淮海工学院生物化学大实验报告niujun10800字

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海洋学院综合大实验报告专业：生物技术班级生技121班姓名：newjhon学号：21题目：生物化学大实验指导教师：孙玉英学年20xx年12月22日--2015年1月2日酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响班级：生技121姓名：牛军学号：20121211111【摘要】本实验采用控制变量法分别研究唾液淀粉酶的特异性以及温度、pH对该酶活性的影响，得出结论：唾液淀粉酶对淀粉有水解作用；在37℃和pH6.8时，酶的作用效果分别是最好的。【关键词】唾液淀粉酶，温度，pH，特异性1前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一种水解酶，具有水解可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键的酶。本实验通过比较在不同条件下唾液淀粉酶对淀粉水解后的显色反应颜色的不同，进而了解不同温度、pH对唾液淀粉酶活性的影响以及该酶的特异性。2材料及方法2.1材料主要材料为人的唾液以及淀粉溶液2.1.1试剂蒸馏水NaCl（分析纯，中国上海试剂一厂），可溶性淀粉（化学纯，广州医药站化学试剂公司），蔗糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），CuSO4（分析纯，上海试一化学试剂有限公司），柠檬酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂），无水Na2CO3（分析纯，南京化学试剂一厂），KI（化学纯，南京化学试剂有限公司），Na2HPO4·2H2O（分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂），浓HCl（分析纯，南京化学试剂有限公司），NaOH。2.1.2配制试剂①唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1—2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。②Benedict试剂A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；B、取柠檬酸钠173g及无水Na2CO3100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；1C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。（可长期保存）。③pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸钠38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；④pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸钠18.2mL；取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸钠2.2mL，然后用⑤pH9.8溶液：0.1MNaOH调至pH9.8左右；⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液：称取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于烧杯中，加入200mL水，于电炉上加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直至液体澄清。待冷却后转移至250mL容量瓶，定容。⑦0.5%的蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，加水溶解，定容至100mL。称取碘化钾3g溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加I1g，振荡溶解，定容⑧KI-I溶液：至100mL。2.1.3仪器试管（10支）移液管（7支）大烧杯（1000ml）HW·YS型电子恒温水浴（37℃）石棉网洗耳球玻璃棒胶头滴管，小烧杯（50，100ml）BP221S型电子天平pH试纸，容量瓶试管架2.2实验方法2.2.1酶的特异性（1）取两支试管编号①、②，①号加入0.5%的淀粉液2mL,②号加入0.5%的蔗糖液2mL；（2）与两支试管各加入制备好的唾液1mL；（3）将两支试管同时放入37℃恒温水浴锅中保温；（4）15分钟后，取出两试管，各加入Benedict试剂1mL；（5）将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；（6）取两支试管，观察记录颜色的变化，并注意是否有红棕色产生。A型50Hz220V—800W双层铁皮电炉2表1酶的特异性验证2.2.2温度对酶活性的影响①取三支试管并编号①、②、③，同时加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；②将管①、管②、管③同时分别放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中；③15分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化。表2温度对酶活性的影响2.2.3pH对酶活性的影响①取试管3支编号6、7、8，按下表加入试剂；②3支试管同时放入37℃恒温水浴锅内保温；③15分钟后，取出3支试管，分别加入碘试剂数滴，每加一滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。表3pH对酶活性的影响33结果与分析3．1实验结果3.1.1酶的特异性实验现象：①号试管经沸水浴后，试管内颜色仍为蓝色，但在试管底部可以看出有些许砖红色沉淀出现；②号试管经沸水浴后颜色没有发生变化(仍为浅蓝色。（如图1）②号试管①号试管图1酶的特异性实验现象表明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。说明唾液淀粉酶具有特异性。3.1.2温度对酶活性的影响实验现象：①号试管加5滴碘液并混匀后颜色趋近与碘液原来的颜色，但较②号试管颜色较深；②号试管加5滴碘液并混匀后也趋近碘液本身颜色，但比碘液颜色浅；③号试管加5滴碘液并混匀后变成深蓝紫色。（如图2）。①②③图2温度对酶活性的影响实验现象表明：经过冰水浴后，唾液淀粉酶活性降低，但仍能将淀粉分解成葡萄糖；而在37℃条件下唾液淀粉酶活性较高，将淀粉分解成葡萄糖。说明低温对唾液淀粉酶活性有一定影响。经过沸水浴后，唾液淀粉酶变性，不能分解淀粉。3.1.3pH对酶活性的影响实验现象：①号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后变成酒红色；②号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后接近碘液本身的颜色；③号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后变成浅蓝黄色。（如图3）。4①②③图3pH对酶活性的影响实验现象表明：pH为1.5（强酸性）条件下，唾液淀粉酶可以水解淀粉；pH为6.8（接近中性）条件下，唾液淀粉酶活性较高，能水解淀粉；pH为9.8（碱性）条件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是较pH1.5和pH9.8相比，酶的活性较弱。3.2结果分析本实验研究酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响得到以下结果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，验证了酶的特异性，与理论相符。在温度对酶活性影响实验中，由颜色变化可以得出结论：高温降低酶活性，低温对酶活有较小的抑制作用。在pH对酶活性影响实验中，得出的结论是：高pH对酶活抑制较大，低pH对酶活抑制较小。4讨论从实验中可以得出结论：唾液淀粉酶具有高度特异性，其活性受温度、pH值等多种因素影响。但本组实验所得砖红色沉淀较少，有些实验组没有沉淀产生，导致实验与预期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明显的个体差异，因而为了确定恰当的唾液稀释倍数和反应时间，建议在原实验项目之前增加唾液稀释倍数确定实验。唾液淀粉酶活性存在明显的性别差异[1]和个体差异，不同个体的酶活性相差达到上百倍，其主要是由于编码该酶的基因在体内的拷贝数差异所决定的[2-3]在进行该实验操作过程中会发现不同同学的唾液淀粉酶活力不同，在实验过程中所用的唾液的稀释倍数也不同。本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果有差异，且发现有实验证明酶的活性在沸水浴(95℃)中并没有受到影响，反而比恒温水浴(37℃)反应的更彻底[4]；本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果不一，需要改进实验方案：不要检测反应物(淀粉)，用斐林试剂检测产物(还原糖)进行判断，且注意斐林试剂的用量为5%HCl用量的2倍[5]。因此，要进一步探究温度、pH对酶活性的影响，确定酶的最适温度和最适pH，需要更加严格周密的实验方案。55参考文献[1]归改霞.性别不同对唾液淀粉酶活性影响的研究.卫生职业2013,31(24):110-11[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhumanamylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:1256-1260.[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.IndividualDifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsandtheperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:13352.[4]马彦玲.不同温度影响唾液淀粉酶活性实验操作流程的再改进.河南职工医学院学报,2013,25(5):613-616[5]范淑秋.pH影响淀粉酶活性的探究.生物学通报,2008,43(10):49-506血红蛋白凝胶过滤层析班级：生技121【摘要】本实验利用SephadexG－25制备凝胶柱，通过凝胶过滤层析的方法，从新鲜鸡血中制备鸡的血红蛋白，经洗脱液不断洗脱最终收集到含有鸡血红蛋白的样液。【关键词】凝胶过滤层析，血红蛋白,分离纯化1前言分离和提纯蛋白质方法多种多样，其中最为重要的两种方法就是电泳和层析，在这些方法中主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对其他分子的生物学亲和力[1]。凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子排阻层析、分子筛层析等,它是利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(凝胶)为填料,通过洗脱液的连续洗脱,使混合物中的各种物质按其分子体积大小和形状的差异而得到分离,已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子量测定等方面[2]。凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、分离迅速和不影响样品生物活性等优点,但凝胶过滤层析对蛋白混合物的最佳分离效果受许多因素的影响。通过本实验的学习，了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝胶柱层析的基本操作技术，为进一步掌握离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离方法打下良好基础。2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料新鲜鸡血Na2HPO4·2H2O（分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂）；NaH2PO4·2H2O（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；蒸馏水；乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）（分析纯，江苏徐州试剂二厂）；SephadexG－25；固体铁氰化钾〔K3Fe（CN）6〕；柠檬酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂）2.1.3配置试剂7姓名：牛军学号：201212111112.1.2药品①磷酸缓冲液（pH7.0）：称取Na2HPO4·2H2O2.172g，NaH2PO4·2H2O1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。②Na2HPO4—EDTA—Na2溶液：称取2.69gEDTA—Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。③40mmol/LFeSO4溶液：称取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中（现配现用）。①凝血：添加抗凝剂（150g/LEDTA.k2）的新鲜鸡血2.1.4仪器BP221S型电子天平玻璃棒洗耳球2.2方法2.2.1凝胶溶胀[3]取10gSephadexG－25，加200mL蒸馏水充分溶胀。待凝胶溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的pH7.0磷酸缓冲液，在真空干燥器中减压除气（过夜），准备装柱。2.2.2装柱将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入层析柱中，同时开启螺旋夹，控制一定流速。装柱后形成的凝胶床长约20cm，使胶床表面保持2-3cm液层。2.2.3平衡继续用磷酸缓冲液洗脱，调整缓冲液流速，平衡20-30分钟。2.2.4样品制备（1）取1mL鸡的抗凝血放入小烧杯中，加5mLpH7.0的磷酸缓冲液，再加入27.5mgK3Fe(CN)6固体，用玻棒搅动使其溶解，即得褐色的高铁血红蛋白溶液。（2）吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小烧杯中混匀。2.2.5上样旋开层析柱上端旋扭，待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶（即缓冲液液面与胶床平面相切）时，立即加入0.4mL上述混合液，待其进入胶床表面仅留约lmm液层时，加入0.5mL缓冲液，再当胶床表面仅留约lmm液层时，吸取0.5mL血红蛋白样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央。慢慢打开螺旋夹，待大部分8层析柱（Φ1cm×20cm）烧杯（50ml,100ml,500ml）移液管（1mL，5mL，10ml）容量瓶（100ml,1000ml，2000ml）胶头滴管样品进入胶床、床面上仅有lmm液层时，用乳头滴管加入少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后用液管小心加入3—5cm高的洗脱缓冲液。2.2.6洗脱继续用磷酸缓冲液洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6滴。等有红色液体滴出时开始收集液体，直至滴出液体颜色变浅。2.2.7凝胶的回收。实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用。3结果与分析3.1实验结果凝胶经溶胀、装柱、沉降后形成胶床，用磷酸缓冲液平衡后，沿层析柱内壁加入FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其进入胶后往胶床面中央加入鸡血血红蛋白，等其进入胶床后加入磷酸缓冲液。血红蛋白在胶床中缓慢层析，分为三层：上层呈现黄色，是铁氰化钾；中层呈现暗红色，是鸡血中的小分子物质及少量血红蛋白；最下层呈现鲜红色。收集层析柱中的红色的液体部分即为血红蛋白。本次实验收集的血红蛋白的量大约2mL。3.2结果分析本次实验中，层析的样品在胶床内分三层，符合理论；在实验过程中，样品洗脱速度较为合适，流速基本控制在每分钟6滴，洗脱获得的血红蛋白较其他实验组颜色略浅，总体而言，本实验是比较成功的，但在一些方面仍需要改进：成功之处：①层析速度控制准确，样品的条带清晰，分层清楚；②层析过程中操作规范，加样准确，层析结果较好。不足之处：①配制FeSO4溶液时，由于操作不及时，导致FeSO4被氧化，进而重新配制；9②有血红蛋白层析出时未能及时收集，导致部分血红蛋白损失。③层析后的柱子污染较为严重，抗凝血在层析前能离心处理下最好。④实验后，没有保持柱子处于缓冲体系中，出现柱子变干的情况。4讨论凝胶层析主要根据被测样品分子量的差异,在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的目的。分子量大的物质随流动相移动速度较快,先流出层析床。反之,分子量小的物质移动速度较慢,后流出[4]。凝胶过滤层析的操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，葡聚糖凝胶的吸附力弱，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果，也可用于去除高分子物质（如核酸、蛋白质、多糖等）中的一些小分子杂质。测定已知分子量的物质通过凝胶过滤层析洗脱体积，再测定未知分子量的大分子物质体积，从而测定高分子物质的分子量。鉴于凝胶层析法的高分离率、高灵敏度及操作简单,保持样品的生物活性等优点,这种方法已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子量测定。5参考文献[1]史伟，禹婷.蛋白质的层析分离内蒙古农业科技,2011（1）：110-112[2]方福德,周吕,丁濂,等.现代医学实验技巧全书[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995[3]王璞,林红,朱滨.凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存.中国科技论文统计源期刊,2006,23(2):24-25[4]杨歌德,姜玉梅,周宏博.凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种过滤介质分离效果的比较.哈尔滨医科大学学报,2002,36(3):242-24310SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳—蛋白质分子量的测定班级：生技121【摘要】本实验利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定凝胶过滤分离的鸡血血红蛋白的分子量。通过电泳后的条带计算样品迁移率，对比标准标准蛋白曲线，估算血红蛋白分子量。【关键词】SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，血红蛋白，分子量1前言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种用作测定蛋白质分子量常用的生物化学实验方法。它的基本原理是SDS与蛋白质分子结合,形成复合物。而且各种蛋白-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质的分子量有关系。用这种方法测定蛋白质的分子量,操作简便,快速,所需设备廉价,所得结果在分子量为15kD-200kD的范围内,与用其他方法测得的分子量相比,误差一般在正负10%以内[1]:聚丙烯酰胺凝胶是网状结构,具有分子筛效应,可以根据蛋白质分子大小的不同而分离蛋白质。电泳时,分子量小的蛋白质跑得快在下面,而分子量大的蛋白质跑得慢在上面SDS在蛋白质研究领域有着重要作用。2材料与方法2.1材料鸡血血红蛋白2.1.1试剂SDS（十二烷基硫酸钠）（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）丙烯酰胺（Acr）（化学纯，北京拜尔迪生物技术有限公司）N,N’甲叉双丙烯酰胺（Bis）（化学纯，北京拜尔迪生物技术有限公司）Tris（化学纯，北京拜尔迪生物技术有限公司）甘氨酸（Gly）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）NaH2PO4（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）Na2HPO4（分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂）考马斯亮蓝R—250（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）50%甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）冰乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）蒸馏水过硫酸铵（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）HCl（分析纯，南京化学试剂有限公司）巯基乙醇（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）甘油（分析纯，宜兴市钮家化学试剂厂）溴酚蓝（分析纯，上海化学试剂总厂）11姓名：牛军学号：20121211111四甲基乙二胺（TEMED）（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）2.1.2配置试剂①10%过硫酸铵：称取1.002g过硫酸铵固体粉用蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。②凝胶注液：称取Acr29g，Bis1g于烧杯中，然后加蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒转摇匀。③样品溶解液：SDS4.02g，巯基乙醇0.4mL，甘油4mL，溴酚兰0.01g，pH7.2磷酸缓冲液2mL。加蒸馏水溶解，转移至1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒转摇匀。④4X浓缩胶buffer：称取Tris6.0153g,用HCl调pH到6.8，然后加入SDS0.4070加水至100mL。⑤4X分离胶buffer：称取Tris36.3598g,用80mL蒸馏水溶解，再用浓HCl调pH到8.8，然后加入SDS0.808g，60℃水浴溶解，加蒸馏水至200mL。⑥电泳buffer：称取Tris12.1875g，Gly57.748g和柠檬酸4.0149g,放入到500mL大烧杯中，加蒸馏水60℃水浴溶解，转移至2000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒。⑦0.2mol/L，pH7.2磷酸盐缓冲溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，加入720mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，混匀后在pH计上调至pH7.2。⑧染色液：称取0.25g考马斯亮蓝R-250，454mL50%甲醇，46mL冰乙酸于烧杯中，转移至500mL容量瓶中。⑨脱色液：75mL冰乙酸，875mL蒸馏水与50mL甲醇混合。2.1.3仪器DYC2-24D型垂直板型电泳槽；移液管（1mL、5mL、10mL）；微量进样器（50μL）；培养皿（直径120mm）；电吹风；DYY-2C型直流稳压电泳仪；烧杯（25mL、50mL、100mL）；细长滴管；手术刀片；电炉。122.2方法2.2.1安装垂直板电泳槽、凝胶制备先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电极槽中间夹有一个凝胶模，该模由1个U形硅胶框、长与短的玻璃板及样品槽模板（梳子）所组成。先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。通过U形胶带将两块玻璃板封好，由此便形成一个“夹心”凝胶腔，再将封好的玻璃板插入电泳槽。注意操作过程中勿用手接触灌胶的玻璃面。为了检验装好的电泳槽是否漏胶，可以先加少量水检验封好的玻璃板是否会漏胶，确定不漏后将水倒出，并用吸水纸吸干凝胶腔中的水分。按照表1所示制备凝胶表1凝胶制备方法用吸管吸取分离胶，沿壁缓缓注入已准备好的胶室中，胶液加到离胶室顶部1.5厘米处。注胶后应立即覆盖3-5毫米的水层，垂直静止聚合30分钟左右。聚合后将覆盖的水层倒出，并吸干。2.2.2加样一般每个凹形样品槽内，只加一个种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，将样品与已知分子量的标准蛋白加在同一块凝胶上，加样体积要根据凝胶厚及样品浓度灵活掌握，本实验加样体积为20μL。如样品槽中有所泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。2.2.3电泳加样后，将电极缓冲液分别倒入上下电泳槽，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，先将电流调至25mA，10min候，将电流调至75mA，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边1-1.5cm处停止电泳，关闭电源，一般电泳过程需5-6h。2.2.4染色[3]与脱色13电泳结束后，取下凝胶模，卸下硅橡胶框，用解剖刀撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，将凝胶从玻璃板上取下，放入大的培养皿中染色30～60min，用蒸馏水漂洗数次，然后放入脱色液中脱色。勤换脱色液，12小时后可清晰地辨认出蛋白质区带，48小时后可脱至背景无色。若蛋白质区带清晰，可将电泳图谱照相保存。2.3Mr的计算通常以相对迁移率Mr来表示迁移率，相对迁移率的计算方法如下：用直尺分别量出样品区带中心及铜丝与凝胶顶端的距离，按下式计算：相对迁移率Mr＝样品迁移距离（cm）染料迁移距离（cm）以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移以标准蛋白质Mr的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线，根据待测样品的相对迁移率，从标准曲线上查出其Mr。3结果与分析3.1实验结果点样时，从右往左的顺序依次：①，②，③（前三组为本组实验条带）；④，⑤（为温奇秦组）⑥为Marker。很明显，marker带没有跑出，各组的蛋白条带也没有跑出.样品迁移率没法计算，所以蛋白的分子量无法计算。3.2结果分析本组制备的血红蛋白样液没有跑出条带，标准蛋白marker及其他组血红蛋白样液均没有跑出条带，说明蛋白样液的制备没有问题。纵观整个实验流程，本次实验没有成功的原因可能有以下几点：①Temed药品作用效果不明显，加大剂量后对蛋白电泳产生了影响②由于Temed在低pH值时失效，会使聚合作用延迟，所以可能是分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液的pH偏低14③由于浓缩胶凝固太慢，煮好的标准蛋白marker没有即时使用，过夜后再次进行沸水煮，很大可能使标准蛋白失效，依此推断，样品蛋白也失效。④凝胶中存在SDS,SDS的存在干扰了考马斯亮蓝与蛋白质的结合，虽然甲醇可以破坏SDS，但可能是样品溶解液中SDS过多导致染色失败。4讨论聚丙烯酰胺凝胶已成为目前生化实验最常用的支持介质［2］，通过使用强阴离子SDS建立的SDS技术已成为蛋白质分离、分析的常用方法［3－4］在用SDS凝胶电泳测定蛋白质分子量时应注意：要保证蛋白质-SDS复合物达到1.4gSDS/g蛋白质的比率并具有相同构像；要根据所测蛋白质分子量的范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择蛋白质分子量范围与性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质；在凝胶电泳中，影响迁移率的隐私较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制的完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线；不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。因此，这一方法需要我们不断探索创新，从而对其改良[5]，以发挥其优越性，避免其不良方面。5参考文献[1]张龙翔,张庭芳,李令媛.生化实验方法和技术北京:高等教育出版社,1987.86.[2]郭晓君．蛋白质电泳实验技术［M］．北京:科学出版社，1999．［3]范培昌．生物大分子印渍术和应用［M］．上海:上海科学技术文献出版社，1989:106－107．［4]陈亚飞，孙宇．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛇毒抗瘤蛋白的相对分子质量［J］．中国生化药物，2004，25(5):300－303．[5]叶长春.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进湖北工业大学学报,2009,24(4):16-1815

＋淮海工学院生物化学大实验报告niujun发表于：2023.1.23来自：字数：10877手机看范文海洋学院综合大实验报告专业：生物技术班级生技121班姓名：newjhon学号：21题目：生物化学大实验指导教师：孙玉英学年20xx年12月22日--2015年1月2日酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响班级：生技121姓名：牛军学号：20121211111【摘要】本实验采用控制变量法分别研究唾液淀粉酶的特异性以及温度、pH对该酶活性的影响，得出结论：唾液淀粉酶对淀粉有水解作用；在37℃和pH6.8时，酶的作用效果分别是最好的。【关键词】唾液淀粉酶，温度，pH，特异性1前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一种水解酶，具有水解可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键的酶。本实验通过比较在不同条件下唾液淀粉酶对淀粉水解后的显色反应颜色的不同，进而了解不同温度、pH对唾液淀粉酶活性的影响以及该酶的特异性。2材料及方法2.1材料主要材料为人的唾液以及淀粉溶液2.1.1试剂蒸馏水NaCl（分析纯，中国上海试剂一厂），可溶性淀粉（化学纯，广州医药站化学试剂公司），蔗糖（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），CuSO4（分析纯，上海试一化学试剂有限公司），柠檬酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂），无水Na2CO3（分析纯，南京化学试剂一厂），KI（化学纯，南京化学试剂有限公司），Na2HPO4·2H2O（分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂），浓HCl（分析纯，南京化学试剂有限公司），NaOH。2.1.2配制试剂①唾液淀粉酶的制备：用烧杯取蒸馏水或自来水，含于口中，1—2分钟后，吐入50mL烧杯中，备用。②Benedict试剂A、取CuSO417.3g溶于100mL热蒸馏水中，冷后稀释至150mL；B、取柠檬酸钠173g及无水Na2CO3100g，加水600mL加热使之溶解，冷后稀释至850mL；1C、将A液缓慢注入B液中，混匀备用。（可长期保存）。③pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M柠檬酸钠38.8mL，然后用浓HCl调至pH1.5左右；④pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M柠檬酸钠18.2mL；取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M柠檬酸钠2.2mL，然后用⑤pH9.8溶液：0.1MNaOH调至pH9.8左右；⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液：称取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于烧杯中，加入200mL水，于电炉上加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直至液体澄清。待冷却后转移至250mL容量瓶，定容。⑦0.5%的蔗糖溶液：称取蔗糖0.5g，加水溶解，定容至100mL。称取碘化钾3g溶于蒸馏水中，待全部溶解后再加I1g，振荡溶解，定容⑧KI-I溶液：至100mL。2.1.3仪器试管（10支）移液管（7支）大烧杯（1000ml）HW·YS型电子恒温水浴（37℃）石棉网洗耳球玻璃棒胶头滴管，小烧杯（50，100ml）BP221S型电子天平pH试纸，容量瓶试管架2.2实验方法2.2.1酶的特异性（1）取两支试管编号①、②，①号加入0.5%的淀粉液2mL,②号加入0.5%的蔗糖液2mL；（2）与两支试管各加入制备好的唾液1mL；（3）将两支试管同时放入37℃恒温水浴锅中保温；（4）15分钟后，取出两试管，各加入Benedict试剂1mL；（5）将两试管同时放入沸水中煮沸6分钟；（6）取两支试管，观察记录颜色的变化，并注意是否有红棕色产生。A型50Hz220V—800W双层铁皮电炉2表1酶的特异性验证2.2.2温度对酶活性的影响①取三支试管并编号①、②、③，同时加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混匀；②将管①、管②、管③同时分别放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中；③15分钟后，取出各管，分别加入碘液数滴，观察并记录各管颜色变化。表2温度对酶活性的影响2.2.3pH对酶活性的影响①取试管3支编号6、7、8，按下表加入试剂；②3支试管同时放入37℃恒温水浴锅内保温；③15分钟后，取出3支试管，分别加入碘试剂数滴，每加一滴，注意摇匀，观察并记录颜色变化。表3pH对酶活性的影响33结果与分析3．1实验结果3.1.1酶的特异性实验现象：①号试管经沸水浴后，试管内颜色仍为蓝色，但在试管底部可以看出有些许砖红色沉淀出现；②号试管经沸水浴后颜色没有发生变化(仍为浅蓝色。（如图1）②号试管①号试管图1酶的特异性实验现象表明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。说明唾液淀粉酶具有特异性。3.1.2温度对酶活性的影响实验现象：①号试管加5滴碘液并混匀后颜色趋近与碘液原来的颜色，但较②号试管颜色较深；②号试管加5滴碘液并混匀后也趋近碘液本身颜色，但比碘液颜色浅；③号试管加5滴碘液并混匀后变成深蓝紫色。（如图2）。①②③图2温度对酶活性的影响实验现象表明：经过冰水浴后，唾液淀粉酶活性降低，但仍能将淀粉分解成葡萄糖；而在37℃条件下唾液淀粉酶活性较高，将淀粉分解成葡萄糖。说明低温对唾液淀粉酶活性有一定影响。经过沸水浴后，唾液淀粉酶变性，不能分解淀粉。3.1.3pH对酶活性的影响实验现象：①号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后变成酒红色；②号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后接近碘液本身的颜色；③号试管逐滴加入3滴碘液并混匀后变成浅蓝黄色。（如图3）。4①②③图3pH对酶活性的影响实验现象表明：pH为1.5（强酸性）条件下，唾液淀粉酶可以水解淀粉；pH为6.8（接近中性）条件下，唾液淀粉酶活性较高，能水解淀粉；pH为9.8（碱性）条件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是较pH1.5和pH9.8相比，酶的活性较弱。3.2结果分析本实验研究酶的特异性及温度、pH对酶活性的影响得到以下结果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，验证了酶的特异性，与理论相符。在温度对酶活性影响实验中，由颜色变化可以得出结论：高温降低酶活性，低温对酶活有较小的抑制作用。在pH对酶活性影响实验中，得出的结论是：高pH对酶活抑制较大，低pH对酶活抑制较小。4讨论从实验中可以得出结论：唾液淀粉酶具有高度特异性，其活性受温度、pH值等多种因素影响。但本组实验所得砖红色沉淀较少，有些实验组没有沉淀产生，导致实验与预期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明显的个体差异，因而为了确定恰当的唾液稀释倍数和反应时间，建议在原实验项目之前增加唾液稀释倍数确定实验。唾液淀粉酶活性存在明显的性别差异[1]和个体差异，不同个体的酶活性相差达到上百倍，其主要是由于编码该酶的基因在体内的拷贝数差异所决定的[2-3]在进行该实验操作过程中会发现不同同学的唾液淀粉酶活力不同，在实验过程中所用的唾液的稀释倍数也不同。本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果有差异，且发现有实验证明酶的活性在沸水浴(95℃)中并没有受到影响，反而比恒温水浴(37℃)反应的更彻底[4]；本实验探究温度对酶活性影响的结论与预期实验结果不一，需要改进实验方案：不要检测反应物(淀粉)，用斐林试剂检测产物(还原糖)进行判断，且注意斐林试剂的用量为5%HCl用量的2倍[5]。因此，要进一步探究温度、pH对酶活性的影响，确定酶的最适温度和最适pH，需要更加严格周密的实验方案。55参考文献[1]归改霞.性别不同对唾液淀粉酶活性影响的研究.卫生职业2013,31(24):110-11[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhumanamylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:1256-1260.[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.IndividualDifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsandtheperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:13352.[4]马彦玲.不同温度影响唾液淀粉酶活性实验操作流程的再改进.河南职工医学院学报,2013,25(5):613-616[5]范淑秋.pH影响淀粉酶活性的探究.生物学通报,2008,43(10):49-506血红蛋白凝胶过滤层析班级：生技121【摘要】本实验利用SephadexG－25制备凝胶柱，通过凝胶过滤层析的方法，从新鲜鸡血中制备鸡的血红蛋白，经洗脱液不断洗脱最终收集到含有鸡血红蛋白的样液。【关键词】凝胶过滤层析，血红蛋白,分离纯化1前言分离和提纯蛋白质方法多种多样，其中最为重要的两种方法就是电泳和层析，在这些方法中主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括分子的大小和形状、酸碱性质、溶解度、吸附性质和对其他分子的生物学亲和力[1]。凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子排阻层析、分子筛层析等,它是利用某些化学惰性的多孔网状结构的物质(凝胶)为填料,通过洗脱液的连续洗脱,使混合物中的各种物质按其分子体积大小和形状的差异而得到分离,已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子量测定等方面[2]。凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、分离迅速和不影响样品生物活性等优点,但凝胶过滤层析对蛋白混合物的最佳分离效果受许多因素的影响。通过本实验的学习，了解凝胶柱层析的原理及应用，掌握凝胶柱层析的基本操作技术，为进一步掌握离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离方法打下良好基础。2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料新鲜鸡血Na2HPO4·2H2O（分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂）；NaH2PO4·2H2O（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）；蒸馏水；乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）（分析纯，江苏徐州试剂二厂）；SephadexG－25；固体铁氰化钾〔K3Fe（CN）6〕；柠檬酸钠（分析纯，中国上海试剂一厂）2.1.3配置试剂7姓名：牛军学号：201212111112.1.2药品①磷酸缓冲液（pH7.0）：称取Na2HPO4·2H2O2.172g，NaH2PO4·2H2O1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。②Na2HPO4—EDTA—Na2溶液：称取2.69gEDTA—Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。③40mmol/LFeSO4溶液：称取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中（现配现用）。①凝血：添加抗凝剂（150g/LEDTA.k2）的新鲜鸡血2.1.4仪器BP221S型电子天平玻璃棒洗耳球2.2方法2.2.1凝胶溶胀[3]取10gSephadexG－25，加200mL蒸馏水充分溶胀。待凝胶溶胀平衡后，用倾泻法除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的pH7.0磷酸缓冲液，在真空干燥器中减压除气（过夜），准备装柱。2.2.2装柱将层析柱垂直固定，旋紧柱下端的螺旋夹，在柱内加入少量磷酸缓冲液或直接把处理好的凝胶连同适当体积的缓冲液用玻棒搅匀，然后边搅拌边倒入层析柱中，同时开启螺旋夹，控制一定流速。装柱后形成的凝胶床长约20cm，使胶床表面保持2-3cm液层。2.2.3平衡继续用磷酸缓冲液洗脱，调整缓冲液流速，平衡20-30分钟。2.2.4样品制备（1）取1mL鸡的抗凝血放入小烧杯中，加5mLpH7.0的磷酸缓冲液，再加入27.5mgK3Fe(CN)6固体，用玻棒搅动使其溶解，即得褐色的高铁血红蛋白溶液。（2）吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小烧杯中混匀。2.2.5上样旋开层析柱上端旋扭，待胶床上部的缓冲液几乎全部进入凝胶（即缓冲液液面与胶床平面相切）时，立即加入0.4mL上述混合液，待其进入胶床表面仅留约lmm液层时，加入0.5mL缓冲液，再当胶床表面仅留约lmm液层时，吸取0.5mL血红蛋白样品溶液，小心地注入层析柱胶床面中央。慢慢打开螺旋夹，待大部分8层析柱（Φ1cm×20cm）烧杯（50ml,100ml,500ml）移液管（1mL，5mL，10ml）容量瓶（100ml,1000ml，2000ml）胶头滴管样品进入胶床、床面上仅有lmm液层时，用乳头滴管加入少量缓冲液，使剩余样品进入胶床，然后用液管小心加入3—5cm高的洗脱缓冲液。2.2.6洗脱继续用磷酸缓冲液洗脱，调整流速，使上下流速同步保持每分钟约6滴。等有红色液体滴出时开始收集液体，直至滴出液体颜色变浅。2.2.7凝胶的回收。实验完毕用洗脱液把柱内有色物质洗脱干净，保留凝胶柱重复使用。3结果与分析3.1实验结果凝胶经溶胀、装柱、沉降后形成胶床，用磷酸缓冲液平衡后，沿层析柱内壁加入FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其进入胶后往胶床面中央加入鸡血血红蛋白，等其进入胶床后加入磷酸缓冲液。血红蛋白在胶床中缓慢层析，分为三层：上层呈现黄色，是铁氰化钾；中层呈现暗红色，是鸡血中的小分子物质及少量血红蛋白；最下层呈现鲜红色。收集层析柱中的红色的液体部分即为血红蛋白。本次实验收集的血红蛋白的量大约2mL。3.2结果分析本次实验中，层析的样品在胶床内分三层，符合理论；在实验过程中，样品洗脱速度较为合适，流速基本控制在每分钟6滴，洗脱获得的血红蛋白较其他实验组颜色略浅，总体而言，本实验是比较成功的，但在一些方面仍需要改进：成功之处：①层析速度控制准确，样品的条带清晰，分层清楚；②层析过程中操作规范，加样准确，层析结果较好。不足之处：①配制FeSO4溶液时，由于操作不及时，导致FeSO4被氧化，进而重新配制；9②有血红蛋白层析出时未能及时收集，导致部分血红蛋白损失。③层析后的柱子污染较为严重，抗凝血在层析前能离心处理下最好。④实验后，没有保持柱子处于缓冲体系中，出现柱子变干的情况。4讨论凝胶层析主要根据被测样品分子量的差异,在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的目的。分子量大的物质随流动相移动速度较快,先流出层析床。反之,分子量小的物质移动速度较慢,后流出[4]。凝胶过滤层析的操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，葡聚糖凝胶的吸附力弱，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果，也可用于去除高分子物质（如核酸、蛋白质、多糖等）中的一些小分子杂质。测定已知分子量的物质通过凝胶过滤层析洗脱体积，再测定未知分子量的大分子物质体积，从而测定高分子物质的分子量。鉴于凝胶层析法的高分离率、高灵敏度及操作简单,保持样品的生物活性等优点,这种方法已广泛应用于大分子物质的去盐、溶液的浓缩、分离提纯及分子量测定。5参考文献[1]史伟，禹婷.蛋白质的层析分离内蒙古农业科技,2011（1）：110-112[2]方福德,周吕,丁濂,等.现代医学实验技巧全书[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995[3]王璞,林红,朱滨.凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存.中国科技论文统计源期刊,2006,23(2):24-25[4]杨歌德,姜玉梅,周宏博.凝胶过滤层析分离蛋白质实验中三种过滤介质分离效果的比较.哈尔滨医科大学学报,2002,36(3):242-24310SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳—蛋白质分子量的测定班级：生技121【摘要】本实验利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定凝胶过滤分离的鸡血血红蛋白的分子量。通过电泳后的条带计算样品迁移率，对比标准标准蛋白曲线，估算血红蛋白分子量。【关键词】SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，血红蛋白，分子量1前言SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种用作测定蛋白质分子量常用的生物化学实验方法。它的基本原理是SDS与蛋白质分子结合,形成复合物。而且各种蛋白-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率只与蛋白质的分子量有关系。用这种方法测定蛋白质的分子量,操作简便,快速,所需设备廉价,所得结果在分子量为15kD-200kD的范围内,与用其他方法测得的分子量相比,误差一般在正负10%以内[1]:聚丙烯酰胺凝胶是网状结构,具有分子筛效应,可以根据蛋白质分子大小的不同而分离蛋白质。电泳时,分子量小的蛋白质跑得快在下面,而分子量大的蛋白质跑得慢在上面SDS在蛋白质研究领域有着重要作用。2材料与方法2.1材料鸡血血红蛋白2.1.1试剂SDS（十二烷基硫酸钠）（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）丙烯酰胺（Acr）（化学纯，北京拜尔迪生物技术有限公司）N,N’甲叉双丙烯酰胺（Bis）（化学纯，北京拜尔迪生物技术有限公司）Tris（化学纯，北京拜尔迪生物技术有限公司）甘氨酸（Gly）（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）NaH2PO4（分析纯，天津市福晨化学试剂厂）Na2HPO4（分析纯，江苏省连云港市化学试剂厂）考马斯亮蓝R—250（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）50%甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）冰乙酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）蒸馏水过硫酸铵（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）HCl（分析纯，南京化学试剂有限公司）巯基乙醇（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）甘油（分析纯，宜兴市钮家化学试剂厂）溴酚蓝（分析纯，上海化学试剂总厂）11姓名：牛军学号：20121211111四甲基乙二胺（TEMED）（化学纯，国药集团化学试剂有限公司）2.1.2配置试剂①10%过硫酸铵：称取1.002g过硫酸铵固体粉用蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。②凝胶注液：称取Acr29g，Bis1g于烧杯中，然后加蒸馏水溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒转摇匀。③样品溶解液：SDS4.02g，巯基乙醇0.4mL，甘油4mL，溴酚兰0.01g，pH7.2磷酸缓冲液2mL。加蒸馏水溶解，转移至1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒转摇匀。④4X浓缩胶buffer：称取Tris6.0153g,用HCl调pH到6.8，然后加入SDS0.4070加水至100mL。⑤4X分离胶buffer：称取Tris36.3598g,用80mL蒸馏水溶解，再用浓HCl调pH到8.8，然后加入SDS0.808g，60℃水浴溶解，加蒸馏水至200mL。⑥电泳buffer：称取Tris12.1875g，Gly57.748g和柠檬酸4.0149g,放入到500mL大烧杯中，加蒸馏水60℃水浴溶解，转移至2000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，盖上瓶塞倒。⑦0.2mol/L，pH7.2磷酸盐缓冲溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氢钠溶液，加入720mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，混匀后在pH计上调至pH7.2。⑧染色液：称取0.25g考马斯亮蓝R-250，454mL50%甲醇，46mL冰乙酸于烧杯中，转移至500mL容量瓶中。⑨脱色液：75mL冰乙酸，875mL蒸馏水与50mL甲醇混合。2.1.3仪器DYC2-24D型垂直板型电泳槽；移液管（1mL、5mL、10mL）；微量进样器（50μL）；培养皿（直径120mm）；电吹风；DYY-2C型直流稳压电泳仪；烧杯（25mL、50mL、100mL）；细长滴管；手术刀片；电炉。122.2方法2.2.1安装垂直板电泳槽、凝胶制备先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽，两个电