640040叶绿素荧光使用手册

6400-40叶绿素荧光叶室简易使用手册（基因有限企业农业环境科学部，北京）本手册是在总结了美国LI-COR企业6400-40使用手册基础上，简明扼要地阐述了荧光叶室使用方法，仅供参考。限于作者理论水平和应用经验，本文还存在许多不足之处，详细使用请参见厂家原版英文说明书，本人及本企业不负担由本手册引发任何责任。另外需要提醒您是，请在使用本仪器和阅读本手册之前阅读我们为您准备叶绿素荧光测量技术背景知识综述，这对您最终了解我们仪器使用和准备试验设计来说是必须。1.序言：植物叶片所吸收光能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。三个过程之间存在竞争，任一效率增加都将造成另外两个产量下降。所以，测量叶绿素荧光产量，我们能够取得光化学过程与热耗散效率改变信息。需要注意是，这种测量永远是相正确，因为光线不可防止会有损失。所以，全部分析必须把数据进行标准化处理，包含其深入计算许多参数也是如此。调制荧光仪出现是荧光研究技术创新。在这类仪器中，测量光源是调制（高频率开关），其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发荧光。所以，相正确荧光产量能够在背景光线（主要是指野外全光照条件下）存在条件下进行测量。现在绝大多数荧光仪采取了调制系统，同时也强烈提议您选择调制荧光仪。叶绿素荧光能够说明光系统II利用叶绿素吸收能量程度和过量光线破坏程度。光系统II电子流动能够表现总体光合速率特征。它提供我们在其余方法无法实现情况下，快速估量植物光合能力潜在能力。光系统II也被认为是光合机构中对光诱导破坏反应最为灵敏和最为脆弱组分，光系统II破坏是植物叶片胁迫最早表现。当然，荧光技术本身也不是没有局限，荧光最强有力应用不是单独使用这一技术本身，而是结合其余技术，尤其是气体交换从而取得植物对环境响应完整解释。6400-40就是在这一应用需求背景下推出，是现在唯一能够同时同时测量叶绿素荧光与气体交换仪器。2.仪器硬件组成与功效6400-40全部硬件组分是在6400光合仪基础上填加设备。全部6400-40放置在标识为6400-40FluorescenceChamber纸箱内。主要包含以下组分：荧光叶室上部：全部光源与检测器在此部分。包含活化光光源、闪光、远红外光和检测光及其检测器和光强检测器。荧光叶室下部：叶温热电偶：测量阔叶叶片温度。LCF连接线：用于连接叶室和主机辅助线。3.仪器连接（英文手册中有图示说明，请参考之）在该过程中，应该关闭LI-6400或使LI-6400处于休眠状态。3.1在bundle中安装cable有两种方法，一个是利用LCF配件包中velcroties将LCF电缆和LI-6400电缆捆绑在一起。假如将长久利用LCF，最好将LCFcable插入到bundle中。后一个花费时间较长。但当长久应用LCF时非常有意义。3.2去除IRGA分析器头部上部和下部叶室利用LI-6400和LCF工具包中3/32六角扳手将固定上部和下部叶室长螺丝拆除。不再连接叶室上部和叶室下部叶片温度探头（图27-6）。3.3连接LCF叶室下面部分叶室底部3个O形圈一定要放置好，而且将其连接到IRGA分析器头部，接着安装叶片温度探头。3.4连接LCF上面部分确认O形圈放置在应有位置，而且连接LCF主体部分。3.5连接cables在IRGA分析器头部插入小4针连接器，而且将15针LCF连接器与它cable相连接，将这个cable另一端37针连接器插入到LI-6400操作平台上辅助接口上。3.6光合仪其余组分连接不变4.手动测量包含荧光基本测量参数测量，共有三种试验测量方法。4.1光化学效率测量Fv/Fm研究意义：Fv/Fm对于大多数植物而言，LI-COR认为，改变范围在0.75-0.85之间，有研究认为实际生长正常植物大致在0.83左右。假如我们测量得到数值不在此正常范围，则首先我们应该确认我们设置是否正确（常规设置我们接下来将介绍），暗适应是否不足。假如设置和处理正确，那么我们就能够结合其余数据，如气体交换得到光合、蒸腾等指标来研究此植物是否处于某种环境条件胁迫或某特定生长久（如作物坚固之后枯黄阶段等）。也就是说，本测量值假如不在正常范围，那么我们能够说此植物叶片不处于其正常生长情况，不过原因还需深入试验来探究。试验准备：此试验关键之处于于Fo点准确测量，这需要植物叶片完全暗适应。通常而言，20分钟左右遮光处理（传统方法通常采取锡纸来包裹植物叶片）是足够，不过最好情况是二十四小时暗适应或一个晚上，在凌晨破晓前测量（在试验室内条件轻易控制，而在野外不是很方便）。现在通常采取暗适应夹子来处理，不过通常荧光仪暗适应夹子因为是光纤测量，遮光面积太小，而常识告诉我们，小面积遮光对于整个植物叶片而言是不足，LI-COR暗适应夹子（请单独购置，200美元一套。每套10个）大到足以覆盖整个叶片（即使在测量时，非测量部位也是遮光），这一点是其优点。测量过程：硬件连接好后开机，选择“Defaultfluorometer”叶室配置文件，回车开启系统。把叶片夹入叶室，关闭。其余设置如光合测量一样，比如过滤管打到完全“Bypass”。荧光参数设置：进入测量菜单，按“F1”来其文件名。按数字8，进入第8行菜单。按F2进入FlrEditor菜单界面。设置以下表：MearsurementsIntensity强度设定1Modulation调制频率设定0.25KHzFilter信号平均频率1Gain放大倍数10FalshDuration闪光连续时间0.8秒Intensity强度设定7，相当于6000umol/s-1m-2左右BlueNochangeModulation调制频率设定20KHzFilter信号平均频率50KHzDark（此设置在本试验中无用，但为以后试验设置方便起见，一并设好）Duration远红外光连续时间6秒FarRedIntensity强度设定8（相当于6-7umol/s-1m-2左右）FarRedPreTime1秒FarRedPostTime1秒Modulation调制频率设定0.25KHzFilter信号平均频率1Hz以上设置好后，按F5，OK后弹出对话框“StoreChanges”，按Y后存成自己起固定设置文件名，如“LI-set001”后回车即可，以后不用再设置，只需要在第8行菜单中按F1“FlrPik”选择这一文件名后回车即可。按字母“M”，把M行变量显示在屏幕上，等候变量dF/dT稳定后（小于±5以内即可）。按数字0把菜单翻到0行，按F3“DoFoFm”来测量，按字母“N”来显示“Fo”“Fm”“Fv/Fm”实际测量值，这时测量已经结束，数据已自动统计到您起文件名中，关闭文件。接下来是重复测量和处理问题了（因为数据在不一样叶片不一样植株之间存在一定差异，个别情况差异可能很大，这是自然现象，不是因为机器测量造成，重复是必须）。通常而言，一个处理按统计学严格需要30-50次重复。当然这是常规情况，同时需要考虑您样品多少和处理多少以及测量花费时间，不过有一点能够必定是，重复多数据代表性好，更有说服力。数据处理：全部测量数据要经过方差分析来确定处理内差异和处理间差异，以比较说明不一样处理之间差异是否显著（请参考生物统计学相关知识）。问题：胁迫增加还是降低了Fv/Fm？PSⅡ对环境胁迫如温度、干旱和辐射等非常敏感。胁迫将引发Fv/Fm降低。影响荧光测量结果原因主要包含叶龄、叶片健康情况和环境因子条件等。4.2研究PSⅡ效率研究意义：PhiPS2（也称为△F/Fm¹）指PSⅡ所吸收光量子中用于光化学反应百分比，经过对光适应叶片（某一光照条件下完全适应叶片）测量而得到。在低光照条件下，PSⅡ量子产量通常较高，因为叶片所吸收光能中有较大百分比被用于光化学反应中；而在高光照强度条件下，因为叶片所吸收能量中很大百分比经过非光化学过程而散失，所以经过高光照强度光适应叶片△F/Fm¹较低。此数值也可深入计算出电子传递速率（ETR），这一数值与植物光合速率有很强线性关系，是又一个表征植物光合作用能力高低变量。本试验通惯用来研究植物在不一样光强下光能利用能力。试验准备：已经光照活化植物样品。在自然光条件下（放入叶室后，需要把活化光强度设置成与外界条件相同），测量不一样植物种类样品，来比较其差异。假如我们想控制和改变光线条件，需要采取能够控制光强卤素灯来照射植物样品。在野外条件不具备情况下，能够采取6400-40活化光来照射，不过需要时间比较长，这取决于植物情况（20-60分钟都是有可能）。测量过程：硬件连接好后开机，选择“Defaultfluorometer”叶室配置文件，回车开启系统。把叶片夹入叶室，关闭。按数字2来进入第2行子菜单，按“F5”来设置光强和外界实际光强一致或您想要模拟光强值。其余设置如光合测量一样，比如过滤管全打到完全“Bypass”。荧光参数设置：进入测量菜单，按“F1”来起文件名。按数字8，进入第8行菜单。按F2进入FlrEditor菜单界面。设置以下表（只有三项有所改变）：MearsurementsIntensity强度设定5Modulation调制频率设定20KHzFilter信号平均频率1Gain放大倍数10FalshDuration闪光连续时间0.8秒Intensity强度设定8BlueNochangeModulation调制频率设定20KHzFilter信号平均频率50KHz以上设置好后，按F5，OK后弹出对话框“StoreChanges”，按Y后存成自己起固定设置文件名，如“LI-set002”后回车即可，以后不用再设置，只需要在LEVEL8中按F1“FlrPik”选择这一文件名后回车即可。按字母“M”，把M行变量显示在屏幕上，等候变量dF/dT稳定后（小于±5以内即可，对于设置光强与外界条件不一致情况需要很长时间）。按数字0把菜单翻到0行，按F3“DoFsFm’”来测量，按字母“P”来显示“PhiPS2”和“ETR”实际测量值，这时测量已经结束，数据已自动统计到您起文件名中，关闭文件。接下来是重复测量和处理问题了（因为数据在不一样叶片不一样植株之间存在一定差异，个别情况差异可能很大，这是自然现象，不是因为机器测量造成，重复是必须）。通常而言，一个处理按统计学严格需要30-50次重复。当然这是常规情况，同时需要考虑您样品多少和处理多少以及测量花费时间，不过有一点能够必定是，重复多数据代表性好，更有说服力。数据处理：全部测量数据要经过方差分析来确定处理内差异和处理间差异，以比较说明不一样处理之间差异是否显著（请参考生物统计学相关知识）。4.3淬灭测量研究意义：当叶片从黑暗条件转入光下，PSII（光系统2）反应中心逐步关闭，这造成了叶绿素荧光产量（1秒钟之内）上升，在此之后，荧光产量开始下降，连续大约几分钟或几十分钟，这种现象，被称为荧光淬灭。首先，电子被从PSII传递走速率开始上升，这是因为光诱导对C代谢酶活化和气孔开放活化，这种淬灭被称为光化学淬灭。同时，能量转化为热能效率也提升了，这种过程被称为“非光化学淬灭”（NPQ）。经典植物中，这两个过程改变将在15-20分钟内完成并达成稳定状态。当然这个活化时间在不一样植物种类之间差异显著。本试验我们测定指标包含：“Fv’/Fm’”（光照条件下开放PSⅡ反应中心能量捕捉效率）、“qP”（光化学淬灭，因为光化学作用造成光系统II效率下降百分比）、“qN”（非光化淬灭，因为热耗散造成光系统II效率下降百分比）、“NPQ”（非光化学淬灭，同于qN，现在大多数研究采取这一指标，因为其比qN更灵敏）。试验准备：暗适应植物叶片同4.1，因为我们需要测量基本参数：Fo、Fm、Fv/Fm、Fs、Fm’、Fo’、Fv’/Fm’等。测量完Fo、Fm和Fv/Fm后，需要打开活化光对同一叶片进行光活化，再测量Fs、Fm’、Fo’、Fv’/Fm’。6400将深入完成qP、qN和NPQ计算。不过缺点是活化需要较长时间。假如我们测量样品很多，这一过程需要我们花费大量时间。处理方法是对我们需要测量样品（全部做标识）一起暗适应后测量Fo、Fm和Fv/Fm后，统计其值（用笔记本或其余方式）。把全部叶片放在自然光或卤素灯下活化后，再逐一测量其Fs、Fm’、Fo’、Fv’/Fm’值并做统计，再依照我们提供背景知识材料中提供公式来深入计算qP、qN、NPQ（此处为作者自己了解，请慎重参考）。图1淬灭参数测量过程（上图非6400真实显示，仅为示意图）测量过程：硬件连接好后开机，选择“Defaultfluorometer”叶室配置文件，回车开启系统。把叶片夹入叶室，关闭。其余设置如光合测量一样，比如过滤管全打到完全“Bypass”。荧光参数设置：进入测量菜单，按“F1”来其文件名。按数字8，进入第8行菜单。按F2进入FlrEditor菜单界面。设置如4.1。或直接按F1调用已经保留好配置文件“LI-set001”。按字母“M”，把M行变量显示在屏幕上，等候变量dF/dT稳定后（小于±5以内即可）。按数字0把菜单翻到0行，按F3“DoFoFm”来测量，按字母“N”来显示“Fo”“Fm”“Fv/Fm”实际测量值。按数字“2”，按‘F5’选择“PQuantum”把活化光设置为您期望研究光强水平或现在外界实际光强进行活化。等候M行中dF/dT显示稳定后（20分钟以上，小于±5），按数字“0”按“F4”-“DoFsFm’Fo’”来测量。这时能够按字母“P”来查看“qP”、“qN”（数值范围在0-1之间，0最小，1最大）值了。这里我们可能看不到“NPQ”，因为我们默认显示器可能没有设置它，能够按数字6来进入屏幕编辑器菜单。按“F4”后按“F2”移动上下箭头键来寻找“NPQ”并选中它后按回车。按“OK”后弹出对话框“StoreChanges”，按字母“Y”来保留，跳出文件名对话框，继续按回车键。按字母“U”，这时我们能够看到“NPQ”了。当然，不论显示有没有，NPQ在我们保留数据文件中都是有。接下来是重复测量和处理问题了（因为数据在不一样叶片不一样植株之间存在一定差异，个别情况差异可能很大，这是自然现象，不是因为机器测量造成，重复是必须）。通常而言，一个处理按统计学严格需要30-50次重复。当然这是常规情况，同时需要考虑您样品多少和处理多少以及测量花费时间，不过有一点能够必定是，重复多数据代表性好，更有说服力。数据处理：全部测量数据要经过方差分析来确定处理内差异和处理间差异，以比较说明不一样处理之间差异是否显著（请参考生物统计学相关知识）。5.自动测量以上介绍手动测量尽管意义重大。不过实际上，我们研究最需要是全过程测量，而非某一点测量，这两种工作意义差异不言自明。不过问题是连续测量花费时间往往很长，通常在30-60分钟左右。其中有很多时间仅仅是无意义等候。所以，为更有效地管理时间，我们能够采取自动测量方式。试验准备：需要准备摄影机用三脚架（6400备件箱中有三脚架接口，能够把分析仪和叶室架在三脚架上，因为手持时间太长是无法忍受）。把主机野外支架架起来。电池状态请确定保持良好（不然中途断电将使测量终止）。进气管连接好缓冲瓶并系在一牢靠固定竹竿上，确认人呼吸干扰不引发大误差。仪器校准调零。CO2钢瓶安放并进行注入系统校准。确认H2O过滤管打到全旁路状态（Bypass）和CO2过滤管打到全吸收状态（Scrub）。CO2浓度设定为空气CO2浓度，通常在370-390ppm左右（温室内浓度要高一些，室内浓度有时能够达成1000ppm左右，本文是指室外）。控制CO2浓度目标在于CO2浓度改变对于荧光测量影响和其对光合测量影响一样巨大。匹配：参比室和样品室匹配。因为部分自动测量同时需要配合气体交换准确测量。5.1荧光动力学曲线研究意义：主要目标是探究植物叶片从黑暗条件下转入光下活化过程中各参数改变。在测量完FoFm之后打开活化光（此处通常设定为此种植物叶片饱和光强，所以，在此试验之前请先做光响应曲线确定其光饱和点范围。）照射，并按一定间隔打出强闪光，测定各指标，包含PhiPS2、ETR、qP、qN、NPQ等，并深入分析其改变趋势。通常而言，暗适应植物叶片突然照光后，荧光上升，不过光合速率等指标并没有显著改变，没有伴随高光强而表现出高光合速率，这是因为两方面条件限制：酶活性激活和气孔诱导开放。这时我们往往注意到气孔导度很低。伴随光照时间加大，光合速率逐步上升并达成稳定，而这时荧光参数是怎样改变呢？是否与光合稳定同时呢？荧光产量怎样下降，其中光化学淬灭和非光化学淬灭分别是怎样改变？这是我们这个研究主要意义。试验准备：如4.1一样暗适应。测量过程：进入测量菜单，按数字8，按F1设置参数如4.1一样。按数字8，按F3“DefineActinic”来选择“PQuantum”设置光强为饱和光强。不过此时不要打开活化光。按数字1，按F1打开文件，起文件名。夹入叶片，等候M行中dF/dT稳定后，按数字0，按F3测定Fo、Fm、Fv/Fm。按数字5，按F1“AutoProg”进入自动测量程序。选择“FlrKinetic”（荧光诱导动力学曲线），回车。DarkAdaptBeforeStarting?按N输入提前测量好Fo、Fm和暗光合速率（黑暗条件下呼吸速率，但符号相反为正值）。MeasureFo’withFsFm’?输入YEnableFlrrecordingBeforeFo?输入NLoopNTimes输入10（次）

TimebetweenFlashes输入3（分钟）Matchif△CO2lessthan:输入0（不匹配，此时假如需要光合数据应该提前匹配好）此时测量已自动开始。按9，按F4打开活化光。测量结束后菜单左边*将消失。每次循环统计时会有响声来提醒您一次循环完成。图2荧光动力学曲线中电子传递速率改变（仅作为举例，光强为500umolm-2s-1）5.2淬灭分析（三相分离）研究意义：非光化学淬灭NPQ和热耗散线性相关，其范围大致在0-详细数字。在一个经典植物中，在饱和光强下大致在0.5-3.5之间。qN是非光化学淬灭比较传统术语，有时候也会用到。它范围在0-1之间，所以在淬灭较高时不很敏感。一样淬灭在较高时可能会表现为很小上升，所以qN直接比较不很显著。通常，假如暗适应Fv/Fm显著不一样，那么NPQ也不能直接进行比较。通常而言，非光化学淬灭增加可能是因为叶片为免受光破坏保护机制。研究此过程一个方法是照光后弛豫速率（即对光适应叶片转入黑暗下之后一个小时之内各种荧光参数包含Fm’和淬灭系数改变动态）。不一样过程有不一样弛豫速率。其时间范围从几分钟到几个小时。这些不一样过程弛豫（Relaxation）动力学用于区分他们，有些人也称此过程为“三相分离”。通常来说，包含快速淬灭、中速淬灭和慢速淬灭三个组分。试验准备：首先要准确地测量Foo和Fmo（最好是植物叶片暗适应一个晚上，在凌晨之前测量得到Fm值）。然后等候光活化好，植物已经完全适应后即可开始测量了。测量过程：大部分过程和诱导动力学曲线设置相同，区分是关闭活化光。循环次数增加到20次。数据分析：Fmr称为可恢复最大荧光产量。它取得是在活化光诱导达成光下最大荧光平稳时，关闭活化光，测量Fo’后，把饱和光闪光间隔延长到180秒/次。得到一组逐步增大最大荧光产量，将该组最大荧光产量放在半对数坐标系中即成直线，该直线在Y轴上截距即为Fmr。然后继续按照以下公式计算NPQ快速和慢速组分（中速组分所占百分比较小，此处没有计算，感兴趣请参考国外文件）：NPQs=(Fmo-Fmr)/FmrNPQF=(Fmo/Fm’)-(Fmo/Fmr)图3弛豫过程中参数改变（横坐标为时间）图4弛豫过程中Fmr计算（Fm’半对数模拟）5.3荧光光曲线研究意义：作光响应曲线目标很多。本试验将主要集中在PhiPS2和PhiCO2两个参数。PhiPS2指经过荧光计算PSⅡ量子产量，而PhiCO2则是经过CO2同化作用计算量子产量。为了计算，需要知道植物叶片总同化速率（经过测量光下净CO2同化和消耗或者测量黑暗条件下叶片同化速率），同时需要知道叶片吸收光合有效辐射，包含瞬时光合有效辐射和叶片吸收系数。在这个试验中，将从一个光适应植物开始，经过降低瞬时光照强度，目标是为了逐步得到更高量子效率和量子产量。为完成这项工作，用户将利用到AutoProgram中“FlrlightCurve”。试验准备：假如试验中用是C3植物，最好在非光呼吸条件，也就是低氧条件下进行试验。能够在LI-6400进气口连接2%或更低氧气。利用适宜调整器、“T”形装置和流量计，方便为LI-6400气体泵提供足够流量并配置使气体容器中过多流量流出设施。假如用户没有做这些工作，测量结果中ΦPSⅡ和ΦCO2关系可能不是线性相关，假如用C4植物进行试验则能够防止以上这些问题。注意这时需要是光适应好（饱和光强下）植物叶片。操作过程：进入测量菜单，按数字8，按F1设置参数如4.1一样。将叶片夹入叶室，拧紧固定螺丝。打开文件并起文件名。按数字5，按F5进入“AutoProg”，选择“FlrLightcurve”，回车。DarkAdaptBeforeStarting?按N输入提前测量好Fo、Fm和暗光合速率（黑暗条件下呼吸速率，但符号相反为正值）。MeasureFo’withFsFm’?输入YEnabl