DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li

ADDINCNKISM.UserStyleDPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院,2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li,X.,ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical(DPPH•)ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily.Chemistryselect,2018.3,13081-13086.[2]Li,X.;Ouyang,X.;Cai,R.;Chen,D.3’,8”-DimerizationEnhancestheAntioxidantCapacityofFlavonoids:EvidencefromAcacetinandIsoginkgetin.2019,Molecules.24,2039.[3]Li,X.C.,2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide(PTIO•)RadicalScavenging:ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro.J.Agric.FoodChem.,2017.65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表：DPPH•自由基ABTS+•自由基PTIO•自由基结构式简单表达式DPPH·ABTS·+PTIO·分子式与分子量C18H12N5O6;M.W.394.3C18H24N6O6S;M.W.548.68C13H17N2O2;M.W.233.3带电情况中性自由基阳离子自由基中性自由基种类氮自由基（成单电子在N原子上）氮自由基（成单电子在N原子上）氧自由基（成单电子在O原子上）外观紫黑色粉末没有纯的ABTS·+紫褐色粉末溶解性与溶液颜色溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）溶液呈紫色，浓度越高，颜色越深溶于有机溶剂（如甲醇、乙醇）、水以及水性的缓冲液溶液呈墨绿色，浓度越高，颜色越深溶于水以及水性的缓冲液溶液呈蓝紫色，浓度越高，颜色越深CAS号1898-66-4无18390-00-6工作液配制方法将已购的DPPH自由基粉末，溶解即得其工作液将已购的ABTS二铵盐[(NH4)2ABTS]与过二硫酸钾(K2S2O8)黑暗中反应12小时后，再稀释得其工作液。将已购的PTIO自由基粉末，溶解即得其工作液工作液外观紫色墨绿色蓝紫色工作液紫外光谱与最大吸收(50μg/mL)（0.07mM(NH4)2ABTS+0.03mMK2S2O8）(50μg/mL)检测波长519nm734nm557nm（水溶液）检测原理当A519nm值减少，表明DPPH·被清除。其清除机制主要是氢转移HAT(hydrogenatomtransfer)当A734nm值减少，表明ABTS·+被清除。其清除机制主要是电子转移ET(electrontransfer)当A557减少，表明ABTS·+被清除。其清除机制主要是电子移ET(electrontransfer)加质子转移PT(protontransfer)用途主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。主要用于测试一个纯的化合物或者提取物，是否具有抗氧化活性或者活性的强弱。通过调节缓冲液的pH值，可以检测其抗氧化机制。优势清除速度较快，约30分钟（室温下）。清除速度较快，约6分钟（室温下）。（1）水溶性好，与生物相关性强；（2）是氧自由基，能更好地表往ROS清除水平；（3）抗氧化机制明确：pH值小于5.0时，为电子转移ET机制。当调节pH值（如pH=5.0，6.0，7.4）时，其清除能力也随之改变，表明与pH值有关，也就是说与氢离子（质子）浓度有关，据此，可证明其涉及PT机制。局限性（1）只能在有机溶剂（如甲醇、乙醇）中进行，不能在水溶液中进行；也不能在缓冲液中进行。（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）虽然DPPH的清除主要是HAT抽制，但是在不同溶剂中，其抗氧化机制是不同的，还可能有ET等。（1）不能在缓冲液中进行。当然，可以在有机溶剂（如甲醇、乙醇）和水溶液中进行。（2）其抗氧化活性，实际上是清除氮自由基的活性（而不是氧自由基）。（3）配制工作液需要的时间长（约12小时）（4）ABTS·+与(NH4)2ABTS、K2S2O8共存于溶液中，无法单独分离。所以，会导致无法预期的干扰。清除反应速度较慢，约2小时完成。不过，如果出现这种情况，可以适当加热（如37℃、50℃），或延长反应时间。所需仪器可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）可见分光光度计（常量，检测液约3mL）酶标仪（微量，检测液约200μL）

【实验讲解】DPPH•自由基清除实验ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Li</Author><Year>2018</Year><RecNum>915</RecNum><DisplayText>[1]</DisplayText><record><rec-number>915</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rfxsxdxam5epp5e50fbvz2ryvf2tdzrw55xa"timestamp="1561084712">915</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Li,Xican</author></authors></contributors><titles><title>ComparativeStudyof1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazylRadical(DPPHcenterdot)ScavengingCapacityoftheAntioxidantXanthonesFamily</title><secondary-title>Chemistryselect</secondary-title></titles><periodical><full-title>Chemistryselect</full-title></periodical><pages>13081-13086</pages><volume>3</volume><number>46</number><dates><year>2018</year><pub-dates><date>Dec13</date></pub-dates></dates><isbn>2365-6549</isbn><accession-num>WOS:000453576900015</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000453576900015</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1002/slct.201803362</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[1]1.1DPPH测试液的配置取DPPH固体1mg溶于24mL95乙醇（或无水乙醇、甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。最好避光保存，5小时内用完。取1mL上述步骤配置好的DPPH溶液，加0.5mL95乙醇（或无水乙醇、甲醇）稀释后，使其吸光度为0.6-1.0之间。若吸光度过大，则继续加溶剂；若吸光度过小，则补加DPPH固体或者原始溶液。1.2样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选甲醇、95乙醇或无水乙醇（尽量与DPPH溶液所用溶剂相同），如不溶可用DMSO。1.3预试取DPPH溶液1.0mL，加0.5mL相应有机溶剂后，往其中加少量样品液。加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢可在37℃烘箱中放置半个小时。此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。【如】在预试过程中，发现加样到500μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则500μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL。A0值：取DPPH溶液1.0mL到比色皿中，加对应有机溶剂0.5mL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0须在0.8-1.0之间）。A值：取（500-x）μL有机溶剂到比色皿中，加样品液xμL（x是根据1.3预试结果确定样品液的用量），再加DPPH溶液1.0mL，混合使反应液总体积为1.5mL。测A值。【如】某样品的用量梯度为100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，则加样如下：样品液95乙醇（或无水乙醇）DPPH测试液总体积0μL100μL500μL400μL1.0mL1.0mL1.5mL1.5mL200μL300μL1.0mL1.5mL300μL200μL1.0mL1.5mL400μL100μL1.0mL1.5mL500μL0μL1.0mL1.5mL1.4最终测量每测一个用量需要测三个平行数据。1.5DPPH•清除率（抑制率）的计算(A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值。)使用注意事项测量前，要先用空白溶剂调零。将溶液注入比色皿后应当充分摇匀，使颜色均匀分布。每次使用前后要注意比色皿的清洁。如果在实验过程中出现A值大于A0的情况，则可能是由于样品本身产生的本底吸收所致，此时，应该减去本底吸收的A值(A本)。这个A本值可以通过，加样品但不加DPPH的方法测得。此时的计算公式为：疑难解答问：DPPH实验测量抗氧化性的原理是什么？答：DPPH法于1958年被提出，广泛用于定量测定生物试样、分类药物和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在519nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，溶液颜色减淡，其褪色程度与其被清除程度（即吸光度的改变）成定量关系，因而可用分光光度计或酶标仪进行快速的定量分析。问：DPPH自由基被清除的机制是什么？答：DPPH自由基的清除过程主要涉及到氢转移（HAT），简要过程如下（以1,3,5,8-四羟基氧杂蒽酮为例）：问：实验中的溶剂应该怎么确定？答：优先选用甲醇、95乙醇或无水乙醇溶解DPPH固体和样品，若样品难溶于水和醇，再考虑DMSO等溶剂。值得注意的是，实验中应该尽量保证样品溶液和DPPH溶液使用相同的溶剂。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：样品的浓度一定要设置成1mg/mL吗？答：不同样品清除DPPH自由基的活性可能相差很大，为了保证结果的准确，应该尽量使样品的五个浓度点对DPPH•清除率均匀分布在0-100%之间，因此1mg/mL只是一个大概数值，实验中要根据预试结果进行调整。由于1mg/mL这个数字方便稀释和计算，因此在这里统一写作1mg/mL。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：测量完成后怎么计算IC50？答：IC50值是指清除50%的自由基，所需要的样品的最终浓度。有两种计算方法。第一，以实验所得的抗氧化剂浓度为横坐标，清除率为纵坐标，然后计算线性回归方程。将清除率50%代入方程中求得对应的横坐标值即为IC50值，注意最终结果将三次或三次以上的平行试验取平均值。第二，通过浓度曲线的图直接读出。在50%处画一横线，此横线与曲线的模拟线的交点的对应的横坐标，即IC50.另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：为什么要用Trolox作为阳性对照？答：维生素E（生育酚）是常见的抗氧化剂。不过，维生素E难溶于水，而且易变质。为此，化学家将其结构进行修饰，即得Trolox（化学名称：6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸）。Trolox不仅溶于水，而且易溶于有机溶剂，所以，广泛地用作抗氧化剂的阳性对照物。亦称水溶性维生素E。为了方便对比评价所测物质的抗氧化能力，通常采用Trolox作为DPPH自由基清除实验的阳性对照品。另两个实验（ABTS+•清除和PTIO•清除）同理。问：为什么会出现清除率为负值的情况？答：样品的活性太弱，所以，加入的样品的量较多；如果这个样本身在519nm处有吸收的话，就会产生一个可观的A值，导致A>A0,清除率为负。问：DPPH•清除率会大于100%吗？答：不可能。实例茶黄素清除DPPH•自由基数据：样品浓度:0.1mg/ml反应液总体积:1.5mL体积/uL最终浓度μg/mLA0平均值A值清除率123123MeanSD201.3330.8060.6120.6190.63224.06923.20121.58822.9531.028402.6670.8060.4900.4860.48639.20639.70239.70239.5370.234604.0000.8060.3720.3630.36653.84654.96354.59154.4670.464805.3330.8060.2900.2990.30264.02062.90362.53163.1510.6331006.6670.8060.2500.2390.24968.98370.34769.10769.4790.616IC50(μg/mL)3.9983.9754.0564.0100.034量效曲线图(MicrocalOrigin绘制)：

ABTS·+自由基清除实验ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[2]溶液配制ABTS二铵盐储备液(7.4mmol/L)：取ABTS二铵盐3mg，加蒸馏水0.735mL。（MW＝548.7）过二硫酸钾（K2S2O8）储备液(2.6mmol/L)：取K2S2O81mg，加蒸馏水1.43mL。（MW＝270.32）取0.2mLABTS二铵盐储备液和0.2mLK2S2O8储备液混合，黑暗环境下室温放置12小时，用pH7.4磷酸盐缓冲液将混合液稀释10-20倍直至吸光度为0.70±0.02，此溶液即为ABTS•+自由基工作液。（注：也可以用95乙醇或无水乙醇，但必须是原装分析纯试剂，回收或重蒸者均不可用。）样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。预试取ABTS•+自由基工作液0.8mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。如果反应缓慢，可在37℃烘箱中放置半个小时。此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。【如】在预试过程中，发现加样到100μL时，ABTS•+自由基工作液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为20μL、40μL、60μL、80μL、100μL。A0值：取ABTS•+自由基工作液800μL加入到比色皿中，加95乙醇（或无水乙醇）200μL，稀释混合，测A值，此A值为A0（A0宜在0.70±0.02）。A值：取（200-x）μL95乙醇（或无水乙醇）加入到96孔板中，加样品液xμL（x是根据2.3预试结果确定样品液的用量），再加ABTS•+自由基溶液800μL，混合使反应液总体积为1mL，测A值。【如】某样品的用量梯度为20μL、44μL、60μL、80μL、100μL，则加样如下：样品液95乙醇（或无水乙醇）ABTS•+自由基溶液总体积0μL20μL200μL180μL800μL800μL1000μL1000μL40μL160μL800μL1000μL60μL140μL800μL1000μL80μL120μL800μL1000μL100μL100μL800μL1000μL最终测量参照2.3节，每个浓度平行测三次。ABTS•+清除率（抑制率）的计算(A0为不加样品时的值；A为加入样品后的值。)疑难解答问：ABTS•+清除实验测量抗氧化性的原理是什么？答：ABTS二铵盐,中文名：2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐，它与过二硫酸钾(K2S2O4)反应，可以生成绿色的ABTS•+自由基。该自由基在734nm有最大吸收，所以，通过检测734nm的吸光度，可以测定其浓度。一个物质加入到ABTS•+自由基工作液后，如果734nm的吸光度降低，则说明该物质具有自由基清除活性，属于抗氧化剂。该法称为ABTS自由基清除法，可以用评价植物（或中草药抽提物）、纯化合物的抗氧化能力。问：ABTS•+自由基被清除的机制是什么？答：由于ABTS•+自由基是一种带正电荷的自由基，因此它可以从抗氧化剂分子中获得一个电子形成稳定的中性分子，故ABTS•+自由基被清除主要涉及到电子转移(ET)机制。问：ABTS•+自由基工作液如何配制？答：需要用ABTS二铵盐与过二硫酸钾反应12小时才能配制。实例仙鹤草酚B清除ABTS•+自由基数据：仙鹤草酚B0.5mg/mL加样量(μL)最终浓度(μg/mL)吸光度A清除率%平均清除率%SD0.00.00000.5460.42550.00000.460.5480.06080.551-0.48630.50.25000.46515.197614.04261.100.47713.00910.47213.92101.00.50000.4223.404324.92401.650.40226.68690.41324.68091.50.75000.23956.413458.90582.180.2259.87840.21760.42552.01.00000.16969.179367.72042.370.1768.99700.19264.98482.51.25000.10381.215880.12160.950.11279.57450.11279.5745量效曲线图：

PTIO•自由基清除实验ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Li</Author><Year>2017</Year><RecNum>392</RecNum><DisplayText>[3]</DisplayText><record><rec-number>392</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="rfxsxdxam5epp5e50fbvz2ryvf2tdzrw55xa"timestamp="0">392</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Li,X.C.</author></authors></contributors><auth-address>SchoolofChineseHerbalMedicineandInnovativeResearchandDevelopmentLaboratoryofTCM,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,232WaihuanEastRoad,GuangzhouHigherEducationMegaCenter,PanyuDistrict,Guangzhou,Guangdong510006,People'sRepublicofChina.</auth-address><titles><title>2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxide(PTIO(*))RadicalScavenging:ANewandSimpleAntioxidantAssayInVitro</title><secondary-title>J.Agric.FoodChem.</secondary-title></titles><pages>6288-6297</pages><volume>65</volume><number>30</number><keywords><keyword>AscorbicAcid/chemistry</keyword><keyword>ChemistryTechniques,Analytical/*methods</keyword><keyword>CyclicN-Oxides/*chemistry</keyword><keyword>FreeRadicalScavengers/*chemistry</keyword><keyword>Imidazoles/*chemistry</keyword><keyword>MassSpectrometry</keyword><keyword>Spectrophotometry</keyword><keyword>Structure-ActivityRelationship</keyword><keyword>2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide</keyword><keyword>H+transfer</keyword><keyword>PTIO*scavenging</keyword><keyword>analyticalmethod</keyword><keyword>antioxidantassay</keyword><keyword>oxygen-centeredradical</keyword></keywords><dates><year>2017</year><pub-dates><date>Aug2</date></pub-dates></dates><isbn>1520-5118(Electronic) 0021-8561(Linking)</isbn><accession-num>28689421</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/28689421</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1021/acs.jafc.7b02247</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[3]PTIO•测试液的配置3.1.1取PTIO固体3mg溶于20mL蒸馏水用用水（缓冲液）溶解PTIO时，检测波长为557nm。也可以用甲醇、DMSO溶解，此时检测波长均为585nm。3.1.2用空白溶剂调零后，取800μL“PTIO测试液”和200μL缓冲液或甲醇（与PTIO溶液中的溶剂保持一致）于比色皿中，在557nm处测A值，即得A0值。A0在0.2-0.6之间。样品液的配置样品用缓冲液或甲醇、乙醇溶解，配成1mg/ml浓度的溶液，可适当超声使之完全溶解。如果溶解性差，浓度小于1mg/ml也可以。预试3.3.1取“PTIO测试液”800μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，不能立即褪色时则37℃水浴2小时后再观察，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。3.3.2此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。（如，在预试过程中，发现加样到200μL时，PTIO溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。则对于该样品而言，其用量梯度宜设为0μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL）。A值测量用移液枪取“PTIO测试液”800μL加入到比色皿中，加样品液xμL（x是根据3.3预试结果确定样品液的用量），再加（200-x）μL甲醇混合，37℃水浴（或烘箱）30分钟或更久后，测A557nm值。【如】某样品的用量梯度为0μL(测出的A即A0值)、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL，其加样表如下：样品液甲醇（或