WB实战指南+正确使用QuantityOne定量

WB实战指南+正确使用品制备：变性条件——SDSLB直接裂解：用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但轻易遗忘，LB久煮一些性质会改变）1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其余按平板面积比类推。通常条件下，SDSLB都是过量（所以不一定要严格参考SDSLB稀释比）；假如SDSLB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发觉tip吸不上来，非常粘、一砣一砣，很轻易堵住tip。这时候常规做法有两种，1.再煮5min。常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.假如10min煮样后，依然吸不起来，才适当增加SDSLB，继续煮；也能够对样品进行超声。煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB意义，请丢弃（判断标准：出现显著蛋白沉淀和水分层）此方法缺点，SDSLB煮过样品假如用来做IP，需要特殊方法，所以，这种制备方法制备样品有使用局限。非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）裂解细胞请尽可能冰上操作，减缓酶解作用。俺前bossnature文章上裂解液配方是：20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors(20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用0.5mMPMSF代替这三种就好了；假如还要做磷酸化蛋白，加1mMNa3VO4（现加现用），10mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。此方法优点：NaCl浓度略低于生理状态，确保裂解细胞方式较为温和，便于随即IP等试验。其余Na盐浓度细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强复合体，要得到纯化一些复合体组成蛋白通常采取极端高盐裂解细胞。用于核蛋白裂解原因是0.5%NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。组织块裂解：组织块较大用匀浆方法最适宜，现在有不少转头很小匀浆器。当组织超微量时候，比如50mg新鲜癌组织，我采取方法是1.低温（剪）搅碎，成肉糜状。2.锡箔纸包裹好，放入少许液氮，快速敲击（控制力量，尽可能防止弄破锡箔纸），深入破碎；重复数次。3.用上述细胞裂解液回收。分泌型蛋白富集：用无血清培养基培养细胞，搜集上清液用于WB检测；假如含量过低，需要用TCA沉淀富集。理论上，从普通培养基中搜集分泌蛋白，此时对细胞生长条件影响最小，是最好试验条件；不过这存在隐忧。因为含血清培养基中含有非常丰富BSA（牛血清白蛋白）之类蛋白质，除非你深入分离纯化，不然直接用这种样品去WB会有非常大麻烦，尤其当你蛋白在60-46kDa之间时候；用“任何”抗体去检测这一区间蛋白，会有一片非常强信号。因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。同理，采取SDSLB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目标之一是去除培养基中BSA。采取无血清培养基搜集细胞上去除了改变细胞生理状态外（可能激活未知信号路径，诸如AKT等），还会出现问题是：1.即使采取了无血清搜集上清，依然有大量杂蛋白，但相对好很多。2.选取了上清，因为蛋白浓度太稀，通常要采取TCA沉淀富集，再重新溶解。a.TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很轻易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管摆放非常考究，要180度翻转离心两次。b。重新溶解时，因为蛋白需要在一定盐离子条件下才能重新溶解，你要探索充分溶解条件，相对麻烦。实际上，假如你不是非常强调蛋白分泌有什么生理功效，通常不提议检测上清，尤其半定量WB试验检测不一样品间差异。这里面有试验操作细节麻烦——经验之谈，我曾经参加cancercell文章所研究蛋白就是分泌型蛋白，但90%数据是celllysis；偶然用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白原料，为深入分析做准备。样品制备完，应立刻低温保留（-20度短期（几天）；-80度长久；例外，IP用样品应直接进行IP，防止冻融破坏蛋白质间弱相互作用）。SDSLB煮沸过样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，不然从加样口向下拖带（SDSLB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。在样品制备过程中，另一个需要注意问题是，从样品制备起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微差异经常忽略不计。细胞样品能够先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织大小（称重）开始，裂解液体积都是精准定量，操作过程也尽可能防止蛋白损失。有些人会说能够电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量不科学性，以及裂解液成份对定量干扰。【补充1】：细胞有凋亡或生长速率差异时，有一个最直接方法针对这个问题，实际上将细胞搜集下来以后，经过离心，去除PBS，这时候你能够拿出事先准备好标准体积去比对，误差小于50ul（因为标准品差值能够设定为50ul),所以基本上肉眼偏差至多只有10ul（细胞体积），这种小差异在WB结果中能够忽略不计。其实标准品有多个好处，平时能够用于离心时平衡；能够废物利用一些用过effendorf管。最好不要用纯水做标准品，我喜欢稀释一些SDSLB做标准品，因为有蓝黑色对比下，能够更精准估量体积。这相对比测标准曲线，再一一读值还是快很多；蛋白电泳：电泳胶制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。8%胶能够跑300KDa-36KDa之间任意蛋白，转膜效率对WB结果影响都问题不大。12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果影响都问题不大（300KDa蛋白怎样，没有尝试过）。电泳通常采取恒流，45mA-55mA（应依照电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合gibcomodelV16型，胶宽20cm）。采取恒流优点，确保最快速度完成电泳（电压会逐步增大），省时且降低扩散；不过因为电泳速度过快时会发烧而溶胶，所以你必须想方法散热。散热不好，条带出现波浪状。注意事项：1．聚丙烯酰胺30%母液会降解，要4度避光保留。2．APS会失效，10%APS通常保质期才一个月左右。-20度分装长久保留。3．注意TrisbuffPH值，以及平时所用水PH值。PH值改变会使带型非常怪异，全部蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），假如溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极迟缓，位于胶中上部）4．上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。SDS胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。5．配胶用玻璃板和边条应及时洗净。玻板未洗净坏处很多。尽管玻璃看似平滑，不过一些细微凹陷处会凝结肉眼无法分辨胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易造成不均匀胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。假如是RNA超薄胶，胶板颗粒会造成局部巨大气泡，非常难于去除；蛋白胶也会造成一些小气泡产生。玻板没洗净另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净玻板会减弱和胶体间粘附力，拔梳子或边条时会产生微小错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。为防止拔梳子时错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水愈加好，有SDS润滑）。判断玻板是否洗洁净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。6．上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采取细尖端拉长专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。7．未加样孔应添加高浓度SDSLB平衡，不然最外侧条带会拉宽变形。通常20ul样品（含5ul4*SDSLB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。同理，点markerlane也要加入一样体积LB。LB若在室温放置太久和新鲜在比重上会有差异，在新旧LB靠近地方，条带会拉宽或挤压变形。所以，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。LB应-20度保留。8．增加上样量不一定会提升荧光信号强度。增加上样量后果通常只能是让你内参粘连，全部蛋白条带都扭曲变形。因为增加上样量最多只能提升几倍，而WB灵敏度是以10几次幂量级，全部目标蛋白信号唯一方案就是IP富集（可特异提升目标蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。增加上样量另一个坏处是，原来高表示蛋白，诸如内参，在一样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，这么面积培养板假如裂解液投入太少，回收时损失就太大，上样就极难做到一致），而这种浓度条件下制备样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不能够多上样，再多对WB结果影响不大（没有依然没有），且条带都很丑。9.不一样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。假如一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul4*SDSLB达成常规20ul上样体积；后者第8点提到只上5ul，一样+5ulSDSLB（比重同，不会相互挤压），最好补加10ulDDW使总体积一致。通常这么不一样条件取得样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入8-8.5ul4*SDSLB），这么才能确保每条带都很美观。10.SDSPAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后间隙），用保鲜膜包裹预防液体蒸发，短期室温或稍长久4度保留。个人习惯为，灌好分离胶用饱和正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。两种方案都能够。所以假如预计次日工作量较大，能够提前灌好SDSPAGE。样品是否一定需要定量再上样？——不是，这是浪费时间一个操作。我们首先来讨论一下蛋白定量科学性。蛋白定量首先需要一个参考系（标准蛋白），参考蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓定量是对应于BSA浓度一个参考值。这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射影响；不一样蛋白折叠和构象还会影响颜料分子嵌入。所以你其实默认将全部蛋白等同于BSA在溶液中折叠状态、光吸收情况下，然后做出一个相对判断，这就存在一个“系统误差”——还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。其次，裂解组织或细胞时候，那些裂解液中，一些溶剂本身会使CoomassieG250或者Bradford法（实际也是Coomassie染色）显色，尤其是去污剂之类；比如NP40，就会使Coomassie显蓝色，能够完全覆盖掉蛋白与Coomassie作用产生蓝色。所以，假如你裂解液里面含有这类物质，所谓蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色叠加，根本不会符合标准蛋白曲线线性规律，自然定不准。【需要说明：我现在只知道NP40会这么，因为我们从来不去定量，没有做过更深入研究。】实际上确保你内参一致，是从样品制备开始，上节末尾有提到，不赘述。假如你从制备样品时就注意过定量问题，实际上通常内参差异不会太大。假如真有差异，通常我们会先跑少许样品，目标是让Actin或tubulin更清楚、不会粘连、不会过曝光。从而在第二轮跑正式结果前，依照第一轮内参荧光信号做微调，大致能做到相当；最多可能需要第三轮。以上试验能够精准到0.1ul差异（我很多体外生化试验之前调整酶量就是这么进行，此时根本不可能有足够蛋白让你去定量）。当然凭曝光强弱调整上样量前提是，你WB技术很稳定，很可靠，这是需要相当多经验积累，假如你一时掌握不了，能够让经验更丰富师兄师姐或者导师帮忙。顺便提到，有些人问过用QuantityOne等定量软件对光密度定量后计算差异从而调整上样体积是否能够？——不能够。因为WB结果经过多重放大，精准计量只代表相对于对照组相对比值，与实际比值还是有误差，所以按计算值更改上样量仍会出现偏差。假如非要做定量话，要注意你裂解液配方，把每种溶剂都先加入到显色液中尝试一下，防止那些本身会显色物质出现在你裂解液中；当然，一些物质去除可能影响对组织蛋白提取。所以这是一个两难问题。转印——转印效率对WB结果影响并不如书本和网络上宣扬那么大！首先必须澄清是，很多时候新手会把WB结果无信号归咎于转膜不够充分，实际上转膜效率对最终止果影响所占比重并不高，真正取决定性原因是抗体识别能力强弱，以及怎样正确使用抗体，这个问题下节讨论。有一个简单例证，Biorad提供3mm厚滤纸首次使用时，通常转膜效果不理想（从预染marker深浅可知），但对多数通常丰度蛋白检测没有任何影响（提议少用这种新滤纸做那种含量尤其稀少或者转膜非常困难蛋白）。没有很好策略能够处理这个新滤纸问题；尝试过浸泡（会泡烂）、预电泳（会稍微好点）等等，效果均不理想。通常，最初一两次使用就是用于转通常蛋白。每次用完后清水稍微冲洗一下表面盐分（要控制水流；水流太大，纸张会烂掉），晾干再用；只要没冲烂能够一直重复使用。其次，尽管转膜效率不起决定性作用，但因为WB流程相对较长，所以每个步骤叠加作用会被级数放大，所以在试验每个步骤我们仍会力争愈加好，所以以下仍会深入探讨怎样提升转膜效率。针对提升转膜效率，个人认为最先应该考虑到是仪器选取。这里不是歧视“madeinChina”，国内厂家极少重视不停提升自己产品品质，走低端策略，对于电泳仪这种技术含量不高仪器倒能够凑合；但说到转膜仪，能把一个简单匀场电极做好还真不多（就我道听途说，国外厂家为了使电极之间场强愈加均匀，那种大块金属板表面是镀过极薄白金层）；所以转膜效率和均匀方面孰优孰劣不言而喻。现在，个人使用过国产电转槽（湿转）唯Tanon仿Biorad还能够（算替它们无偿打个广告吧，Tanon仿bioradmini3型电泳仪，在一些方面（主要是操作）上还优于Biorad原装；现在我认为“中国制造”灵魂就是仿造并超越前者）；半干转仪一律进口，用过Biorad、amersham和英国企业scie－plas。PS：批评一下Biorad。Biorad半干转仪，其硬质塑料外壳会莫名其妙碎裂（绝非摔裂、磕碰，因为底面通常放在桌上后除定时需要清洗去除残留盐渍，基本不会移动；即便如此它自然就会碎裂），以致于其关键组件未坏情况下，因外壳碎裂不得不报废该仪器（其外壳里包裹电源线，外壳碎裂，电源则无法接通，造成仪器报废——我们先后买过3台都是这么毛病，其间间隔了3年，不能必定最近Biorad有没有改进这个问题；假如没有，我想市场迟早会被其余企业所取代）对这三款产品，Biorad外壳有显著质量缺点，轻易过早报废；amersham独特蜂窝式设计确实对转膜效率有所提升，但蜂窝式使得与“三明治”接触面降低，电转时散热不太好，做大蛋白（半干转仪也能够做大蛋白转膜，效率确实不如湿转，但抗体好、蛋白丰度通常时仍可采取）长时程（3hrs）转膜需要在4度冰柜或coldroom进行；英国产品，价格较高，企业不太知名国内不一定有代理，但质量和散热都非常好。这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合全部蛋白，转膜效率最好，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小蛋白转染操作时间长于半干转（下文会详细给出条件）；半干转适合分子量较小蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小怎样界定呢？习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其余均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。所以，通常对大蛋白转印多数人会选择长时程湿转，那么刚才提到amersham半干转仪缺点实际上没太多实质意义，何况还能够外加条件填补；而且用半干转做大蛋白转印原来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB结果不起决定原因。湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液能够重复使用数次（30V，～35V附近时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK，即使整张大板胶室温电转3hr以后，最大电压仍为18V（所以足见其散热性能优良）。注明：以上半干转仪时间要求是针对PVDF膜，这里面有一个很有趣问题。尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白截留更高（但NC带负电性，理论上它吸附量应该更高，所以通常一样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子截留显著不如NC膜，所以交联在预染marker上颜料小分子很轻易穿过PVDF膜，造成转膜过分假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也能够考虑增加marker上样量）；NC膜没有这种问题，所以通常它转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，电流控制在200-300mA（16cm*9cm大胶300mA，假如胶面积小很多能够考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜地方，在我看来是它强度：干燥膜易碎。当然现在一些厂家为处理这个问题，将NC成份涂在另一个介质表面，这种膜支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有显著正反面；所以制作转印三明治时候要尤其注意正反面。另外，20KDa以下蛋白宜采取0.22uM孔径转印膜，但也不是一定必须。对于大蛋白转印，很多书本提议采取低浓度胶，如6%SDS。但实际操作发觉，6%太软，制作转印三明治操作非常麻烦；且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右，除非采取坛子上有些人提过灌不一样浓度胶或者梯度胶，不然需要同时跑两块胶，所以也不是很推荐。个人经验认为300KDa以下8%胶（底边36KDa）都能够胜任，能够适当调整选择7-8%胶能够兼顾内参和大蛋白。转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有详细要求，但用预冷过电转液湿滤纸比未预冷转印效率更高。所以，有条件提议湿转、半干转均在低温（4度）进行。另外，湿转缓冲液能够考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2hrs，不然电泳液冻结；mini3型有内置冰槽，冰槽置-80度预冷。制作转膜三明治过程中，书中强调过滤纸、胶、膜大小最好一致，不然没有胶、膜隔开部分滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带滤纸有限，假如每次都切割新滤纸，消耗过快、首次使用膜转膜效率不高，且增加额外操作。所以，实际上滤纸大一些也不太要紧，不过我会选择已经切割好和胶面积最靠近滤纸；通常膜大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。操作时在确保每一层均无气泡前提下，叠好后再碾压几个往返，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压目标不是为了驱赶气泡（完全能够做到叠加时候每一层都无任何气泡；诸如采取多层薄滤纸时能够一张张叠加），更主要作用是让膜和胶贴得更紧密。能够了解是，对于蛋白分子大小而言，胶和膜之间间距是数十万倍计，所以更紧密接触无疑是转膜成败关键。胶和膜需不需要泡呢？不少企业试验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有发觉泡和不泡转膜效率有多大差异。实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可（能够降低与滤纸或者膜之间气泡）；而膜也只要湿掉沾上电转液即可，一样多沾些缓冲液会有利于降低气泡（PVDF要先用甲醇湿润再投入缓冲液；NC直接进缓冲液）。怎样监控转膜效率呢？在早期，鄙人亦依据分子克隆介绍，采取立春红染膜。只是日后发觉此操作不但增加额外操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。首先，立春红（也包含考染胶）灵敏度和HRP-ECL体系灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提醒WB结果会不会失败（考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染），你依然得继续后面操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提醒靶蛋白就转膜完全了，可能只是另外一个分子量大小相近蛋白。所以，不论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续操作。而立春红染胶不但增加额外操作时间，而且增加一轮漂洗操作，对膜和膜上蛋白都不好。那么为何不采取更直观预染marker做转膜监控依据呢？理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上，所以颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外操作（固定marker上样量非常必要）。当然上面提到针对PVDF膜，因为对小分子截留局限，颜料分子会在高强度转印过程中从交联蛋白上脱落并穿过膜（颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉；太紧（多）可改变蛋白构象使迁移率改变。所以多数情况下颜料和蛋白之间是一个不稳定交联，这意味着在一些条件下，颜料会从交联蛋白上脱落，又因为膜分子孔径以及膜对不一样物质吸附能力差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸反面，而蛋白则被牢靠截留在膜上），造成转膜过分假象。现在你知道有这种局限，要么更换NC膜；要么采取上面提到非常稳定转膜条件、注意必要细节，就可从根本上忽略掉其对转膜效率指示，而把预染marker仅仅作为一个分子量大小指针，当然同时可确认之前转膜操作无误（没有插反电极，放反膜），也可为后续抗体孵育操作时膜正反面做必要提醒。不一样企业预染marker效果不太相同，通常NEB和invitrogen常规分子量预染marker要上8-10ul，MBI只要5ul（胶大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul转膜后就足够清楚。抗体孵育——WB真正难点：抗体使用是一个艺术，一个抗体一个脾气。对WB结果有决定性影响原因是抗体效价和假如正确使用手中抗体。不论你怎样提升自己转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍差异，而抗体效价能够差数千倍以上；一样，正确使用抗体能够确保抗体效价不被过分拮抗，寻求特异性和非特异性背景之间差异最大化。封闭最短能够缩减到5min：很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经常看到坛子上很多人这么给人答疑，非常无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无步骤，真正对降低背景起关键作用是抗体稀释液中组分。当你抗体使用次数较多时，基本不用封闭也能够有较低背景；假如抗体很新，其实封闭最短能够缩减到5min（没试过更短，不一定不能够）。那什么造成高背景甚至黑板呢？抗体质量不太好（主因），或者抗体稀释液配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改进）。封闭液配方能够和抗体稀释液相同，也能够不一样；通常封闭液是最简单（单方）抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。封闭极少出情况。不过在milk做封闭剂封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。紧接封闭操作是抗体孵育，之间不要用TBST漂洗。抗体孵育成败关键首要在抗体本身质量，包含抗体效价和背景强弱，然而一向商品化抗体质量参差不齐。各家生产抗体中质量问题最严重是scbt抗体，但它们价格却是最廉价。其实，scbt在美国售后服务还是相当不错，只要按他们要求操作依然能举证抗体质量问题，能够更换、交换（你指定他们销售另外一个抗体），有时候还会附送一些ProAbeads之类，所以不奇怪它普及率；也正因为此，假如你参考文件话很轻易找到这家企业。可惜，在国内代理商不可能提供对应服务，所以购置他们商品存在不小风险。所以，通常我更推荐sigma和Abcom、R&D等。诸如Sigma企业销售Actin，cat.A5316，cloneAC-74，Mab更是作为新手练习专用抗体；它背景很低，效价很高，能够1：30,000稀释（是普通一抗效价30倍）。另外，尽管cellsignaling是做磷酸化抗体起家企业，但它们抗体质量总体感觉也不好，所以有其它企业能够选择时，我们会刻意防止购置cellsignaling产品，诸如Akt总抗和Ser473（这两种抗体R&D产品效价不错）。（尤其注明：前几年CSTAKT抗体识别条带在55KDa左右，而其余企业均认定为60KDa；最近还有战友提问这个抗体，重新检索了一下，应该是原AKT抗体（包含磷酸化）已经被CST自己下架了，从现在几个抗体示意图看，大小也已与其余企业一致；所以，要不要买取决你自己）抗体企业在出售抗体时候，在广告上会玩很多花样。A.不给整张膜标识图示。很多抗体质量不好，背景高杂带多，假如靶蛋白区域较洁净时，他们通常只给很窄一条靶蛋白区域图例。B.不给内源性蛋白标识图示，用IP样品取代。经过IP能够富集抗原，降低杂蛋白，通常很轻易拿到背景很洁净，信号很强图例。C.用制备抗体时高表示多肽做阳性样品，不给全长蛋白图例。因为多肽能够IP富集，且不存在空间折叠问题（通常裸露在外），所以很轻易标识。除以上花样外，不少抗体用途上还有局限，所以挑选抗体时要睁大眼睛。另外，有一点值得注意是，scbt销售抗体表面上很多（通常1ml，而别企业通常是200ul或者100ul），然而实际上它浓度也仅为0.2λ，所以实际上他们抗体质量也和其余企业没区分都是200ug（常规）。所以在早期，我一直强调假如固定即用型一抗浓度（稀释一抗）为1ug/ml时，scbt抗体最好稀释比为1：200。不过最近发觉，实际上他们抗体1:2K稀释效价也不错，所以可能其余企业一抗能够深入提升稀释比。现在判断当初scbt抗体之所以采取1:200稀释，实际上是因为自制ECL不够灵敏，所以提议用灵敏性愈加好ECL，这么能够降低抗体消耗量，深入降低试验成本。一抗通常4度过夜，效率较常温1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀释，室温0.5-1hr（过久并不会显著提升信号强度甚至会减弱（相当于洗膜），同时造成高背景深入影响特异与非特异荧光信号强度间对比。孵育时间过久还会迫使你延长TBST时间，这反抗原识别能力较弱抗体更致命）。洗膜通惯用TBST，也能够考虑高盐洗膜液（NaCl0.5M）；洗膜时间通常10min*3或者5min*4。抗体孵育和洗膜时，摇床速度不能过快也不宜过慢，需要简单探索一下。聊完以上那些浅显基本常识，接下来谈我认为最麻烦：首先，抗原抗体识别原理物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合动力学过程。因为抗原和抗体特异性结合效率是非特异性结合数百万——数十亿倍，所以当特异性抗体与非特异性‘抗体’（不好描述，指添加在抗体稀释液中封闭蛋白，我们能够把它们看成非特异性一抗）竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白浓度是一抗浓度20K：1以上，在碰撞几率相同条件下，因为时间积累加孵育过程中重复漂洗（孵育抗体要摇摆，对吧），特异性一抗积累了识别、结合优势。一样在TBST等漂洗情况下，因为亲和力等原因，使得一抗很牢靠并深入增加对比优势，再经过2抗特异性积累和ECL最终放大形成特异性条带和非特异性背景之间荧光信号巨大差异。由以上碰撞结合、亲和力差异这些基本现象，我们能够解释WB中出现现象。1.在样品制备章节中，我强调PBS漂洗去培养基中BSA作用。当初只描述了不漂洗后果，是在BSA位置任何抗体都能够非特异性结合从而显影。用碰撞原理去解释：当杂带很浓时候，抗体特异性已经毫无意义，它只符合物理定律中碰撞几率原理；因为你杂带浓，碰撞几率大，粘附一抗机会多，所以它就会显出来，但切记这是杂带。当杂蛋白含量高到一定程度，“任何”一个一抗都能够在该位置显出条带。所以，用条带深浅去判断是否是靶蛋白，这是非常不科学。在默认抗体有效情况下，假如抗原靠近区域没有杂带，背景洁净，依据分子量大小能够初步确认靶蛋白位置；假如有杂带，并不一定是特异性条带就比杂带亮，可能杂带蛋白浓度大，非特异性粘附一抗更多。现在判断杂带和靶蛋白唯一标准是分子量；而当分子量大小类似时，只有经过增加过表示或IP纯化样品做阳性对照，或者KD该蛋白样品做阴性对照一起电泳转膜，才能准确区分靶蛋白和杂质。（用IP或KD样品也是验证商品化抗体是否有效可靠方案）2.WB结果白板（无信号）和黑板（高背景）。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题（当然也可能与ECL显影关于，此点下一节有阐述），白板主要是可能是抗体本身效价不高，或者抗体稀释液中封闭蛋白过多，竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性一抗，特异性条带和非特异性背景一样结合强度——无信号。黑板，也主要是因为抗体效价不高，而抗体稀释液中封闭蛋白拮抗作用又没有完全发挥，此时无法有效识别抗原一抗会等效粘附转印膜任何位置，显影后整张膜全黑。有时候膜靠近全黑，但能够若有如无观察到靶蛋白，出现问题原因即使仍是抗体效价不高，封闭蛋白不能完全起到作用，不过此时能够经过改变抗体稀释液配方，提升特异性和非特异性结合信号差异，降低背景。“这点非常主要”——当你抗体标不到抗原时（白板），先弄出条带（黑板），再处理黑板（高背景）问题。第一步应该是经过倍比降低一抗稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。；注：二抗稀释比不要轻易改变，增加二抗浓度对WB结果不会有太显著改变），探索到一个能够标出信号条件。此时，因为一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景问题能够再调整，有没有特异性条带却没方法改变；实在没有靶蛋白信号，只能更换别企业生产抗体。那么怎样经过改变抗体稀释液配方，寻求抗体孵育最好条件呢？首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用配方；一个抗体一个脾气。其次，抗体稀释液配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原强度，以及对其余区域封闭强度两方面平衡。现在，抗体稀释液中能够充当封闭蛋白主要有milk，BSA和gelatin，似乎极少样子。。。可是，你有没有考虑过“复方”？——这下配方无限多了吧。1.采取milk，BSA和gelatin单方。3%milk，5%BSA，<=0.4%gelatin，并依照实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过假如你翻翻抗体企业卖给你原装抗体里面液体配方，你会发觉很多抗体溶液里都有它。2.很多情况下单方浓度很高了，背景问题仍不能处理。那么请尝试两两或者三种不一样百分比混合。不过有些细节还是要自己探索，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提升（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，造成白板），BSA浓度较随意。3.抗体稀释液可用低盐浓度TBST，也可用高盐浓度缓冲液（NaCl0.5M）以降低背景；不过切记，有抗体对盐浓度敏感，包含构象和溶解度，所以需要尝试。假如以上策略依然无法处理高背景，可将稀释好一抗先跟平时试验剪切下来membrane边角料（新）放在一起孵育个把小时再用。假如还不行，彻底无解，结论抗体太差；请更换别企业或者抗别区段同种抗体。这三种封闭蛋白差异：milk和gelatin封闭效果不错且价格廉价，但milk轻易发霉变质，且国产milk脱脂不充分亦增加背景、拮抗抗原抗体结合（拮抗与抗原结合尤其突出；更不知道三聚氰胺会不会影响抗原抗体结合或者ECL！？）；BSA封闭效果不佳，且价格较昂贵。个人推荐gelatin，gelatin主要成份是骨胶原，蛋白很大，但能够经过加热打断成小蛋白，从而实现封闭各种分子量大小蛋白。通常，我会将gelatin加到TBST中后直接灭菌，灭菌过程中，不溶gelatin会逐步溶解；因为gelatin能够灭菌（milk不能够），所以一样条件下，gelatin存放时间显著长于milk。实际上，抗体能够重复用很久（通常通常抗体常规稀释比，能够连续用一个月以上；对于老手用过2、3次旧抗体更prefer，所以背景降到很低而效价正是最高时候），通常抗体最终失效原因不是因为使用次数过多，而是染菌；比较旧抗体都会有很多沉淀在底部，更长时间还会有异味。稀释一抗靠添加NaN3并于4度保留延长使用时间；二抗不能加NaN3，但放在-20度重复冻融延长使用寿命（抗体并非绝对不能够冻融；只是高浓度原始管抗体冻融对效价会有较大影响）。抗体稀释液（一抗、二抗稀释液也可同也可不一样）和封闭液能够相同，能够不一样，因为抗体稀释液能够采取复方，所以即使混合了少许，不会反抗体使用产生较大影响。不过封闭液用milk时，gelatin稀释一抗混入少许milk会影响其使用寿命。因为以上很多可变原因，实在无法总结出一个万金油式抗体稀释液（只能是多数通用），所以对待详细问题时，请详细对待（多花点心思探索吧）。原装抗体保留：1.分装。每次一管，不过可能太多占地方，而且还会有粘壁损失，不是很推荐。2.1：1加甘油，冻于-20度，可长久保留，此方法实际上也被很多国内试剂企业广泛采取，诸如博士得，中杉，它们小包装进口抗体通常都是1：1添加甘油保留于-20（不信去查查）。值得注意是：不是全部抗体都能够1：1添加甘油，要以抗体说明书为准，假如说明书中本身存在甘油，或特殊注明外，通常能够采取。显影——淬灭祸因当抗体孵育、TBST漂洗结束后，进入ECL显影步骤。当然，现在国内一些试验室已经换用仪器扫描荧光信号，而我们更是二抗直接连荧光蛋白连ECL和常规底片显影都省略了，所以以下所讨论一些细节问题可能不再出现。首先坛子上还有少数试验室处于DAB显色时代，规劝一句，都走到最终一步了就不要节约了；DAB显色灵敏性是远远不够。现在较为流行仍是化学发光法，下面简述一下其原理：交联在二抗上HRP酶能够特异水解过氧化物产生化学能；ECL中主要包含两种成份，催化剂和中间递质（白色瓶子主要是过氧化物如双氧水）。催化剂作用不用废话了，其中间递质主要是吸收化学能并将其传递到luminol之类化合物上产生电子跃迁从而激发荧光。所以催化剂效率和中间递质传递效率直接影响荧光强弱。本人曾自制过ECL并尝试改良，其间发觉很多化合物、金属离子如Fe、Cu等能催化并高效传递能量，且不依赖于HRP浓度，荧光信号能瞬间曝强；这其实与下文提到一些粹灭原因有联络。当初我自制ECL最大毛病在于稳定性不好，同理，商品化ECL一样也有保质期问题，往往最先失效组分就是过氧化物，尽管他们必定添加过抗还原剂。其实，检验ECL是否失效方法很简单，取稀释即用型二抗1-2ul加至ECL混和液中观察荧光强度，即可知道ECL是否失效。商品化ECL价格并不廉价，所以ECL孵育最好方案是：将ECL滴加在保鲜膜上或洁净支持物上，如废弃旧底片、塑料盒，有机玻璃盒等等（注意，国产保鲜膜很多质量不过关，有两种潜在问题，下面详述），然后倒扣膜于保鲜膜上，夹住一个角往返拖动数次至ECL均匀（有产品说明书要求孵育1min）。另外平铺一张洁净保鲜膜，将膜揭下控干ECL、倒扣包好，然后显影。mini3型胶整张膜孵育，ECL总体积0.7-1ml足矣。哪些原因会影响荧光信号强弱呢？（这部分实际上与造成荧光淬灭原因部分重合）1.保鲜膜质量。a.国产保鲜膜，很多厂家偷工减料打价格战，造成保鲜膜很薄亦破损。ECL滴加到保鲜膜上轻易从肉眼不易分辩小孔泄露，首先ECL反应不充分，另首先ECL所含液体会溶解试验台上残留未知化学药品颗粒（可能你或其余人曾经不小心打翻过某种化合物）、灰尘等等，造成荧光淬灭。在简述原理时，我曾经提到过很多化合物、金属离子能直接催化过氧化物水解，在极短时间内消耗掉全部HRP酶，荧光转瞬即逝。b.保鲜膜化工原料或拉制过程中，残留未知化学试剂，引发荧光淬灭；廉价保鲜膜问题尤多。现在，国产就“妙洁”比较过关，保鲜膜厚度和化学物残留都不影响ECL显影。假如买不到合格保鲜膜，也能够用其余物品代替；但要尤其注意这些支持物表面洁净，最好不要有任何化学试剂残留，包含风干TBST盐结晶颗粒。2.ECL孵育结束后膜需要控干。中学物理学过水会吸收光谱，所以任何液体包含ECL溶液本身都会干扰荧光强度，所以ECL孵育结束时需要控干。通常夹起膜，让膜一角或一边接触吸水纸；不过请注意不能让膜完全干掉。一些信号较弱ECL，膜彻底干掉后荧光会消失；很好试剂盒，荧光相对稳定，但完全吸干以后，背景荧光也会升高，而且会严重影响重新标识新抗体时背景。所以，按照我方法，让自由流下多出ECL被吸走就好。3.控干膜要仔细用保鲜膜包被，预防接触外界异物造成荧光淬灭；同时，包裹保鲜膜时要细心，尽可能不让正面保鲜膜和膜之间出现皱褶。皱褶地方会堆积多出ECL，要么形成一条荧光亮线；要么因为液体吸收荧光或者局部区域HRP过分消耗，呈线条状淬灭。4.在膜放入压片夹之前，最好肉眼观察一下荧光信号强弱，这有利于判断试验可能出现问题。很多人提问看见很强荧光了，但怎么压片都没有信号，那么就是快速淬灭（闪灭，再怎么快速操作也拿不到这种情况下荧光信号）造成；有这个观察最少能够判断ECL孵育之前试验操作应该问题不大，而问题主要是淬灭。假如你省略这个步骤，那问题就非常复杂了，因为之前任何操作都可能造成白板，根本无法判断。除上述问题以外，还有哪些原因会造成荧光淬灭呢？1.抗原浓度太高，荧光信号过强，快速淬灭。在电泳章节就曾提过，假如上样量太大，不但条带会粘连、弯曲，更可能造成淬灭。因为局部区域过多HRP酶会快速消耗底物呈富氧态，条带出现烧灼样（取出膜会发觉一条显著暗黄色带），荧光信号会闪灭或者条带空心（条带灰黑不实，则可能是显影液靠近失效）。2.抗原浓度太低，荧光信号太弱，相对慢一点淬灭。可能第一次压片能够取得很弱条带，随即都不可见。3.ECL试剂质量。除过氧化物因接触空气被逐步还原外，ECL成份通常都不稳定。如呈递电子跃迁能中间递质其化学性质就不太稳定，因为它转换能量特征决定其必是一个有中间态化合物，长久接触空气会被逐步氧化失效；luminol也有保质期。4.操作时间过长，膜逐步彻底干掉。商品化ECL会出现波形渐变，开始信号逐步增强，背景一起升高；随即荧光完全衰减淬灭。5.不良试验习惯。坛子上曾经有些人问及淬灭问题，提到显影夹子很脏。脏显影夹主要有两种污染，铁锈和不慎沾染显影液、定影液，前者造成闪灭（催化作用），后者可能直接造成无荧光；只要有任何失误，诸如不小心刮破保鲜膜，保鲜膜包裹不严实（其实通常还真不严实，因为你不可能包裹好几层）。于是，我问他用一个很脏东西不以为很别扭嘛，为何不先抄起抹布擦洁净再用呢。6.淬灭假象。少许沾在膜表面二抗也会激发荧光，但ECL孵育时稍微晃动就消失了，可能产生淬灭错觉。Stirpping：完整WB流程结束后，可能需要重新标识一些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不一定必须，那么首先讨论一下stripping必要性。Stripping排除其余不讲，整个流程会花费不少时间，从节约时间角度来讲能不做最好；而且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面抗原使WB最终信号减弱；另外，strippingbuffer未去除洁净时，其中一些组分一定会干扰第二种抗体结合。那么在什么条件下不需要stripping呢？1．当A蛋白和B蛋白分子量差异5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标识不一样抗体），这么就不需要stripping膜重新标识，且一次就能得到想要结果。有些人会将两种抗体混在一起标识整张膜，这么操作前提是非常熟悉这两种抗体杂带位置，且各自杂带都不会干扰目标蛋白才能够如此操作；而且这么抗体下次使用有了不足，所以不太推荐。2．两种抗体种属起源不一样时，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非常靠近无法切膜，这时候也不一定需要stripping。轮番标识这两种不一样抗体时，只需要用TBST涮掉表面ECL，时间可长（一时腾不出手来就扔在那边一直漂，中间能够换换液）可短（换液涮两三次），然后直接用第二种抗体标识同一张膜。不过，假如其中一个蛋白显影太强，隔天显第二种蛋白时可能会出现干扰（可能强可能弱）；但只要两个蛋白不是一样大小或者连在一起了，能够在最终作图时用PS切出来。3．当两种抗体种属起源相同时，有一个情况也不需stripping，诸如标识某蛋白磷酸化和总蛋白时。因为磷酸化抗体通常识别能力较弱（相对于总蛋白而言），信号通常都不太强，此时也仅需简单漂洗；但标识次序一定是先标磷酸化后标总蛋白。以上防止stripping主要从节约时间原因考虑，实际上当上述2、3点存在时，个人还是会用strippingbuffer简单漂一下，然后用TBST换液漂洗3次再上第二种抗体；但假如时间较紧，就会真省略。Stripping膜最少有三种方法：A．用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就能够去除多数蛋白信号，信号过强蛋白如内参除外。所以，当你抗体非常弱时候，孵育过夜实际上相当于stripping，新信号不会出现，原来信号也会被漂洗洁净，出现白板。B．请参考milliporePVDF膜附送说明书配方（没有，请谷歌），上面提到假如信号很强，能够在50度反应。需要提醒是，因为巯基乙醇亦挥发，能够考虑暂时添加。C．假如做过IP，你就知道能够用低pHGlycine-HCl洗脱beads上特异性吸附蛋白。同理，0.1MGlycine（pH2.5,30min）也能够用于stripping膜，这是已知最廉价高效洗膜方案。而且经过TBST（10min*3）漂洗后，膜上pH早就恢复到正常值，此时不存在上述strippingbuffer残留成份干扰第二种抗体标识情况。假如第一个蛋白信号过强，一样能够在50度stripping提升洗膜强度。另外，膜风干后，表面结合二抗也会脱落，不过不是很推荐。看完stripping这个部分，再多想一层，你一定会找到同一张膜数次标识不一样抗体窍门。假如有A、B、C三种蛋白，因分子量过于靠近无法切膜：a.假如A、B抗体同是兔抗，C抗体为鼠抗，则最合理标识次序为A-C-B或者B-C-A。b.A、B、C抗体同种起源，A、B几乎在一起，条带粘连；C靠下。假如A、B主要性差不多、B信号稍弱，则B-C-A；假如A结果是最关键，尽管B信号弱，通常还是A-C-B。因为，经过两次strippingbuffer洗脱，且两轮WB流程时长都超出8hrs（一抗习惯4度过夜孵育），实际上在标识第三种抗体时，相对于经历了3次不一样强度stripping；不要担心第一个抗体还会有很强干扰。怎样正确使用QuantiyOne定量：（以下文字系摘录+改写整合）WB做完，有时候我们需要对结果进行定量。现在最备受推崇应该非Biorad企业QuantiyOne软件莫属，然而其$6K左右售价令很多人望而却步；不过，这款软件之所以敢如此漫天要价，其最大优点莫过于自动识别条带代替人工分析以降低主观误差，同时它很多功效渗透了艰深数理理论以及概率统计原理，这在其它各类无偿随机附送蛋白定量软件上是乏善可陈。不过，令人扼腕是，又有多少人真只是把它当做一款普通“无偿”软件在使用着——暴殄天物。现在多数无偿软件主要采取是等高线定量法（VolumnContour），QuantiyOne也包含这部分内容且在网络教程里面流传最广，以至于很多人只会这种并不准确蛋白定量方法。等高线定量法经过半自动描绘电泳条带等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总信号量。这种分析方法有显著弊病：人为圈定背景值且假定不一样泳道背景亮度一致；等高线绘制处于“半自动”状态，即需要人为判断作为等高线标准电泳条带边缘；最致命是在几个电泳条带距离十分靠近时候几乎无法绘制单一条带轮廓（常出现连续几个条带等高线相连而无法分离出单独条带轮廓）。实际上，最科学、严谨蛋白定量方法应该是泳道/条带轨迹定量法（TraceTracking）。这种方法使用起来步骤较为繁琐，必须经过泳道识别电泳条带识别这两个连续步骤才能进行定量。但它最大优点在于能够完全抛弃人为主观原因进行全自动定量。他定量方式为：首先依照不一样电泳条带光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带定量依照。其次，它能够最大程度排除不一样泳道之间背景差异，让各个泳道上不一样电泳条带在一条几乎相同起跑线上进行对比；这个背景排除功效是等高线法无法做到。最终，采取泳道/条带轨迹定量法分析条带光密度后，再结合GaussModelBands对电泳条带进行数理统计。执行步骤：因为QuantiyOne只能识别黑白TIF文件，而实际上发表论文时，很多杂志也要求提供TIF等格式图片而非JEPG格式；所以，考虑到这两层原因，我提议大家从一开始扫描就统一存贮为TIF格式图片。1.创建泳道：a.打开我们要分析电泳图片（以蛋白质电泳为例）。b.选择“Lane-AutoFramelanes”。这时假如您电泳图片比较标准话，QuantityOne就会自动识别出每条电泳泳道位置，而且将各个泳道路径用一条红线标画出来；假如您对软件自动标识泳道不甚满意，您能够经过“Lane-EditFrame”下级各个子菜单提供功效对泳道框架位置、大小等进行调整；调整方法就是经过鼠标拖放来实现。假如您只需要分析其中几个泳道数据而不想其余泳道标识干扰您视线，您能够经过“Lane-SingleLane-RemoveLane”删除您不需要泳道标识。注意：不是全部电泳图片泳道都能够被QuantityOne自动识别。在不能自动识别情况下，QuantityOne就会弹出对话框告诉您它不能识别泳道。这时大家就需要手工绘制电泳泳道。方法和上面一样，同过“Lane-SingleLane-CreatLane”来实现。只要用鼠标在您电泳图片上顺着待标识泳道中轴线拖放就能够绘制出该泳道标识红线。2.不一样泳道背景排除：我们要将我们电泳图片进行前面谈到泳道识别，不论是自动方式还是手工识别。然后选择“Lane-LaneBackgroud...”命令。选择该命令后，鼠标即变成一个绿色“+”，将鼠标移到您打算进行背景排除泳道，点击左键一下，立刻就会弹出以下列图所表示对话框。其中“OpticalDensity”显示得是该泳道光密度值分布情况。大家会注意到这个分布曲线并不是紧贴着纵轴，而是位于纵轴上方分布。造成这个“悬空现象”原因就是该泳道本身存在着一定光密度“背景”。这个背景存在造成该泳道上各个电泳条带之间不能处于同一水平进行对比；假如考虑到相邻其余泳道更是因为不一样背景存在而无法对比不一样泳道上不一样电泳条带。怎样去除这个背景呢？我们继续看右边“LaneBackgroudSubstruction”对话框。这个对话框上方“AllLanes”表示能够对全部泳道进行一次性处理；下方“SelectedLane”表示仅针对此次选中这个泳道进行处理。我们用鼠标选择“SelectedLane”“LaneOn”选项。然后在下面“RollingDiskSize”里填上“5”，再按“回车”键。大家再来看看现在“OpticalDensity”中出现了一条紧紧沿着光密度曲线分布酱色曲线。这条曲线将泳道背景与电泳条带光密度分布十分精准划分开来。注意：“RollingDiskSize”是什么意思呢？实际上就是数理里面微分等差迫近。我们能够将QuantityOne提供去除背景功效想象成是一个滚动小球。假如这个小球半径越小，那么它沿着光密度曲线滚动时滚过路径就越发精细，详细反应在酱色曲线轨迹越发靠近黑色光密度分布曲线基线。所以从理论上来说“RollingDiskSize”取值越小，它去除背景效果越好。大家能够试着选择一个较大值比如80，再来看看此时酱色曲线轨迹。当然也不能取太小值。因为假如取值太小，大家能够想象这个十分微小球就会滚入光密度曲线内部，造成有效阳性信号损失。个人感觉5~20是一个比很好取值范围。我们能够对每条泳道依葫芦画瓢进行以上类似背景排除工作。不过有时候假如大家以为能够使用一样标准，即相同“RollingDiskSize”进行排除，那么我们能够在“LaneBackgroudSubstruction”对话框中选择上方“AllLanesOn(samelevel)”选项。然后在“RollingDiskSize”中填上一个适宜值，点击“Done”按钮确认就能够了。此时该电泳图片上全部泳道都以相同标准进行了背景去除。3.创建条带：前面我们已经识别和分析了电泳图片泳道，下面我们开始研究电泳条带问题。首先在这里明确两个名词翻译：“Lane”指电泳泳道；“Band”指电泳条带（在下文中一律使用这两个英文名词来表示这两个意思）。a.电泳条带识别：和前面研究Lane一样，首先我们要对Lane上Band进行识别。识别方式一样分为自动识别和人工识别。自动识别时候选择“Band-DetectBands...”命令。这时QuantityOne会自动弹出一个“DetectBands”对话框。注意：第一次用QuantityOne时，您Bands识别以后仅仅是画出了一条红色粗线，而在上面演示图片中却是上下括号形式。其实大家能够在“Band-BandAttributes”选项中设置Bands显示形式。在下方“Style”选项卡中选择“Brackets”就会将原来粗线改为括号形式了。b.假如要自动识别全部Lanes上Bands就钩选Lands后面“All”选项；假如仅仅想自动识别某一条Lane上Bands就钩选“One”，然后在后面输入框中填上您想识别泳道号码；假如仅仅想识别泳道上部分光密度值最强Bands，能够在“Bands”后面选项中选择“Limit”，然后填上对应数目（比如10）。QuantityOne就会仅识别该泳道上光密度最大10条Bands；假如您发觉自动识别Bands宽度太窄，圈定Band红色括号内范围小于黑色光密度影。此时能够使用“LaneWidth”命令来调整Bands识别宽度。用鼠标点击“LaneWidth”后面向上箭头就会发觉红色括号逐步变宽，最终要求其范围略为宽过其包绕Band影迹；假如您发觉自动识别功效没有识别您想要Band或者误识别了您不想要Band，您还能够使用上面工具栏进行“添加”或“删除”。将您鼠标指向每个图标，QuantityOne就会知道弹出一个黄色提醒信息告诉您这个按钮功效。4.高斯建模与结果分析：a.高斯建模，即用数学方法（微积分）对正态分布曲线进行统计分析。理论上每道band光密度都呈正态分布平滑曲线（每个band中间位置蛋白压缩最紧浓度最高，向上向下因扩散而减弱）；然而实际操作过程中，假如荧光过强，往往出现类似方波曲线（曲线无peak峰，上方为平滑直线，超识别最高阈值）；荧光较弱宜出现波浪样（多）波峰，或难与背景区分。首先电脑会统计band中每个点光密度值，并对这些值按正态分布进行归类，当读值不符合正态分布原理时，电脑会自动做出选择以对偏离正态分布数据进行统计学取舍（置信区间），从而最终优化光密度曲线呈正态分布。怎样进行高斯建模呢？很简单，只要执行“Band-GaussModelBands...”命令就能够了，执行后QuantityOne回弹出一个对话框问您要对那条泳道进行高斯建模。请钩选“One”，然后再输入需要建模泳道代码就能够了；假如选择了“All”则对全部泳道进行高斯建模，当然建模这么多泳道会费一点时间了。b.观察结果：执行完高斯建模以后使用“Band-BandInformation”命令来观察结果。方法是将变成蓝色惊叹号鼠标移到刚才已经识别Band部位，一个详细“BandInformation”信息框就会立刻弹出来。在这幅图中我们必须注意是“Trace”和/或“GaussModelTrace”，因为我们刚才辛劳了半天就是为了得到这个数据。这个数据表示就是Band光密度分布曲线下面积，也就是QuantityOne用来表示Band内分子总量方式。最终，我们计算、统计值，应该是“GaussModelTrace”这一栏读值。Stirpping：完整WB流程结束后，可能需要重新标识一些膜，这时候就“可能”需要对膜stripping。这里用了“可能”二字，即不一定必须，那么首先讨论一下stripping必要性。Stripping排除其余不讲，整个流程会花费不少时间，从节约时间角度来讲能不做最好；而且stripping条件过于激烈或多轮洗脱时，还会剥离已转印到膜表面抗原使WB最终信号减弱；另外，strippingbuffer未去除洁净时，其中一些组分一定会干扰第二种抗体结合。那么在什么条件下不需要stripping呢？1．

当A蛋白和B蛋白分子量差异5KDa以上（10KDa左右更保险），可将膜分割开（分别标识不一样抗体），这么就不需要stripping膜重新标识，且一次就能得到想要结果。有些人会将两种抗体混在一起标识整张膜，这么操作前提是非常熟悉这两种抗体杂带位置，且各自杂带都不会干扰目标蛋白才能够如此操作；而且这么抗体下次使用有了不足，所以不太推荐。2．

两种抗体种属起源不一样时，如鼠抗、兔抗等等，即使蛋白位置非常靠近无法切膜，这时候也不一定需要stripping。轮番标识这两种不一样抗体时，只需要用TBST涮掉表面ECL，时间可长（一时腾不出手来就扔在那边一直漂，中间能够换换液）可短（换液涮两三次），然后直接用第二种抗体标识同一张膜。不过，假如其中一个蛋白显影太强，隔天显第二种蛋白时可能会出现干扰（可能强可能弱）；但只要两个蛋白不是一样大小或者连在一起了，能够在最终作图时用PS切出来。3．

当两种抗体种属起源相同时，有一个情况也不需stripping，诸如标识某蛋白磷酸化和总蛋白时。因为磷酸化抗体通常识别能力较弱（相对于总蛋白而言），信号通常都不太强，此时也仅需简单漂洗；但标识次序一定是先标磷酸化后标总蛋白。以上防止stripping主要从节约时间原因考虑，实际上当上述2、3点存在时，个人还是会用strippingbuffer简单漂一下，然后用TBST换液漂洗3次再上第二种抗体；但假如时间较紧，就会真省略。Stripping膜最少有三种方法：A．用TBST一直洗膜，洗8hrs以上就能够去除多数蛋白信号，信号过强蛋白如内参除外。所以，当你抗体非常弱时候，孵育过夜实际上相当于stripping，新信号不会出现，原来信号也会被漂洗洁净，出现白板。B．请参考milliporePVDF膜附送说明书配方（没有，请谷歌），上面提到假如信号很强，能够在50度反应。需要提醒是，因为巯基乙醇亦挥发，能够考虑暂时添加。C．假如做过IP，你就知道能够用低pHGlycine-HCl洗脱beads上特异性吸附蛋白。同理，0.1MGlycine（pH2.5）也能够用于stripping膜，这是已知最廉价高效洗膜方案。而且经过TBST（10min*3）漂洗后，膜上pH早就恢复到正常值，此时不存在上述strippingbuffer残留成份干扰第二种抗体标识情况。假如第一个蛋白信号过强，一样能够在50度stripping提升洗脱强度。另外，膜风干后，表面结合二