻译。当前第89页\共有98页\编于星期三\8点细菌铁蛋白的翻译就受反义RNA的调控细菌铁蛋白是用来储存细胞中过剩的铁离子。细胞中无论铁离子浓度高或浓度低时，细菌铁蛋白的编码基因bfr基因都以相同速率转录成mRNA，而anti-bfr基因的转录却受铁离子浓度的调控。铁离子浓度高时，anti-bfr基因的转录受到抑制，bfr基因翻译成细菌铁蛋白。当铁离子浓度低时，anti-bfr基因大量表达，与bfr基因的mRNA形成杂合双链，阻止了bfr基因的翻译。当前第90页\共有98页\编于星期三\