第一章培养室的基本设备和

绪论一、概念

植物组织培养（组培）（planttissueculture)，指在无菌条件下，利用人工配制的培养基和合适的光照、温度、pH值、营养、激素等因素对植物的组织、器官、细胞和原生质体进行脱分化诱导形成新的完整植株的一门技术。

外植体(explant)——用来进行组织培养的离体植物接种材料。

根据所培养的植物材料（外植体）的不同，可把组培分为五种类型：即愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官培养（胚、花药、子房、根、茎和叶的培养等）、茎尖分生组织培养和原生质体培养。

脱分化(dedifferentiation)——指已经成熟的已分化细胞（组织）在一定条件的刺激下又恢复了分生能力的现象。比如成熟组织上形成了愈伤组织。分化(differentiation)——指由具有分生能力的还没有形态和功能分化的组织（如分生组织、愈伤组织等）朝着不同的发育方向发展，产生了不同的组织和器官的现象。再分化(redifferentiation)——指脱分化的组织再次分化出新的组织或器官的现象。愈伤组织(callus)——指在组织培养中，由外植体长出来的一团无形态和功能分化的薄壁组织。

细胞的全能性（totipotent)——任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。二、植物组织培养的发展历史

1.探索阶段——20世纪初，在德国植物学Schleiden和Schwann的细胞学说，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点，并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。但没有成功，直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，在此32年中，一直处于探索阶段，进展不大。2.奠基阶段——即20世纪30年代中至50年代。两个重要发现：一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素和细胞分裂素是一种天然的生长调节剂。3.迅速发展阶段——20世纪60年代至今。烟草髓部单细胞获得完整再生植株；原生质体培养取得重大突破；花药培养取得显著成绩；微繁技术得到广泛应用。三、组培在农、林业上的应用1.快速繁殖2.可获得去病毒植株3.组培是转基因技术不可或缺的组成部分，无论是转基因受体的提供，还是转化细胞的筛选和再生，都需要组培技术作为支撑。4.克服远缘杂交的不亲和性5.缩短常规育种的时间6.次生代谢物的获得第一章

组培室的基本设备和一般技术（一）实验室设计与要求现以一个年产4万～20万株苗的小规模实验室为例，要求有2～3间实验用房，其总面积不应少于40－60m2。房间可划分为准备室、培养室和无菌操作室。1.准备室要求20m2，明亮，通风。准备室的任务很繁重，要完成器皿洗涤、培养基配制、分装、包扎、高压灭菌，还有试管苗的出瓶、清洗与整理工作。本室应由1～2名熟练工来操作。（1）100－200L电冰箱1台，用以贮存易变质、易分解药品及各种母液。（2）高压灭菌锅，手提式需2－3个，中型立式只需1个，手提式快捷方便，但容量少，不能满足大规模培养，如年产百万株苗则应选大型卧式灭菌锅。（3）煮培养基的电炉或煤气炉，不锈钢锅或医用搪瓷杯。（4）水槽（5）工作台（6）药品柜、搁架，用于存放药品、玻璃瓶等。（7）干燥箱一个，用于玻璃器皿的干燥。（8）蒸馏水器（9）酸度计或pH计电子天平的正确使用1.不能经常搬动；2.干燥的环境；3.平稳，水平台面4.步骤：清洁——开机——调水平——调零——关窗——称量纸或者称量杯——清洁——保护（10）1/1000电子天平1部。（11）培养器皿（12）下口杯，用于分装培养基，注意：1000ml热培养基应定容到约1100ml。（13）试剂瓶1000ml,500ml,250ml棕色瓶各5个，白色5个，100ml滴瓶10个，100ml试剂瓶20个。（14）移液管10ml，5ml，2ml,1ml各5支。（15）量筒1000ml2只，500ml2只，100ml4只，50ml4只。（16）烧杯1000ml,500ml,250ml,100ml各10只。（17）容量瓶1000ml,500ml,250ml,100ml,各4只（18）试管刷若干（19）胶手套和线手套若干双(20)大型的塑料果菜篮20个，用于堆放培养瓶

倒置显微镜2.无菌操作室（接种室）如果说准备室因工作内容多，处理事物的数量大，以至在条件许可时面积宜大不宜小，那么无菌操作室却恰好相反了，即在工作方便的前提下，宜小不宜大，宜精细密闭，以最大限度减少污染。无菌操作室也叫接种室，是进行无菌操作的场所，如材料的消毒接种，无菌材料的继代，如丛生苗的增殖或切割嫩茎插植生根等。

这里是植物组织培养研究或生产工作中的最关键的部分，关系到培养物的污染率、接种工作效率等重要指标。要求地面、天花板及四壁尽可能光洁，不易积染灰尘，易于采取各种清洁和消毒措施。如放1台超净台，约7－8m2，2台超净台10－12m2即足够了。

无菌室要干爽安静、清洁明亮，在适当地位置吊装紫外灭菌灯1－2盏，用以经常照射灭菌，使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态。最好安装空调机，在工作时把无菌室的门窗关紧，尽量减少与外界的空气对流，减少尘埃与微生物侵入。无菌室配拉门，以减少空气的扰动。

无菌室外应留有缓冲间，进入无菌室前在此更衣换鞋，洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料等。最好安装一盏紫外灯，用以灭菌。缓冲间有2－3m2就够了，有一个洗手池，上面安一小搁架，用来放置烧杯采回来的材料等物。墙上设衣帽钩，门边摆拖鞋架（柜）。无菌室内的主要设备是超净工作台1－2台。放置待接种培养瓶的搁架，医用小推车，用来推送接种好了的培养瓶等。（1）超净台开机10分钟以上即可使用。将空气通过特制的微孔泡沫塑料片层叠合组成“超级虑清器”后吹送出来，形成连续不断地无尘无菌的超净空气层流，去掉≧0.3µm的尘埃、真菌和细菌孢子等等。超净空气的流速为每分钟24－30m，这已足够防止附近空气可能袭扰而引起的污染，这样的流速也不会防碍采用酒精灯的灼烧消毒。

无菌室应定期用70％或0.5％苯酚喷雾降尘和消毒，用2％的新洁尔灭抹拭台面和用具（70％酒精也可）。用福尔马林（40％甲醛）加少量高锰酸钾定期密闭熏蒸，配合紫外线灭菌灯（每次开启15分钟以上）等等消毒灭菌手段，以使无菌室经常保持无菌状态。

紫外光开启时间较长时，可激发空气中的氧分子缔合成臭氧分子（O3），这种气体成分有很强的杀菌作用，可以使紫外线没有直接照射到的角落产生灭菌效果。由于臭氧有碍健康，在进入操作前应先关掉紫外灯，关后10多分钟即可入内。（2）小搁架贮放高压灭菌过、等待接种的培养瓶用的小搁架。（3）医用小平车用来推送瓶子，如果没有，也可用其它大磁盘等代替。（4）无菌操作的器具按每个超净台上的用量计，需酒精灯1只，25cm长的医用镊子5把以上，4号解剖刀柄2－4把，21－23号刀片若干；不同形状的解剖用剪各1－2把，如平的、膝状的、弧形的等等。较长的可伸入瓶内剪取材料

500ml广口瓶数只，用于存放酒精（70％或95％均可），可浸泡镊子、刀、剪等。（5）小白瓷碟或培养皿。用于切割材料用。（6）适当大小的烧杯或广口瓶、玻璃棒等。用于新采材料的表面灭菌和清洗。（7）常备的消毒灭菌药剂及助剂如0.1％升汞、吐温、漂白粉精片、次氯酸钠溶液等。（8）无菌水经过高压灭菌的自来水即可。

3.培养室房间应尽量安排在楼层较高处，以利采光，减少尘埃和杂菌污染的机会。此外应考虑清洁干燥，培养室还要讲究保温隔热。为了减少能源消耗，应尽量考虑利用自然光照，除必要的承重结构外，全部安装落地式双层大玻璃窗，并在窗外设置防晒网，室内较暗处应安装灯管，人工辅助补充光源，有的公司在屋顶做可调节温度、光照、湿度的玻璃温室。冬暖夏凉。

本室的主要设备与用具有：（1）培养架与灯光年产4－10万株苗需4－6个架子。一般每个架子设6层，总高200cm，每30cm为一层，最下一层离地20cm。架宽50－60cm，架上安装1－2盏灯管（40w）以人工辅助照光。培养架应纵向对着光源。（2）配电板在培养室内应安装1－2个配电板，其上设熔断器（保险丝盒）和闸刀开关，用以管理室内的电源。（3）电源开关时控器（4）空调机室温控制在25℃左右。（5）温度、湿度计（二）操作技术

1.洗涤

植物组织培养最重要最基本的要求，就是各项操作都应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养过程中最经常最大量的工作之一，是洗涤培养瓶及其它常用器皿。洗好的瓶子应透明，内外壁水膜均一，不挂水珠，即表示无污迹存在。通常无需再用蒸馏水涮一遍，直接放入洁净的大果菜篮中，再置搁架上沥凉水汽,这可能是最省事最节约又少占空间的办法。急需使用时可用干燥箱（70－80℃）烘干。移液管之类的仪器，可用吸球和热洗衣粉水吸洗，再放水龙头下流水冲净，垂直放置凉干。带刻度的计量仪器不宜烘烤，以免玻璃变形，影响计量的准确度。

2.灭菌

灭菌工作是极其重要的。初学组培的人，首先要建立有菌和无菌的概念，即必须明确无误地认识和了解哪些东西及其一部分是有菌的，否则出了问题也不知出在哪里。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的（未经处理的）物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应以有菌物体看待。

超净台的表面也是有菌的；所有的培养容器无论洗得多么干净，是有菌的；简单煮沸过的培养基是有菌的；人体的整个外表面和与外界相连通的内表面，如整个消化道、呼吸道的内表面等等都是有菌的；我们使用的刀、镊子、剪等工具在未经处理之前，都是有菌的。我们所指的菌包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。

微生物的特点是：体积极其微小；繁殖力极强；数量大，无处不有、无孔不入；生命力强。

无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过的物体，经其它物理的或化学的方法处理过后的物体，是无菌的。当然，这些方法必须是已经证明为有效的，并且严格实施才能达到无菌状态。常用的灭菌(消毒)（sterilizationordisinfection）方法可分为：物理：干热（烘烤和灼烧）、湿热（蒸煮或加压蒸煮）、射线处理、超声波、微波、过虑后的流体（空气、溶液）等

化学：升汞、福尔马林、双氧水、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精等等。

组培对无菌条件的要求是非常严格的，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心即易引起杂菌污染，由于它们繁殖极快，同时还分泌对植物组织有毒的代谢废物，最后便使植物组织死亡或失去使用价值。

（1）培养基的灭菌培养基在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，至少应在24小时之内完成灭菌工作。继代培养更换下来的瓶子和生根苗种植后剩下的瓶子，其中的旧培养基都极易引起污染，应及时清洗，不应让杂菌滋生，以免传播扩散。

新制备分装好的培养基，放入高压灭菌锅内加热。锅内因密闭而使蒸气压力上升，并因压力上升而使水的沸点升高，在每平方厘米1.1kg的压力下，锅内温度就能达到121℃。

在121℃的蒸气温度下可以很快杀死各种细菌及它们高度耐热的芽孢，这些芽孢在100℃的沸水中能生存好几个小时。一般少量的液体只要20分钟就能达到彻底灭菌，如果灭菌的液体量大，就应适当延长灭菌的时间。特别要指出，只有完全排除锅内的空气，使锅内全部是蒸气的情况下，1.1kg/cm2的压力才对应121℃，否则灭菌便不能彻底。灭菌的功效主要靠温度，而不是压力。（2）不耐热的物质采用过虑灭菌一些生长因子，如赤霉素（GA3）、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理。通常采用过虑灭菌方法。先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后放置无菌场所，当其冷却至40℃左右，琼脂将要凝结之前，加入经过虑灭菌的各项不耐热成分的溶液，然后混匀放置，待冷凉备用。如果是液体培养基，没有凝固这个问题，则可在冷却到室温后再立即加入。

防细菌虑膜其孔径小于或等于0.45µm。过虑灭菌的原理，是溶液通过虑膜后，细菌的细胞和孢子等因大于虑膜孔径而被阻。虑膜的吸附作用力也不容忽视，往往小于虑膜孔径的细菌等亦不能透过。在需要过虑灭菌的液体量大时，常使用抽虑装置；液体量小时可用注射过虑器，它由注射器、滤器（可更换）、持着部分和针管等几部分组成。注射器不必先经高压灭菌，而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好

最好放在有螺丝盖的玻璃罐中，经高压灭菌，滤器灭菌不应超过121℃。在使用前按无菌操作要求将注射过虑灭菌器的几个部分装配在一起，把吸有需要过虑灭菌溶液的注射器插入细菌过虑器与之相配合的插接口，推压注射器活塞杆，将溶液压过虑膜，从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了。但是虑膜不能阻挡病毒粒子通过。假如需经过虑灭菌的溶液，带有沉淀物，那么在过虑灭菌之前可先预过虑。（3）用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌在准备作无菌操作时，把解剖刀、镊子、剪刀等浸入95％酒精中。用之前取出在酒精灯上灼烧灭菌，然后架放在灭过菌的支架上，放凉后立即使用。通常刀、镊子等都用2-3把轮流灼烧使用。我们在实践中采用500ml的广口瓶，放入95％的工业酒精，在操作前将各种器械泡入其中（使用端，占器械总长度约50－70％）。操作中反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕器械应擦拭干净。

（4）布制品采用高压灭菌如布手套、帽子、套袖、工作服、口罩等，洗净凉干，用牛皮纸包好，经高压灭菌备用。吸水纸等也要高压灭菌。（5）其它桌面、乳胶手套、墙面等可用70％酒精反复涂擦作表面灭菌。注意有机玻璃不能擦酒精。（6）植物材料的表面消毒最初从室内外采来的材料，都不同程度带有各种微生物，因此必须经过仔细表面消毒处理。把处理好的材料经无菌操作手续放置到培养基上，这一过程叫做接种（inoculate），接种的植物材料叫做外植体（explant）。

刷洗、冲洗是材料处理的第一步。

第二步是用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动，洗衣粉可按每100ml水加1－2角匙的量配制，即浓度较高为好。这是进一步减少污染的处理。大约浸搅5分钟，然后再用自来水冲洗干净。第三步是材料的表面灭菌（消毒），要在超净台或接种箱内操作。

将一干净烧杯（大小视材料多少而定）或广口瓶内、外表面用70％或75％酒精棉球擦拭作表面消毒，放一经同样处理的玻璃棒，置于超净台（已开机10分钟以上）或已灭好菌的接种箱内，再把处理好的植物材料置入，同时已准备好了消毒溶液、无菌水、待用培养基等。工作人员换上洁净的工作服，戴上帽子，防止头发散落尘屑。用肥皂洗手时至肘部，用洁净毛巾擦干，戴或不戴乳胶手套，用70％酒精棉擦手。

坐到超净台前，附近应放有座钟或表，把沥干水的植物材料转放入消过毒的烧杯或广口瓶中，看好时间，倒入消毒溶液，加消毒助剂吐温-80（tween-80）数滴，在持续消毒的时间内不时用玻璃棒轻轻搅动或盖上广口瓶盖轻轻摇动，以促进植物材料各部分与消毒液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。

在快到预定时间之前1分钟，即开始把消毒溶液倒入另一准备好的大烧杯中，要注意勿使材料倒出。倾净后立即倒入无菌水，轻搅涮洗。表面灭菌（消毒）的时间是倒入消毒液开始，到倒入无菌水时为止，加以记录，以便今后比较消毒效果，积累经验。无菌水涮洗每次3分钟左右，视采用的消毒溶液种类不同，涮洗的次数变动在3－10次之间。

涮洗完毕，植物材料的表面消毒就做完了，这时的材料就可以接种了。为什么要用无菌水涮呢？这是因为各种消毒剂不但能杀灭微生物，也能杀伤植物细胞，所以消毒的时间要考虑选定，消毒后又要尽量将消毒剂对植物的影响压缩到最低限度。

植物材料的表面消毒剂有好几种，在不同的情况下选用其中一二种即可。例如次氯酸钠或次氯酸钙在大多数情况下都能获得令人满意的消毒效果。如用次氯酸钠0.3－0.6％溶液，消毒15－30分钟，对许多植物组织效果都很好。今年来发展使用2种甚至2种以上的灭菌剂来处理外植体。多数人提倡在倒入正式的灭菌剂之前，用70％酒精作短暂灭菌，

一般在10－30秒左右，这在材料较多时颇难掌握，70％酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞。在做此项处理时，预先准备好，操作者动作要麻利，酒精倾出后立即倒入无菌水，亦可在70％酒精处理10秒左右后，向其中倒入大量无菌水，使酒精浓度降低，再作进一步处理。

有一些特殊材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，主要取用内部的材料，也可只用70％酒精（处理稍长时间）处理。处理完的材料放在无菌条件下，等酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。

异丙醇也可用于表面消毒，但不能用甲醇。也有用９５％酒精处理，并灼烧表面的处理方式。主要看材料适合哪种方式，工作经验越丰富，越能灵活运用，较快地获得多量的无菌外植体。材料消毒操作，是初学者的第一关，弄不好，则引起接种污染，导致组织培养失败。要根据植物材料对灭菌剂的敏感性来选用不同的药剂，确定适宜的处理时间和水洗的次数。

次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌，故灭菌时用广口瓶加盖或带螺旋盖的其它广口器皿较好。过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌。这３种药剂残留的影响较小，灭菌后用无菌水涮洗３-４次就可以了。而用升汞溶液灭菌的材料，因升汞的残毒较难去除，应当用无菌水涮洗８-1０次，每次不少于３分钟，以尽量去除残毒。我们在工作中都是采用升汞，当增加无菌水涮洗的次数之后效果很好。

用洗衣粉（洗洁精）浸洗过的材料，可以除去轻度附着在上面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌溶液的直接接触。酒精除杀菌作用外，也有使材料表面易被浸湿的作用。近年来普遍提倡在灭菌溶液中加添吐温-80或TritonＸ。

这是一些表面活性剂，主要作用是使药剂更易于展布，更容易浸润到要灭菌的材料表面，因此加用吐温后消毒剂活力大为提高，但对材料的伤害也在增加，应仔细摸索其用量和灭菌时间。一般每100ml加1-2滴。

吐温-80，英文商品名Tween-80，又叫polysorbata（聚山梨醇酯），为浅粉红色油状液体，有脂肪气味，用于气相色谱固定液等。汉语系统命名为聚环氧乙烷山梨糖醇酐单油酸酯。此外吐温-2０（聚环氧乙烷山梨糖醇单月桂酸酯），吐温-4０（聚环氧乙烷山梨糖醇单棕搁酸酯）也同样可用。3．无菌操作技术先用酒精或者新洁尔灭擦洗两遍手。（１）将初步洗涤及切割好的植物材料放入广口瓶或带螺旋盖的瓶中，置超净台上，最好转移到一个经过高温灭菌的带有盖子的玻璃瓶中，看好时间并记录，倒入加有表面活性剂的消毒溶液，盖上瓶盖，并轻摇数次。预定时间到了，开盖倒出消毒液（在预备的大烧杯或瓷杯中）。（2）立即倒入无菌水，盖上盖子，轻摇，3分钟后将水倒去再加适当量无菌水，反复涮洗３-４次或８-１０次。最后沥去水分，用灼烧放凉的镊子将灭好菌的材料放置在灭过菌的纱布（滤纸）上。小纱布包应有４层厚度，可多预备几包。

（3）通常小纱布包（滤纸）放在灭过菌的小白瓷碟（培养皿、不锈钢盘子）上，上面再放材料。然后一手拿解剖刀（剪刀），一手拿镊子，使材料在纱布（吸水纸）上吸干，并进行适当的切割，有时材料也可在消毒前全部切好。注意刀和镊子每使用片刻就应擦干净放入7５％的酒精中，并灼烧放凉备用。常２把交换使用，可提高工作效率，并防止连续（也称为交叉污染）

污染的发生。如镊子夹了没有消毒好的材料，再夹其它材料，从而造成污染。又如刀或镊子碰到台面、管（瓶）的外壁，棉塞、包头纸，以及手拿的部位过近，未能充分灼烧等，连续使用过久，都易引起交叉污染。工具要多几份以降低交叉污染的概率。经常灼烧操作器械便可打断这种污染，即便污染也是一个个独立发生的，不会连续成片地污染。材料洗净吸干水分也有防止连续污染的意义。（４）外植体植入培养基表面用上述灼烧消毒过的器械，将切割好的外植体插植到培养基表面上。具体操作是左手拿试管，解开拿走包头纸，将试管几乎水平拿着，靠近酒精灯焰，将管口外部在灯焰上燎数秒钟，因为