第九章 植物组织培养技术及其在育种中的应用

第九章植物组织培养技术

及其在育种中的应用植物组织培养技术是现代植物生物技术的基本技术。一、现代生物技术及其基本概念（一）生物技术概念生物技术（Biotechnology)，有时也称生物工程（Bioengineering）,是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已成功地应用于植物育种中。（二）生物技术的种类基因工程（GeneEngineering）细胞工程（CellEngineering）酶工程（EnzymeEngineering）发酵工程（FermentationEngineering）蛋白质工程（ProteinEngineering）（三）细胞工程

细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。（四）克隆概念分离基因的技术；扩增基因的技术；将单一细胞扩增成细胞群体的技术；将一个生命体复制成一个与之完全相同的新个体的过程；将单一个体扩增成一个遗传上完全相同的群体。一个遗传上来源完全相同的生物群体。二、植物组织培养的基本步骤1、植物细胞的全能性（CellTotipotency）一个植物细胞能产生一个完整植株的固有能力称之为细胞的全能性。2、植物离体分化的类型无菌短枝型丛生芽增殖型器官发生型胚状体发生型原球茎发生型3、植物组织培养的特点培育材料经济；培养条件可人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。5、植物组织培养的基本操作无菌操作技术细胞培养技术原生质体融合技术接种用具的灭菌

接种前，必须把用具放入接种室或箱内，初用接种室或箱时要用甲醛（一般市售分析纯的有效成份为36-38%熏蒸5小时以上再开紫外光灯照射40-60分钟，以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入接种室（箱）内，用5%的煤酚瓶皂溶液即来苏尔（一般市售的有效成份为47-53%）或5%的石灰炭酸液喷雾消毒，再打开紫外光灯照20-40分钟，这样消毒后，再经30-40分钟便可进行接种。接种材料的表面灭菌

接种前花蕾或穗的彻底灭菌是杜绝污染的主要关键，先用70-75%的酒精浸泡10-15秒钟或用酒精棉球擦两遍，初步杀死表面所带的微生物，放在10%的漂白粉液或饱和漂白粉液中浸泡15-30分钟杀菌，然后用无菌水冲洗2-3次。消毒过的穗子或花蕾用消毒纱布包好，待取花药接种，注意，穗子或花蕾的操作要在无菌条件下进行。5、植物组织培养所需营养与环境条件（1）无机营养大量元素：一般是指浓度大于0.5mmol/L.氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、硫(S)。微量元素：

包括铁(Fe)

、铜(Cu)

、钼(Mo)

、锌(Zn)

、钠(Na)

、锰(Mn)

、钴(Co)

、硼(B)

、碘(I)。（2）有机营养维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。（3）生长调节物生长素：2，4-D、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸(IAA)。细胞分裂素：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6BA）、玉米素（ZT）。赤霉素（GA）

：脱落酸（ABA）、乙烯利（CEDP）。（4）琼脂（5）能源和渗透压（6）其他成分（7）温度（8）光照（光强、光质）培养基的配制：培养基母液的配制；配制培养基的步骤；培养基的分装及灭菌。6、植物组织培养经历的五个阶段：（1）预备阶段外植体的获得；接种材料的消毒处理；配制适宜的培养基；（2）诱导去分化阶段（3）继代增殖阶段（4）生根成芽阶段（5）移栽成活阶段三、植物组织培养技术在育种中的应用种质资源保护；优良品种快速繁殖；诱发和离体筛选突变体；克服远缘杂交困难；克服种子发育中的障碍；单倍体育种的技术环节基因工程的基础技术（一）单倍体育种单倍体的概念及其特点只含有一套染色体组的生物体；被子植物的配子体世代。矮小性；不育性；全显性。2.单倍承体植坡物在当育种鲜上的盖意义单倍益体植刷物的朵直接迫利用般；克服奋杂种见分离仆，缩挑短育父种年仆限；快速叼获得继异花渣授粉叮植物坚的自文交系宝；单倍爸体植吹物的砌诱变怪育种粘；克服偿远缘摘杂种恭不孕外性与令不稳调定的掀现象伍；3.单倍拆体植顷株和偷愈伤侵组织艘的培澡养（1）单务倍体屠材料案的采铸集单倍及体育瓶种的只首要证问题壤是如烦何获洪得大全最的凝单倍搜体植雄株。区据现芳有的踏研究充材料昏，用不花药见培养惊产生修单倍降体植搁株有穴两个填途径:第一行是在亏离体雷培养古的花锈药中饺，花斑粉经古过类乱似胚伍胎发樱育的芳过程膝直接盯形成辈单倍紫体植悬物，荒如烟零草、恐曼陀锋罗等蜂。第二泻是在删离体沃培养离的花刃药中保，花查粉形陪成愈瓦伤组恶织，赏再从耳愈伤忙组织松分化伐出单不倍体朴植株士。（2）花言药的社接种接种搏前的徐准备冬工作接种士和培垂养花掉药是仁在无园菌条您件下麦进行步的，紫所用午的一拆切用两具必谣须彻虑底灭贩菌。花粉傻发育烤时期肺的鉴妖定适宜编的花狭粉发樱育时锁期对苦于提消高花剥粉诱暖导愈幼伤组杰织分言化的柿频率直是很掀重要演的，先为此布，进晓行花畏药培匆养前才，要巷用显妥微镜巧进行犁花粉养发育孙时期较的鉴花定。经显婶微镜摆检查席后，痕把花男粉细片胞的品发育爸进期埋与花信药或票花序抽的外荒部形穗态联施系起骆来，培找出坐花粉舰单核扣期或思单核罪期的始花蕾幻玉或花浇序的痕外部窑形态恢标志病选取葵花药胁进行医接种条培养基。（3）从伶愈伤这组织取分化硬成苗诱导或愈伤倡组织慰分化飞出根腐、茎芒、叶爷的方规法是纽奉在愈矿伤组库织长菊到1-适3毫米忠大小喜（如吊小米底大）略时，快即可酷转移巾到诱喉导分征化培论养基欺上，殃促使掏分化华长出倚植株喷。一羽般说女来，毅愈伤谢组织杏如果蹲先形阔成芽离，随抓后根恒自然街会发哲生，摘如果荷先有首根，章以后弯不一灭定会颜出芽牢。因凶此，胞掌握仍芽分茫化的趋条件竭是十拳分重摘要的蛇。愈伤济组织响转移达培养释工作傲是在抢无菌崇室或持接种望箱内善进行始的，券转移脾后愈绳伤组鸡织培钻养在23晕-2烂8℃恒温残室内钉，每壁日光渔照9-易11小时庸，可统用日捞光灯奋作辅帐助光河，光亡强度桑在20连00勒克摧斯以闪上。在转币移愈猫伤组皇织时覆，应条注意腥其极萍性，罗原来发向上拌的一蓬但转速移后渴的一团但转贷移后甜仍应浸向上她，否友则会冻影响慨生长斑，同顾时在裤转移茂时，川就避浅免沾演带过斥多的着培养末基。4.染色摩体加堡倍处理厚方式供：试管弟内进贤行；花粉援植株竹定植知后进宰行；药剂阻处理牧；植株方鉴定剥。单倍康体育吸种程程序：材料揪采集却接种魔培养裂泰诱大导愈稳伤组龙织落获航得再抹生植葵株限莲染色课体加今倍禾狱幼苗遮培育铁和品机种选搂择（二窗）原回生质泄体培前养与霞体细庙胞杂阳交常规放杂交革育种谱由于庆物种则间难哑以逾芹越的恢天然锣屏障绵而举膨步维播艰。蹦科同学家旅们受伏细胞矩全能丝式性理只论及天组织服培养偏成功酷的启牲示，界逐渐艇将眼偿光转户向细给胞融誓合，次试图爬通过钟这种对崭新巾的手且段冲斤破自均然界今的禁耽锢。原生茂质体垦的概唇念植物迹细胞稻原生徐质体文是指们那些吃以去枪除全亭部细匪胞壁先的细视胞。陕此程时，勿细胞沉外仅闪由细散胞膜纳包裹沿，锐呈圆也形只美有在宿高渗国溶液理中才脊能相索对稳算定。原生室质体斩经适桃当处脊理，栽可与里其他山细胞男融合叨成新答的体藏细胞泉。2.原生盈质体邀的特护点比完毛整的竹细胞宋更容崇易获盼得外抗来遗计传物海质，缺为实座现异拘源遗村传物葡质转全化提犯供了译较好劳的实狸验材促料。原生招质体偏在一慕定条楚件下雕可以杰融合呢成杂楚种细铅胞，吃开辟恶了一堂条新钢的育评种途岩径。3.发展签概况18相92，J.肆A营.昏Kl傲er鹊ke值r用机盆械法用获得被原生显质体攻；19惧60，E.打C.久C捏oc汪ki顶ng用酶递法首灿先从变番茄吸根尖睁中分吴离出骑大量塌有活腿性的户原生灭质体烧并通潜过培旋养再碎生出宜细胞杜壁形婆成再矩生植捧株;19畜60，G.菜B主ar嘉sk照i发现,题细数胞原抽生质你体能坊融合里在一盘起形千成单睛核的捆、并丽能进独行分由裂的说杂种瞧细胞锁；19耗72，P.狮S.坚Ca损rl定on首次窄获得歌烟草颜体细恳胞种薪间杂呜种。80末’s此项薄技术廊在我栋国得睛到发班展。4.原生僵质体戴的制必备（1）取南材与晌灭菌（2）酶牢解(纤维腔素酶拆、半退纤维北素酶还、果放胶酶)（3）分忽离膜（沉砍淀法呀、漂甚洗法折、滴择洗法殊）（4）洗雹涤（5）鉴冻定（蔽形态名观测管、活颠性鉴苍定）原生捧质体我的培也养：细胞医壁再羽生；细胞称分裂陆；植株潮再生凉。5.原生姥质体量的融理合化学迈法诱则导融剂合按比震例混挪合双倒亲原唉生质丘体-滴加PE炊G-滴加裂高钙乖高PH值溶差液-洗涤潜原生涉质体双溶液-离心坊获得通原生位质体须溶液-筛选处杂种农细胞-再生恢杂种露细胞灯。物理阿法诱挨导融可合＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－基本扇程序肿：原生誓质体阁的获攀得；电击剩融合俊；筛选侵杂种守细胞舌；杂种朵细胞妻再生幼和完特整植休株的你形成近。6.融合考细胞模的培皂养鉴侨定与荷筛选杂和路细胞榨的显款微镜捎鉴别腰；互补添法鉴驴定杂肚和细聪胞；细胞味与分垄子生例物学且法；植株梢形态辜的鉴铁别。（三捎）人警工种慎子人工系种子虫即人喊为制跃造的将种子透，它阳是一负种含株有植姿物胚腿状体皂或芽脂、营彻养成沸分、隐激素都、及拳其他遍成分柔的人先工胶今囊。锤其具肚有种墨子的似功能肤，可叮直接谢用于兰田间托播种崇。1、人工杀种子叶的构鸽成人工碌种皮胚棍状贡体人工导胚乳2、人工车种子刮的特热点：（1）可惧以不泥受环侧境条并件的后限制历，周趟年进串行生暮产；（2）经鼠人工腔无性鲁繁殖没产生意，有巨利于裂保存月该种法系滥的优班良性蜓状；（3）成捉本低驳，适促于田躲间机笑械化垒生产唇；（4）可盛根据寺需要裕调节岁胚乳梯成分迎。3、人工桑种子粉的制柱备（1）胚自状体址的制抢备及惕其同偏步生伯长；（2）人勤工胚怖乳的茅制备缓；（3）配直制包洗埋剂娃及人挣工包推埋。人工坏种子非包埋缘瑞示意逝图4%海藻轿酸钠体细庸胞胚包埋爬丸2%准C徐aC租l人工甲种子水4、人旋工种恨子的矩贮存恢与萌倍发低温桃、干泛燥、馒洁净性。（四仅）基追因工克程（一邀）基括因工心程的鼓含义按照签人们协的愿霜望，偿进携行严丹密的膝设计军，箭通远过体束外DN慢A重组吵技术和DN岂A转移暑技术恢，有馒目的椅地改馋造生挡物种睁性，航使艺现有行物种鬼在短巴时间吧内趣赌于完清善，幸创吵造出输新的谋生物忌类型胁。致癌役农杆呈菌介若导的Ti