第一章基因工程学概论演示文稿

第一章基因工程学概论演示文稿当前第1页\共有161页\编于星期三\8点优选第一章基因工程学概论当前第2页\共有161页\编于星期三\8点第一章概论

一、基因工程概述基本概念发展历史相关理论的复习二、基因工程的基本过程与策略三、基因工程的发展与应用当前第3页\共有161页\编于星期三\8点一、基本概念基因工程载体和复制子DNA重组、转化当前第4页\共有161页\编于星期三\8点

基因工程(geneticengineering)：

在基因水平上，根据人们的需要以人工的方法取得特定基因，在体外重组于载体DNA分子上，然后将重组DNA转入受体细胞进行无性繁殖（称为“克隆”）和行使正常功能（称为“表达”），从而制备人类需要的基因、基因产物或创造出新的生物类型的分子生物学技术。当前第5页\共有161页\编于星期三\8点

复制子（Replicon）具有独立复制能力的DNA分子，或DNA分子中可从某一起点进行复制的部分称复制子。载体（Vector）：能容忍外源DNA片段插入，可在细胞间转移并在宿主细胞内自主复制的DNA分子。当前第6页\共有161页\编于星期三\8点转化(transformation)：

以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。

DNA重组（DNArecombination)：

不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组体DNA分子的过程。当前第7页\共有161页\编于星期三\8点基因工程发展历史基因工程三大理论基础基因工程三大技术发现当前第8页\共有161页\编于星期三\8点20世纪40年代：证明了遗传物质是DNA20世纪50年代：DNA双螺旋结构20世纪60年代：确定了遗传信息的传递方式基因工程理论基础当前第9页\共有161页\编于星期三\8点格里菲思肺炎双球菌的转化实验R（Rough）型菌：无荚膜，无毒性S（Smooth）型菌：有荚膜，有毒性当前第10页\共有161页\编于星期三\8点当前第11页\共有161页\编于星期三\8点R型细菌R型细菌只长R型菌只长R型菌R型细菌S型菌的DNAS型菌的蛋白质或荚膜多糖S型菌的DNA+DNA酶S型菌R型细菌艾弗里及同事的实验

当前第12页\共有161页\编于星期三\8点（含S）（含P）蛋白质

的组成元素：

DNA

的组成元素：C、H、O、N、（S）C、H、O、N、P(99%)

——用32p标记——用35S标记噬菌体当前第13页\共有161页\编于星期三\8点赫尔希和蔡斯得噬菌体侵染细菌实验离心离心当前第14页\共有161页\编于星期三\8点DNA的空间结构

沃森和克里克根据对DNA的X光衍射结果，以及对DNA分子不同碱基之间数量关系的分析，提出了DNA分子的双螺旋结构模型。从图上可辨认出DNA是由两条链交缠在一起的螺旋结构当前第15页\共有161页\编于星期三\8点面对DNA双螺旋模型的美国生物学家沃森(左)和英国生物物理学家克里克(右)。沃森、克里克发现生命的双螺旋而荣获1962年诺贝尔医学生理学奖。当前第16页\共有161页\编于星期三\8点遗传信息的传递方式转录DNARNA翻译蛋白质逆转录复制Non-codingRNAmicroRNA,lncRNA当前第17页\共有161页\编于星期三\8点基因工程学重大的技术发现1970年限制性核酸内切酶的分离和纯化（HindIII）1970年逆转录酶的发现1972年载体与重组技术

1972年Berg首次实现基因重组

1973年Cohen重组DNA转化

基因工程核心技术：DNA的重组技术

当前第18页\共有161页\编于星期三\8点相关理论的复习基因的概念和特性基因组DNA的结构与性能DNA的复制DNA的转录与调控当前第19页\共有161页\编于星期三\8点基因的概念和分子生物学定义遗传学概念：位于染色体上的基本遗传单位，携带遗传信息，控制遗传性状分子生物学定义：编码功能性蛋白质多肽链或RNA分子所必需的全部核酸序列，负载特定的遗传信息并在一定条件下表达遗传信息，指令或调控蛋白质合成。DNA双螺旋结构mRNA当前第20页\共有161页\编于星期三\8点当前第21页\共有161页\编于星期三\8点基因的功能分类结构基因（structuregene)：决定蛋白质/多肽链或酶分子的结构调控基因(regulatorygene)：调节控制结构基因表达功能当前第22页\共有161页\编于星期三\8点乳糖操纵子当前第23页\共有161页\编于星期三\8点基因的一般特性半保留自我复制决定生物表型或性状基因突变新的生物性状当前第24页\共有161页\编于星期三\8点基因组（genome）概念：细胞或生物体的全套遗传物质的总和常见基因组特点：病毒基因组原核生物基因组真核生物基因组人类基因组当前第25页\共有161页\编于星期三\8点1.病毒基因组基因组小，基因数少带有重叠基因大部分为编码蛋白质的结构基因当前第26页\共有161页\编于星期三\8点HBV基因组当前第27页\共有161页\编于星期三\8点2.

原核生物基因组基因组很小，大多只有一条染色体（细菌染色体）质粒（plasmid）：细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。可自主复制编码生物学形状基因工程常用载体结构简单，没有核膜存在转录单元多顺反子当前第28页\共有161页\编于星期三\8点

当前第29页\共有161页\编于星期三\8点

当前第30页\共有161页\编于星期三\8点细菌及质粒DNA的三种构型：超螺旋：共价闭环（CCC）开环：单链缺口（OC）线型：双链断裂（L）当前第31页\共有161页\编于星期三\8点真核生物基因组真核基因组结构庞大

3×109bp、染色质、核膜基因不连续性，大部分基因含有内含子(intron)非编码区域多于编码区域(9:1)，编码基因约2万个单顺反子含有大量重复序列当前第32页\共有161页\编于星期三\8点人类基因组细胞核基因组（nucleargenome)线粒体基因组(mitochondrialgenome)

当前第33页\共有161页\编于星期三\8点DNA的结构基本单位：核苷酸（A、T、C、G）双螺旋结构当前第34页\共有161页\编于星期三\8点DNA的性能吸收光谱高峰为260nm在电场中的迁移率与分子量大小、构象有关DNA变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂成单链的过程DNA复性：变性因素去除后，恢复成双链的过程当前第35页\共有161页\编于星期三\8点DNA的复制与表达半保留复制（semi-conservativereplication）基因表达（geneexpression）转录DNARNA翻译蛋白质逆转录复制当前第36页\共有161页\编于星期三\8点：解旋酶催化解旋模板（在DNA聚合酶的催化下，利用游离的脱氧核苷酸进行）复制：以母链为模板进行碱基配对母链（旧链）子链（新链）：组成复制后的DNA同时进行DNA的复制当前第37页\共有161页\编于星期三\8点复制子DNA中发生一次复制的单位称为复制子(replicon)。复制子是根据它含有复制所需的控制元件来定义的，在复制启动位点具起始点（origin)，在复制终止位点具终点（terminus)。起始点仅作用于所在复制子。注：在每个细胞周期中，每个复制子发生一次复制，且只发生一次。当前第38页\共有161页\编于星期三\8点质粒一般是一个自主环状的DNA基因组，构成一个独立复制子；原核生物基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；真核生物基因组含多个复制子（一般40-100kb/个）。不同生物复制子的数目当前第39页\共有161页\编于星期三\8点当前第40页\共有161页\编于星期三\8点基因的转录转录：遗传信息DNARNA模板链：反义链或（-）链，dsDNA分子中被转录成RNA转录本的链编码链：有义链或（+）链，以T代替U，与RNA转录本具有同样的序列转录酶：依赖于DNA的RNA聚合酶把转录起始点的碱基定为+1，5’端方向为“-”，3’端为“+”启动子与终止子当前第41页\共有161页\编于星期三\8点Template(-)StrandTranscribestomRNA3’5’5’3’RNAtemplatestrandnontemplatestrand(+)strand(-)strand5’3’codingstrandAUGCodonisdenotedonmRNAATGTACUAGTAGATCStartcodonIdenticalsequence当前第42页\共有161页\编于星期三\8点BothDNAStrandsCouldBeExpressed5’3’RNA3’5’DNA3’5’RNA5’3’DNARNAissynthesizedin5’→3’directionAdenovirusfullyutilizesitsgenomicsequencePromotermarkstheinitiationoftranscription当前第43页\共有161页\编于星期三\8点XNontemplateAntisenseRNAInhibitstheExpression-++AntisenseRNARNA/RNAHybridmRNATemplate-+-AntisenseGenePromoterRNAi当前第44页\共有161页\编于星期三\8点原核细胞中基因的表达调控主要包括2个过程：转录和翻译转录：遗传信息DNARNA

翻译：mRNA蛋白质真核细胞中基因的表达调控是多层次的，包含多个步骤。当前第45页\共有161页\编于星期三\8点原核生物基因表达特点仅一种RNA聚合酶，识别原核细胞启动子，催化所有RNA合成。原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA(nakedDNA)，其转录和翻译是偶联的连续进行。在翻译过程中形成多核糖体，每个核糖体独立完成一条肽链的合成。当前第46页\共有161页\编于星期三\8点原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。当前第47页\共有161页\编于星期三\8点一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。当前第48页\共有161页\编于星期三\8点操纵子（operon）：原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。是一组功能上相关，受同一调控区控制的若干基因组成的一个遗传单位。标准结构包括：调控区(调节基因，启动基因，操纵基因)，位于上游

结构基因：3-12个蛋白质编码基因转录终止子：位于下游共同协调作用，结构基因被转录成一个多顺反子mRNA，再翻译成各自的蛋白质。当前第49页\共有161页\编于星期三\8点乳糖操纵子结构Lac操纵子调控区有I基因、启动子（P）和操纵基因（O），LacI编码阻遏蛋白，结合于操纵基因（O）上，启动子（P）是转录起始时RNA酶的结合部位Lac操纵子有3个结构基因：Z基因、Y基因和A基因，分别编码beta-半乳糖苷酶、渗透酶和乙酰化酶，参与乳糖的代谢。Lac操纵子受分解代谢系统的正调控和阻遏蛋白的负调控当前第50页\共有161页\编于星期三\8点乳糖操纵子的表达调控I基因编码的阻遏蛋白与操纵基因（O）结合，阻断转录；诱导物与阻遏蛋白结合，操纵基因解除抑制，RNA聚合酶结合于启动子，基因转录；转录产物为同时含有Z基因、Y基因和A基因的多顺反子mRNA当前第51页\共有161页\编于星期三\8点启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。

一般长40-60bp，富含A-T碱基对共有保守序列：

-10区（pribnowbox，TATAbox）：位于转录起始点上游10bp处，TATAAT，与转录起始点的距离5-10bp，是给RNA聚合酶定向的序列，使RNA合成按5′3′方向进行

-35区：位于转录起始点上游35bp处，有TTGACA一组共有序列，RNA聚合酶的识别序列

当前第52页\共有161页\编于星期三\8点RNA聚合酶识别并结合启动子各种启动子启动转录能力不同启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列当前第53页\共有161页\编于星期三\8点-35区是RNA聚合酶对转录起始的辨认位点，辨认结合后，酶到达Pribnow盒，DNA双螺旋结构被打开，形成开放型启动子复合物，开始转录当前第54页\共有161页\编于星期三\8点终止子（terminator，T）:位于DNA链的3’端,给予RNA聚合酶转录终止信号的序列.特征：

富含G/C的区域和富含A/T区域相邻排列，具有回文对称结构，在RNA转录本上形成茎-环（stem-loop)结构。

不同的终止子的作用也有强弱之分。包括与蛋白质因子无关的转录终止信号和依赖于蛋白质因子的转录终止信号当前第55页\共有161页\编于星期三\8点富含GC的反向重复序列富含AT的序列

转录形成发夹式结构

茎-环结构比转录泡内的RNA-DNA杂合双链稳定，转录泡丧失，RNA聚合酶与模板DNA解离，转录终止当前第56页\共有161页\编于星期三\8点原核细胞与翻译有关的组分：——核糖体结合位点(ribosomebindingsite,RBS)（1）翻译起始密码子AUG（2）SD顺序（Shine-Dalgarno）：是细菌核糖体结合于mRNA和翻译起始所必需的核苷酸序列存在于大肠杆菌mRNA的前导序列区，AUG上游3-11bp长约3-9bp,富含嘌呤核苷酸5′…AGGAGG…3′与16s核糖体RNA3′-端碱基3′…UCCUCC…5′互补，将AUG安置于核糖体适当位置，启动翻译反应1974年澳大利亚的Shine和Dalgarno首先提出当前第57页\共有161页\编于星期三\8点真核生物基因表达调控的特点1、RNA聚合酶2、多层次3、个体发育复杂4、活性染色体结构变化：对核酸酶敏感、DNA拓扑结构变化、DNA碱基修饰变化、组蛋白变化5、正性调节占主导6、转录与翻译间隔进行7、转录后修饰、加工当前第58页\共有161页\编于星期三\8点真核基因表达的调控模式

(Theregulatingmodelof

eukaryoticgeneexpression)

1、转录前水平(基因组水平)：genelevel2、转录水平调控:transcriptionlevel3、转录后调控:post-transcriptionlevel4、翻译水平的调控:translationlevel5、翻译后修饰:post-translationmodification当前第59页\共有161页\编于星期三\8点1、转录前水平(基因组水平)：genelevel

染色质结构的变化、稳定持久，组蛋白修饰，DNA甲基化等表观遗传学（epigenetics）当前第60页\共有161页\编于星期三\8点2.转录水平调控顺式调控元件(cis-actingelement)

反式作用因子(trans-actingfactor)当前第61页\共有161页\编于星期三\8点（1）顺式调控元件(cis-actingelement)

结构基因周围能与特异转录因子结合而启动转录的DNA序列，主要包括：起正性调节作用：启动子、增强子起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号当前第62页\共有161页\编于星期三\8点

启动子位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定。一般包括核心启动子元件（corepromoterelements)

：指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的TATA-box上游启动子元件（upstreampromoterelements)

包括-70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的基础效率组织特异性元件诱导性启动子元件当前第63页\共有161页\编于星期三\8点真核启动子结构模式图核心启动子元件上游启动子元件当前第64页\共有161页\编于星期三\8点

哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件元件名称共同序列结合的蛋白因子名称分子量结合DNA长度TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp当前第65页\共有161页\编于星期三\8点

增强子(enhancer)是一种能够提高转录效率的顺式调控元件增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动子没有严格的专一性

无方向性（序列、位置）远距离作用（1-4kB）无基因特异性具组织特异性构建载体当前第66页\共有161页\编于星期三\8点沉寂子（silencer)或衰减子（attenuator)

是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式与增强子相同转录终止信号：

控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加尾信号（AATAA）和polyA下游的G/T簇构成

当前第67页\共有161页\编于星期三\8点（2）反式作用因子(trans-actingfactor)

由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。当前第68页\共有161页\编于星期三\8点PTrans-actingfactorTrans-actingfactor(DNA结合蛋白）Cis-actingfactorAgenemRNAofAProteinABgenemRNAofBProteinBDNA当前第69页\共有161页\编于星期三\8点3、转录后的修饰内含子的剪接外显子的拼接mRNA的加尾和加帽mRNA的稳定性当前第70页\共有161页\编于星期三\8点

4、翻译水平的调控主要是microRNA对mRNA、tRNA和rRNA的调控当前第71页\共有161页\编于星期三\8点5、翻译后的调控

切除信号肽糖基化乙酰化磷酸化甲基化蛋白质的降解当前第72页\共有161页\编于星期三\8点II.基因工程的基本过程及研究策略一、目的基因的制备二、载体DNA及其改造三、体外DNA重组四、重组DNA的转化五、重组体的筛选鉴定与克隆扩增六、目的DNA在受体细胞中的表达当前第73页\共有161页\编于星期三\8点基因工程过程示意图①从细胞中分离出DNA①②③④⑤⑥②限制酶截取DNA片断③质粒载体的选择④DNA重组⑤重组质粒转化大肠杆菌⑥培养大肠杆菌克隆大量基因/使其表达③③当前第74页\共有161页\编于星期三\8点一、目的基因的制备直接分离DNA鸟枪法克隆目的基因构建cDNA文库，筛选目的基因酶法或化学方法人工合成基因mRNA差异显示技术筛选差异表达基因差异蛋白质普表达技术筛选功能基因当前第75页\共有161页\编于星期三\8点适于遗传背景清楚的细菌染色体酶切电泳分离DNA

探针确定、回收特异性片段（探针：用同位素或其它非放射物质标记的一段特定的DNA或RNA片段）

1．直接分离DNA当前第76页\共有161页\编于星期三\8点2.鸟枪法克隆目的DNA适于DNA背景不清时将完整基因组（genome）的随机片段克隆入某种载体的方法。用于建立基因库或筛选特定基因

用限制酶切成许多片断当前第77页\共有161页\编于星期三\8点适于真核细胞染色体分离细胞mRNA

3.构建cDNA文库，筛选目的基因cDNA建立cDNA文库克隆扩增逆转录当前第78页\共有161页\编于星期三\8点4.人工合成DNADNA聚合酶链反应（PCR）

—DNA体外扩增技术

DNA化学合成仪DNA合成仪PCR扩增仪当前第79页\共有161页\编于星期三\8点二、载体DNA及其改造当前第80页\共有161页\编于星期三\8点

1.作为载体的条件：

具备控制自我复制的位点

有多种酶的单一酶切位点（多克隆位点）

存在易于检测的表型标志

分子量小，多拷贝

携带幅度宽

非自我转移（安全）当前第81页\共有161页\编于星期三\8点当前第82页\共有161页\编于星期三\8点2.常用载体

质粒（Plasmid）病毒载体（SV40,AdV)

噬菌体（λPhage）当前第83页\共有161页\编于星期三\8点３.质粒载体复制类型及特点（1）严紧型质粒（Stringentplasmid)

质粒的复制受宿主菌的严格控制拷贝数低（１～５copy/cell）具有自身传递能力（2）松弛型质粒（Relaxedplasmid）质粒复制与宿主细胞蛋白质的合成无关拷贝数高（10～200copy/cell）(加氯霉素可使拷贝数达1000倍)

小分子量，不能自动传递当前第84页\共有161页\编于星期三\8点4.载体的分类

克隆载体：克隆扩增，如pBR322

表达载体：复制、表达，如pcDNA3,pVAX---带有基因表达各种元件的载体,使携带的外源基因在宿主细胞中表达；

---真核表达载体和原核表达载体当前第85页\共有161页\编于星期三\8点原核表达载体：

适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。主要元件：强启动子

SD顺序筛选标志其它调控基因当前第86页\共有161页\编于星期三\8点融合型载体----pGEX系列Ptac：IPTG诱导GST融合蛋白—直接纯化产物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---Xa因子位相载体当前第87页\共有161页\编于星期三\8点真核表达载体：

适用于在真核细胞（哺乳动物细胞）中表达外源基因的载体。主要元件：1）强启动子2）增强子3）筛选标记：胸苷激酶(tk)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、新霉素抗性基因4）转录终止信号和多聚腺苷酸信号5）复制元件：6）原核细胞的部分序列当前第88页\共有161页\编于星期三\8点当前第89页\共有161页\编于星期三\8点三、体外DNA重组概念：

不同来源的DNA片段共价连接、通过重新组合构成了具有两个DNA分子遗传信息的新重组体DNA分子的过程。分类：粘末端连接同聚物核苷酸末端法平末端连接法人工接头连接T-A克隆当前第90页\共有161页\编于星期三\8点1.粘末端连接粘性末端（cohesiveendsorstickends）：dsDNA分子经酶切割后所产生的限制性片段的单股末端含3’或5’突出。同一酶切所形成的粘末端，互补碱基相互配对而结合。当前第91页\共有161页\编于星期三\8点

当前第92页\共有161页\编于星期三\8点

2.同聚物核苷酸末端法

DNA或RNA分子末端的一段同聚物核苷酸延伸。应用末端转移酶在DNA片段3′末端制备粘末端。避免自身环化互补序列较长时（>4bp)，不需连接酶当前第93页\共有161页\编于星期三\8点

当前第94页\共有161页\编于星期三\8点3.平末端连接：不含3’或5’突出优点：可连接任何一对DNA

可恢复一个酶切位点或产生一个新酶切位点缺点：连接率低要求连接酶及底物浓度高当前第95页\共有161页\编于星期三\8点4.T-A克隆当前第96页\共有161页\编于星期三\8点四、重组DNA的转化当前第97页\共有161页\编于星期三\8点1.基本概念转化（transformation）：把以质粒为载体构建的重组DNA，在一定条件下引入受体细胞的过程。转染（transfection）：以噬菌体或病毒构建的重组DNA引入受体细胞的过程。转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受体菌。当前第98页\共有161页\编于星期三\8点2.受体细胞及感受态感受态：细胞最易摄取和“容忍”外来DNA的生理状态。致敏：诱导细胞进入感受态的操作。感受态细胞的特点：

接受DNA的位点暴露；膜通透性增加；

修饰酶活性最高，限制酶活性最低受体细胞处于非增殖阶段当前第99页\共有161页\编于星期三\8点３．转化方法1）氯化钙转化法2）电转化法当前第100页\共有161页\编于星期三\8点4.转化规律载体分子愈小，转化率越高环状DNA分子较线型DNA分子转化率高1000倍新鲜制备的（对数生长的）幼嫩细胞转化易成功。当前第101页\共有161页\编于星期三\8点五、重组体筛选、鉴定与克隆扩增当前第102页\共有161页\编于星期三\8点平板筛选插入失活插入表达电泳筛选PCR筛选核酸杂交DNA测序免疫学检测法1.常用筛选/鉴定阳性重组体的方法初步筛选精确鉴定当前第103页\共有161页\编于星期三\8点1.平板筛选法（1）插入失活（insertionalinactivation)：在载体的基因编码序列中，当某个限制性内切酶作用位点上插入外源DNA后，其活性失去，不能表达相应的功能。常以此现象作为标记，筛选被这种重组体转化的细胞。当前第104页\共有161页\编于星期三\8点当前第105页\共有161页\编于星期三\8点当前第106页\共有161页\编于星期三\8点结果分析：1.

Amps

Tets

（转化失败）

2.

Ampr

Tetr

（转化成功，但无重组）

3.Ampr

Tets

（重组、转化均成功）当前第107页\共有161页\编于星期三\8点H2NCOOH-galactosidaseOntheplasmidOnthechromosome(DH5α,TOP10)蓝白斑选择：LacZ当前第108页\共有161页\编于星期三\8点E.coliengineeredforBlue/WhiteScreening(DH5α,TOP10)chromosome-gal-galMCSNonfunctionalNonfunctional-Complementation当前第109页\共有161页\编于星期三\8点当前第110页\共有161页\编于星期三\8点当前第111页\共有161页\编于星期三\8点IPTG+beta-gal当前第112页\共有161页\编于星期三\8点当前第113页\共有161页\编于星期三\8点（2）插入表达（insertionalexpression)

载体设计时，筛选标志基因前连接一段负控制序列（抑制），当目的DNA插入该点使其抑制作用失活时，其下游筛选标志才能表达。当前第114页\共有161页\编于星期三\8点CI为负控制序列（抑制Ter表达），DNA插入CI失活,Tet表达。当前第115页\共有161页\编于星期三\8点2.电泳法筛选分离转化菌质粒，酶切电泳，根据DNA分子大小不同，鉴别真正重组体DNA，排除假阳性（如载体自我连接载体双重体）该法不能鉴别插入片段大小相似的非目的基因片段的假阳性。

当前第116页\共有161页\编于星期三\8点

联合酶切鉴定同源末端连接重组子中

DNA插入片段的方向当前第117页\共有161页\编于星期三\8点3.菌落原位杂交（HybridizationinSitu）鉴别阳性重组体时，用与目的DNA互补的探针测定阳性菌落。处理转化菌，使DNA从由内释放，以探针测定。当前第118页\共有161页\编于星期三\8点菌落原位杂交法筛选复印至硝酸纤维素膜上用NaOH菌体裂解DNA变性杂交放射自显影32P-cDNA与放射性cDNA杂交的菌落的斑点细菌菌落单链DNA结合到膜上当前第119页\共有161页\编于星期三\8点4.免疫学检测法依据抗原、抗体特异性结合反应的原理，以单克隆抗体对表达产物进行特异性检测。当前第120页\共有161页\编于星期三\8点当前第121页\共有161页\编于星期三\8点

经上述方法筛选、鉴定的阳性重组子菌落克隆扩增表达功能性蛋白产物获得大量拷贝的DNA片段制备探针等当前第122页\共有161页\编于星期三\8点六、目的DNA在受体细胞中的表达当前第123页\共有161页\编于星期三\8点

基因工程表达系统大肠杆菌系统枯草杆菌系统酵母细胞系统昆虫细胞系统哺乳动物细胞系统原核表达系统真核表达系统当前第124页\共有161页\编于星期三\8点Ⅲ基因工程的发展及应用

当前第125页\共有161页\编于星期三\8点分离了第一个RE(HindⅢ)1972EcoRⅠ酶切SV40DNA与λDNA后重组首次实现体外重组1973年首次完成了克隆转化（重组质粒转入E.coli）

1973年—1977人工测序1978：生产了第一个GE产品1980：建立了第一个GE生产工厂1985：PCR技术问世1989NIH计划、出台人类基因组计划2000.6：人类基因组草图一、基因工程进展

当前第126页\共有161页\编于星期三\8点二、基因工程应用基因工程疫苗与DNA疫苗、嵌合抗体基因治疗基因工程药物研究基因功能当前第127页\共有161页\编于星期三\8点基因工程疫苗与DNA疫苗

。基因工程疫苗（GeneticEngineeringVaccine，GEV）

以基因重组技术表达的重组蛋白作为疫苗。DNA疫苗/核酸疫苗（Nucleicacidvaccine，NAV）

直接导入带有目的DNA的表达载体

重组病毒载体疫苗（recombinantviralvectorvaccine，RVVV）

当前第128页\共有161页\编于星期三\8点

Human-mousechimericAb当前第129页\共有161页\编于星期三\8点基因治疗已进入理性化的正常轨道三个关键问题：

高效的、靶向性基因导入系统，外源基因表达的可控性筛选有治疗价值的基因当前第130页\共有161页\编于星期三\8点基因工程药物基因重组药物植物基因工程药物动物基因工程药物当前第131页\共有161页\编于星期三\8点胰岛素原的人工合成

胰脏(A)n胰岛素原mRNAcDNA重组质粒转化细菌mRNA反转录酶胰岛素原基因与质粒连接感染E.coli胰岛素原当前第132页\共有161页\编于星期三\8点研究基因功能基因的表达调控基因产物的相互作用基因产物的定位基因产物的功能当前第133页\共有161页\编于星期三\8点举例：1、研究基因的表达调控当前第134页\共有161页\编于星期三\8点Inflammasome当前第135页\共有161页\编于星期三\8点克隆NLRP3启动子并做截断突变体当前第136页\共有161页\编于星期三\8点当前第137页\共有161页\编于星期三\8点举例：2、研究基因的功能当前第138页\共有161页\编于星期三\8点1MQIFVKTLTGKTITLEVEPS21DTIENVKAKIQDKEGIPPDQ

41QRLIFAGKQLEDGRTLSDYN61IQKESTLHLVLRLRGGUbiquitin当前第139页\共有161页\编于星期三\8点当前第140页\共有161页\编于星期三\8点Theubiquitination-proteasomedegradationpathway当前第141页\共有161页\编于星期三\8点原核表达载体当前第142页\共有161页\编于星期三\8点当前第143页\共有161页\编于星期三\8点表达载体构建当前第144页\共有161页\编于星期三\8点表达载体酶切鉴定当前第145页\共有161页\编于星期三\8点序列测定当前第146页\共有161页\编于星期三\8点原核细胞表达当前第147页\共有161页\编于星期三\8点体外泛素化及WB检测当前第148页\共有161页\编于星期三\8点举例：3、蛋白质在细胞中的定位发光基因（GFP，RFP