冠心病痰瘀证候与E选择素G98T及S128R基因多态性的关系研究

冠心病痰瘀证候与Ｅ选择素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系研究【摘要】【目的】从基因多态性角度探讨冠心病痰瘀证的实质。【方法】入选１０７例研究对象，应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性核苷酸分型技术检测血清E选择素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，同时采用酶联免疫吸附法测定血清Eselectin浓度。【结果】冠心病痰瘀证组EselectinＧ９８Ｔ的ＧＧ基因型、Ｇ等位基因，EselectinＳ１２８Ｒ的ＳＲ基因型、Ｒ等位基因频率高于正常组，但经过统计学分析，两者之间差异无显着性意义。冠心病痰瘀证型组患者血清Eselectin水平高于正常组。【结论】冠心病痰瘀证可能与Ｅ选择素Ｇ９８Ｔ的Ｇ等位基因、Ｅ选择素Ｓ１２８Ｒ的Ｒ等位基因有一定的相关性。

【关键词】冠状动脉疾病；痰证；血瘀；E选择素/血液

冠心病是严重影响人类健康生活的疾病之一，炎症在冠心病的形成发展过程中起着重要作用。遗传流行病学研究显示冠心病的发病有遗传因素的作用，目前相继发现一些基因多态性影响脂质代谢、炎症反应、血栓形成及血管收缩与舒张等病理生理过程，与冠心病发生的危险性增加关系密切。痰瘀证候是冠心病的常见证候。本研究采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法检测冠心病痰瘀证候患者的血清Ｅ选择素Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，以期发现其中的内在联系。现将结果报道如下。

1研究对象

11资料来源研究对象均来源于２００６年２月～２００７年３月在广州中医药大学第一附属医院心内科临床确诊为冠心病心绞痛和急性心肌梗死的住院病例；同时设立正常组作为对照。所有研究对象均为汉族广东省常住人口。

12诊断标准诊断标准参照１９７９年国际心脏病学会及世界卫生组织关于缺血性心脏病的诊断［１］；辨证标准参照中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》［２］中的胸痹心痛辨证分型及沈绍功等［３］《中医心病诊断疗效标准与用药规范》。具体中医辨证标准痰浊证组：胸脘闷痛痞满，口黏乏味，纳呆脘胀，苔腻或黄或白滑，脉滑或数。血瘀证组：胸脘刺痛固定，面晦唇青，怔忡不宁，舌质紫暗或见紫斑或舌下脉络紫胀，脉涩或结代。痰瘀证组：胸痛或胸脘痞满，舌质紫暗，或有瘀点、瘀斑，舌苔厚腻，脉弦或滑。同时具备以上四大主症者可辨证为痰瘀证。

13一般资料入选研究对象共１０７例，其中正常组２０例，男６例，女１４例，平均年龄为岁，体质量指数为kg/m2。冠心病组８７例，其中痰瘀证组５５例，男３８例，女１７例，平均年龄为岁，体质量指数为kg/m2；血瘀证组２０例，男１１例，女９例，平均年龄为岁，体质量指数为kg/m2；痰浊证组１２例，男８例，女４例，平均年龄为岁，体质量指数为kg/m2。各组在年龄、性别、体质量指数方面比较差异无显着性意义,具有可比性。

2研究方法

21标本收集选择血清／全血作为观察样本，病人入院后次日凌晨６时进行采血，标本放置于冰箱，并于当日对所需血清标本进行以3000r/min离心10min，取上清液，置于-３０℃冰箱保存，全血标本置于-７０℃冰箱保存。

22检测指标及方法Eselectin浓度采用酶联免疫吸附法测定，由本院实验中心完成；采用聚合酶链反应—限制片段长度多态性基因分析法检测EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型，由中山大学组织配型中心完成。血清Eselectin酶联免疫法测定具体操作方法：血清标本置于室温下解冻；按说明准备试剂、标准品及样本；每孔加入100μL测定稀释液；每孔加入１００μL标准品或已稀释的样本。室温下在振荡机上以r/min进行振荡，孵育15h；抽吸清洗６次，将微孔在吸水纸上扣干；每孔加入１００μL酶联物，室温下振荡孵育３０min；每孔加入１００μL显色液，室温避光孵育1h；每孔加入５０μL终止液，３０min内在４５0nm处读Ｄ值；以Ｄ值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据血清样品的Ｄ值可在标准曲线上查出其浓度。Ｇ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系研究EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因型检测的ＰＣＲＲＦＬＰ基因分析法：使用试剂：ＤＮＡ分子标准ＤＬ２０００Marker、QIAampDNABloodMiniKit(Qiagen公司产品）、TaqDNAPolymerase、DNTPs、HphI限制性内切酶、PstI限制性内切酶;外周血白细胞ＤＮＡ的提取：全部受试者均取外周静脉血2mL，ＥＤＴＡ抗凝，采用QiagenDNA抽提试剂盒提取基因组ＤＮＡ，步骤①取１５mL离心管，注明名字及编号；②管底加ProteaseK20μL，全血２００μL，BufferAL200μL，混匀后５６℃水浴１０min;③取无水乙醇２００μL加入管中，混匀，转移入SpinColumn,8000r/min离心５min;④弃滤液，SpinColumn转移入清洁收集管中，加ＡＷ１液５００μL，8000r/min离心５min；⑤弃滤液，SpinColumn转移入另一清洁管中，加ＡＷ２液５００μL，8000r/min离心５min；⑥弃滤液，SpinColumn转移入已标名字的１５mL离心管中，加BufferAE或蒸馏水２００μL，8000r/min离心５min；-２０℃保存备用。聚合酶链反应：①引物序列：引物序列参考文献［９］并结合PrimerExpressSoftware20版设计，引物序列见表１，全部引物由Invitrogen公司合成。②反应体系：１０倍PCRBuffer５μL、１０mmoldNTPs１μL、上下游引物各１０pmol、Taq酶３Ｕ、膜板５μL、加无菌去离子水至５０μL。③反应条件：９３℃３min预变性，９３℃３0s，各外显子参照上述退火温度，共３５个循环，７2℃延伸１０min。反应后检测，取８μLＰＣＲ扩增产物用２0g/L的琼脂糖凝胶进行电泳，ＰＣＲ产物在２0g/L琼脂糖中电泳检测后-２０℃保存备用。④结果：ＰＣＲ产物经２0g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，片段大小符合预先设计。ＰＣＲ限制性片段长度多态性分析：①HphI反应体系：PCR反应混合物10μL(约1μgofDNA)，10倍NEBBuffer2μL，HphI1μL，加水、无核酸酶试剂至20μL，温和震荡，短暂离心数秒。３７℃酶切过夜。取10μL酶切产物用２0g/L琼脂糖凝胶进行电泳；②PstI反应体系：PCR反应混合物10μL(约1μgofDNA)，１０倍HBuffer２μL，PstI1μL，加水、无核酸酶试剂至２０μL，温和震荡，短暂离心数秒。３７℃酶切4h。取10μL酶切产物用２0g/L琼脂糖凝胶进行电泳。

表1PCR引物序列

Table1PCRprimersequence基因PCR引物(5→3)退火温度(℃)长度(bp)G98TTGCCCAAAATCTTAGGATGCAAGCCCAGGGAAGAACACAT59332S128RAGTAATAGTCCTCCTCATCATGACCATCTCAAGTGAAGAAAGA55186

2３统计学方法采用ＳＰＳＳ１１５软件包进行分析。分类资料的组间比较采用χ2检验。计量资料采用±s表示，两组以上均数的组间比较采用OnewayANOVA检验，用Bonferroni方法进行两两比较。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计，研究对象与HardyWeinberg平衡的符合程度，基因型和等位基因频率的组间比较采用χ2检验。

3结果

３１各组Eselectin水平比较表２结果显示，冠心病各证型组患者血清Eselectin水平均高于正常组，但各证型组间比较，差异无显着性意义。表2各组Eselectin水平比较①Ｐ＜００１，与正常组比较３2各组EselectinG98T及Ｓ１２８Ｒ基因型比较将符合纳入标准且资料完备的８２例应用ＰＣＲＲＦＬＰ测定基因型，其中正常组１６例，痰瘀组４５例，血瘀组１３例，痰浊组８例，因血瘀组和痰浊组检测例数较少，故将其合并为非痰瘀组，再进行统计分析。

３２1Eselectin的Ｇ９８Ｔ酶切结果见图１。

322Eselectin的S128R酶切结果见图2。

323各组Eselectin的G98T基因型和等位基因的频率分布表3结果显示，冠心病痰瘀组GG基因型、G等位基因频率高于正常组，GT基因型、T等位基因频率低于正常组，并符合HardyWeinberg平衡，但两者之间差异无显着性意义。各组之间的基因型分布、等位基因频率比较差异无显着性意义。HphI酶切Ｎ(p/%)

组别Ｎ基因型ＧＧＧＴ等位基因ＧＴ正常组16115275痰瘀组４５３９６８４６非痰瘀组２１１９２４０２

324各组Eselectin的S128R基因型和等位基因的频率分布表４结果显示，冠心病痰瘀组ＳＲ基因型、Ｒ等位基因频率高于正常组，ＳＳ基因型、Ｓ等位基因频率低于正常组，并符合HardyWeinberg平衡，但两者之间差异无显着性意义。各组之间的基因型分布、等位基因频率比较差异无显着性意义。表４各组Eselectin的Ｓ１２８Ｒ基因型和等位基因的频率分布

４讨论

冠心病属中医胸痹心痛范畴，主要病机为痰瘀互结，心脉痹阻，其病位在心脉，发病多与肝、脾、肾三脏功能失调有关，如肾虚、肝郁、脾失健运等，病理变化主要表现为本虚标实，虚实夹杂，以痰瘀痹阻为标实的特点。曹洪欣等［４］研究认为冠心病的病机为本虚标实，本虚以心阳虚为主；标实除血瘀、痰浊、气滞外，痰瘀互结与冠心病直接相关。痰瘀互结证是冠心病的常见证候，痰瘀互结是冠心病发病的重要病理因素，痰瘀同治法是治疗冠心病的常用法则。本课题组的临床研究共收集冠心病９４例，其中痰瘀证占５８５％，是冠心病的主要证型，这与文献报道的资料相符合［５］。冠心病是一种多因素、多基因遗传疾病，且与环境因素密切相关；遗传因素在冠心病人群中可能起着不可忽视的重要作用。近年来，越来越多的证据表明，炎症在冠心病的发生、发展和预后过程中起着重要的作用。炎症反应的激活可能是引起斑块不稳定而导致急性冠脉综合征的主要因素。Eselectin参与多种白细胞以ＣＤ４记忆性Ｔ细胞亚群的黏附与聚集，它在免疫、炎症及动脉粥样硬化的形成过程中起着重要作用［６-７］。杨立森等［８］的研究表明，冠心病患者血清Eselectin水平增高，反映了病情的严重程度，可作为可疑胸痛患者的辅助鉴别诊断手段。有研究证实Eselectin基因第２和第４外显子分别存在Ｇ／Ｔ和Ｓ／Ｒ多态性，这两种多态性可能影响Eselectin基因表达和功能，并可能与心血管疾病，尤其是与冠心病发病有密切关系［９-１０］。文献报道，在人粥样硬化斑块处，Eselectin的表达增加［１１］，冠心病患者血清可溶性Eselectin也有不同程度的升高［１２］。通常认为Eselectin水平的变化反映了细胞表面成分的翻转和蛋白质的水解，可作为疾病活动的标志。林帆等［１３］研究显示了EselectinＳ１２８Ｒ多态性与冠心病的发生有关，Ｒ等位基因可能是冠心病的危险因素。李艳等［１４］研究表明EselectinＳ１２８Ｒ基因多态性与冠心病的发病有关联，并可影响血清Eselectin水平，Ｒ等位基因可能是冠心病发病的遗传易感基因；Eselectin基因Ｇ９８Ｔ多态性在冠心病发病中可能不起直接作用。EselectinＳ１２８Ｒ经ＰＣＲ扩增产物片段大小为１８６bp，根据限制性内切酶PstI酶切片段的情况，基因型有3种：ＳＳ型，ＳＲ型，ＲＲ型。本研究结果显示，EselectinＳ１２８Ｒ的基因型为ＳＲ基因型、ＳＳ基因型，未发现ＲＲ基因型。其中正常组ＳＳ基因型携带者占８７５％，ＳＲ基因型携带者占１２５％，Ｓ等位基因频率为９３７５％，Ｒ等位基因频率为６２５％；冠心病痰瘀组ＳＳ基因型携带者占８２２％，ＳＲ基因型携带者占１７８％，Ｓ等位基因频率为９１１％，Ｒ等位基因频率为８９％。冠心病痰瘀组EselectinＳ１２８Ｒ的ＳＲ基因型、Ｒ等位基因频率高于正常组，并符合HardyWeinberg平衡，但两者之间差异无显着性意义。EselectinＧ９８Ｔ经ＰＣＲ扩增产物片段大小为３３２bp，根据限制性内切酶HphI酶切片段的情况，基因型为ＧＧ型，ＧＴ型，ＴＴ型。本研究结果显示，EselectinＧ９８Ｔ的基因型为ＧＧ基因型、ＧＴ基因型，未发现ＴＴ基因型。其中正常组ＧＧ基因型携带者占６８８％，ＧＴ基因型携带者占３１２％，Ｇ等位基因频率为８４４％，Ｔ等位基因频率为１５６％；冠心病痰瘀组ＧＧ基因型携带者占８６７％，ＧＴ基因型携带者占１３３％，Ｇ等位基因频率为９３３％，Ｔ等位基因频率为６７％。冠心病痰瘀组EselectinＧ９８Ｔ的ＧＧ基因型、Ｇ等位基因频率高于正常组，并符合HardyWeinberg平衡，但两者之间差异无显着性意义。目前，关于冠心病与EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的研究报道不少，但尚未能形成统一的意见，这可能与冠心病为多基因遗传疾病存在一定的关联，不同基因的多态性在冠心病的发病过程可能有着直接或间接的联系。然而，关于冠心病中医证型与EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的研究报道尚未发现。本研究初步探讨了冠心病痰瘀证与EselectinＧ９８Ｔ及Ｓ１２８Ｒ基因多态性的关系，推测冠心病痰瘀证可能与EselectinＧ９８Ｔ的Ｇ等位基因及EselectinＳ１２８Ｒ的Ｒ等位基因有关。因本研究样本量少，未得出统计学差异，但这将为冠心病痰瘀证的研究提供了新的思路。

【参考文献】

［１］国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组．缺血性心脏病的命名和诊断标准［Ｓ］．中华心血管病杂志，１９８１，９：７５．

［２］中华人民共和国中医药行业标准．中医病证诊断疗效标准［Ｓ］．南京：南京大学出版社，１９９４：１８-１９．

［３］沈绍功，王承德，闫希军．中医心病诊断疗效标准与用药规范［Ｍ］．北京：北京出版社，２００１：１５-２５．

［４］曹洪欣，张华敏．痰瘀互结与冠心病发病机理辨识［Ｊ］．中医药学刊，２００１，１９：５４４．

［５］洪永敦，黄衍寿，吴辉，等，冠心病中医证候与炎症因子关系的临床研究［Ｊ］．广州中医药大学学报，２００５，２２：８１．

［６］BlannAD,McCollumCN,LipGY．RelationshipbetweenplasmamarkerofendothelialcellintegrityandtheFraminghamcardiovasculardiseaseriskfactorscoresinapparentlyhealthyindividuals［Ｊ］．BloodCoagulation&Fibrinolysis,2002,13:513．

［７］ShyuKG,ChangH,linCC,etal．Circulatingintercellularadhesionmolecule1andEselectininpatientswithacutecoronarysyndrome［Ｊ］．Chest,1996,109:1627．

［８］杨立森，林媛豪，石学宁，等，可溶性Ｅ选择素对冠心病心绞痛的诊断意义［Ｊ］．临床心血管病杂志，２００３，１９：２７２．

［９］ZhengF,ChevalierJA,ZhangLQ,etal．AnHphlpolymorphismintheEselectingeneisassociatedwithprematurecoronaryarterydisease［Ｊ］．ClinGenet,2001,59:58．

［１０］Y