化学药物申报模板：药物遗传毒性研究技术指导原则

【 ZH 】 G P T 2 - 1【 ZH 】 G P T 2 - 1药物遗传毒性研究技术指导原那么二OO七年月目录一、概述… 1二、根本原那么…………………… 2〔一〕实验管理… 2..DOCDOC〔二〕具体问题具体分析… 2〔三〕随机、对照、重复… 2三、根本内容… 2〔一〕受试物… 21、中药、天然药物… 22、化学药物…………………… 3〔二〕试验设计的总体考虑… 31、体外试验根本要求… 42、体内试验根本要求… 6〔三〕标准试验组合… 71、标准试验组合应具备的特征… 82、推荐的标准试验组合… 83、标准试验组合的调整… 10〔四〕与致癌试验相关的附加遗传毒性试验… 四、结果分析与评价… 11〔一〕体外试验结果的评价… 121、体外试验阳性结果………… 122、体外试验阴性结果………… 12〔二〕体内试验结果的评价… 131、体内试验结果阴性时，确定靶组织暴露水平的原那么… 2、生殖细胞诱变剂的检测… 14〔三〕综合分析与评价… 15五、遗传毒性研究进展的时间… 16六、参考文献… 16七、著者… 18八、相关注释… 18九、附录… 24药物遗传毒性研究技术指导原那么一、概述GenotoxicityStudy遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传DNAX变形式出现的DNA//或遗传性疾病。由于在人体中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之间的关试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。本指导原那么重点阐述遗传毒性试验体内外试验的根本原那么，并介绍标准试验组合方案，以与对试验结果的综合分析与评价。研究。二、根本原那么〔一〕实验管理药物的遗传毒性试验属于安全性评价研究，根据《中华人民##国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规X〔二〕具体问题具体分析〔三〕随机、对照、重复重复的原那么。三、根本内容〔一〕受试物1、中药、天然药物/或辅料应标明批号、规格与生产厂家。2、化学药物明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。〔二〕试验设计的总体考虑DNA析。1、体外试验根本要求细菌回复突变试验中采用的根本菌株在细菌回复突变试验中至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨G-C4TA1535；TA1537/TA97/〔注1A-T〕位点碱基置换或移码突变的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA〔pKM1012G-C4此检测交联剂时最好采用TA102菌株或增加一种修复准确型大肠杆菌〔如埃希氏大肠杆菌WP2uvrA〔pKM1013〕体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。无毒化合物的高浓度5mg/5mg/ml10mM要求达到的细胞毒性水平常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。1.2.1〔1〕在细菌回复突变试验中，最高浓度应能显示明显的毒性，如回复突变数减少、背景菌斑减少或消失。〔2〕哺乳动物细胞体外遗传毒性试验中，毒性水平应高于50%。〔3〕哺乳动物细胞体外基因突变试验中，理想的最高浓度应能8020或相对总生长率测定毒性。对于细胞存活率低于10%时获得的阳性结果，应慎重对待。难溶受试物的检测X4试物。〔15mg/5mg/ml10mM。〔21.2.2体外试验的重现性体外试验应关注重现性。体外试验通常应进展重复试验。X的Xtk规X2、体内试验根本要求体内试验的给药途径说明理由。体内检测染色体断裂剂的骨髓试验啮齿类动物骨髓有核细胞的染色体畸变试验可以检测多种染色5验均可用于检测断裂剂。此外也可以通过测定小鼠外周血中未成熟脾脏无法去除带微核的红细胞或对断裂剂或非整倍体诱导剂有足够灵敏度的动物。骨髓微核试验中啮齿类动物性别的选用7〔三〕标准试验组合遗传毒性试验方法有多种，但没有任何单一试验方法能检测出所果的判断应综合考虑。1、标准试验组合应具备的特征核到真核细胞，因此应包含以下内容：〔1〕应包含细菌回复突变试验，因为该试验已被证明能检出相关的遗传学改变和大局部啮齿类动物遗传毒性致癌剂。〔2DNA8tk9tk〔3〕应包含一项遗传损伤体内试验，以提供一个包括影响受试模型。体内试验可另外检出某些遗传毒性物质〔注释102、推荐的标准试验组合〔1〕一项体外细菌基因突变试验；〔2〕一项采用哺乳动物细胞进展的体外染色体损伤评估试验，或体外小鼠淋巴瘤tk试验；〔3用途，可能需要进展进一步的试验。建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验〔如DNA加合物检测，DNADNA但应提供充分的科学依据。tk试验方法。3、标准试验组合的调整标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进展调整。〔1〕在一些情况下，细菌回复突变试验不能提供适宜的或足够和可能或可干扰哺乳动物细胞复制的受试物〔如拓扑异构酶抑制剂、DNA〔2〕三项标准试验组合一般可检出具有遗传毒性作用的可疑结反响性和代谢资料来选择附加试验或调整实验方案。〔3〕对于某些特殊的受试物，如毒代或药代动力学研究说明不被全身吸收，在标准体内遗传毒性试验中无法到达靶组织〔注释12〔四〕与致癌试验相关的附加遗传毒性试验1、肿瘤产生的相关证据对于标准遗传毒性组合试验结果为阴性而在致癌试验中出现阳UDS瘤相关基因遗传改变的分子特征研究2、具有特异结构的化合物四、结果分析与评价遗传毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个有X遗传毒性试验组合检测的是主要通过直接的遗传损伤机制的致尤其是在有疑义时。因此，需进展综合分析和评价。〔一〕体外试验结果的评价1、体外试验阳性结果在评价体外试验阳性结果的生物学意义时，应考虑以下几个问134〕阳性结果是否由于体外独特的代谢活化途径或体外特殊的活性代谢物135〕结果是否可归因于体内不存在的体外极端培养条件，如极端的pH6〕哺乳〔8〕某种特定遗传终点的试验结果是否与同类化合物中其他化合物的试验结果一致？〔9〕有无其他可能的情况。通过以上考虑，综合分析该阳性结果是否有生物学意义。2、体外试验阴性结果1动物肝脏S9〕可能不适宜？〔2〕化合物的结构或反响性是否提示采用其他检测方法或系统更适宜？〔3〕有无其他可能的情况。〔二〕体内试验结果的评价对于在一种或多种体外试验中显示有生物学意义的阳性结果的14受试物体内作用的靶细胞以与体外试验的检测终点有助于选择附加的体内试验。局限性。1、体内试验结果阴性时，确定靶组织暴露水平的原那么体内试验结果的意义与确定受试物在靶组织〔注释12〕中有足内的暴露水平：〔1体畸变试验中有丝分裂指数显著的降低，间接反映受试物的暴露水平。〔215〕直接测定骨髓中的受试物相关物质。〕通过放射自显影检测组织暴露水平。对于方法〔2〕～〔4平。2、生殖细胞诱变剂的检测〔三〕综合分析与评价床试验的性质。DNADNADNA烷化或DNA但不能在健康受试者中使用。当受试物的标准三项试验组合中的任何一项试验结果为阳性时，建议完成标准试验组合中的第四种试验。假设结果模棱两可，需重复试验以确定结果的可重现性。假设一项或多项试验结果为阳性，需采1617〕以确认受试物是否会引起遗传毒性。五、遗传毒性研究进展的时间通常情况下，对于〔12〕中药、天然药物中pH值等问题，难以进六、参考文献1、ICHSteeringmittee.HarmonisedTripartiteGuidelineS2A：Guidanceonspecificaspectsofregulatorygenotoxicitytests.19952、ICHSteeringmittee.HarmonisedTripartitestandardbatteryfortestingofpharmaceuticals.19973ICHSteeringmittee.HarmonisedTripartiteGuidelineM3:Non-clinicalsafetystudiesfortheconductofhumanclinicaltrialsforpharmaceuticals.20004、FDA.Guidanceforindustyandreviewstaff:Remendedapproachestointegrationofgenetictoxicologystudyresults.20065、致突变试验。见：新药〔西药〕临床前研究指导原那么汇编6理学〕。中华人民##国卫生部药政局，1994:216-2217、秦伯益主编.新药评价概论，第二版.人民卫生.，1999：207-2318、8、袁伯俊、王治乔.新药临床前安全性评价与实践，第一版.军事医学科学院.，19979、遗传毒性试验。见：日本临床前研究指导原那么解说。药事日报社，2002：25-34，167-19010、CrutisD.Klaassen.Casarett&Doull’sToxicology,6thedition，人民卫生，200211、OECDGuidelineforTestingofChemicals.471Bacterialreversemutationtest.199712OECDGuidelineforTestingofChemicals.473InVitroMammalianchromosomeaberrationtest.199713、OECDGuidelineforTestingofChemicals.474Mammalianerythrocytemicronucleustest.199714、OECDGuidelineforTestingofChemicals.476InVitroMammaliancellgenemutationtest.1997七、著者《药物遗传毒性研究技术指导原那么》课题研究组。八、相关注释1：TA1537TA97和TA97a2A-TLevin等，1983；Wilcox5525各个制药公司对较小的数据库进展分析〕的结果说明，约7.5%的细WP2uvrA4能具有与诱导鼠伤寒沙门氏菌株标准组合变化的诱变剂同样的潜在致癌性。3：此处所指最高浓度确实定主要针对化学药物，因中药、天然药物所包含X4S9中国仓鼠V79CHO和CHLDNA已发现一些物质仅在产生沉淀的浓度XXX注释5和定量〔即确定诱导断裂的最低剂量〕这两方面均高度相关。采用同种动物进展试验时，可望得到更为一致的结果。注释6FISH方法。注释7UDS试验一样仅在雄性啮齿类动物中得到验证。注释8括小鼠淋巴瘤L5178YTK6细胞tkL5178Yhprt，AS52gpttk位点诱导的突变体分子分析显示存在多种遗传学tkb等位基因的缺失是染色体结构或数目的改变或重组的结果。有证hprtgptX由于来源于X染色体的的hprt基因很可能位于生命必需基因〔EssentialgenesX度不如tk位点。tk果。丙卡巴肼、氢醌、氨基甲酸乙酯、苯等致癌剂即属于此类。N-亚硝基基团、芳香硝基基团。注释12：靶组织：此处特指体内试验的检测目标组织，如小鼠骨髓微核试验中的骨髓。注释13：已有文献报道关于体内和体外试验结果之间差异的问题，差异包括a〕体外形成的代谢产物未必在体内形成b代谢产物可能在体内迅速被解毒而体外那么不能cDNAUDS〕试验，对文献的回顾说明，将肝UDSUDSDNA注释15：对众多药物进展二室间药物水平的直接比拟的研究说16：在某些情况下，在对所有现有资料进展评估后，证据权X围内或刚刚超出该X1〕在出现阳性结果的剂量时细胞毒性的水平；〔2〕一样试验或补充试验确实证性床试验，该阳性结果应写入研究者手册和知情同意书中。注释17：一些情况下，体外遗传毒性试验显示出可重复性的阳小鼠重复给药毒性试验中进展外周血涂片可用来评估诱导微核的作DNADNADNASHE〕转化试验可用作附示p53九、附录推荐的标准试验组合中的遗传毒性试验方法以下方法中所提供的最高浓度和最高剂量设计原那么主要针不能简单套用该原那么，试验时应根据具体情况进展合理的设计。Bacterialreversemutationtest〕1、菌株组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和/或色氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌，至少应包含下述五种菌株组合〔除特殊说明外，均为鼠伤寒沙门氏菌〕：〔TA9TA10TA153TA1537或TA97或TA97；〔5〕TA102或大肠埃希杆菌WP2uvrA或大肠埃希杆菌WP2uvrA〔pKM101菌株特性鉴定需符合要求，-80℃或液氮冻存备用。2、浓度至少应包含5个可用于结果分析的浓度。最高浓度主要取决于受试物对细菌的毒性和/或溶解度：a、对于可溶性的无毒受试物，推荐的最高测试浓度一般为5mg/皿；b1.2.2c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；1.2.33、代谢活化一般采用诱导剂，如Aroclor1254S9即在加S9S9S9在S95～30％〔v/v4、对照代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性〔空白对照和/或溶剂对照〕和阳性对照组。阳性对照物应为的菌株特异性的阳性致突变剂。5、方法48～72观察结果。每一浓度至少平行三皿。实验至少重复一次。6、结果判定皿的回复突变菌落数，并计算各组的均值和标准差。的回复突变菌落数出现浓度依赖性的增加和/或在一个或多个浓度组〔二〕体外哺乳动物细胞染色体畸变试验〔InvitroMammalianchromosomalaberrationtest〕1、细胞可采用哺乳动物或人的细胞进展试验，如CHL细胞、CHO细胞、人外周血淋巴细胞等，细胞系需定期检查核型和有无支原体污染等。-80℃或液氮冻存备用。2、浓度至少应包含3个可用于结果分析的浓度。/度一般采用倍比稀释法：a10mMb、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确501.2.2c、对于难溶性的受试物，一般采用最小沉淀浓度为最高浓度；1.2.33、代谢活化一般采用诱导剂，如Aroclor1254S9S9S9S91～10％〔v/v代谢活化或非代谢活化条件下，均应设立平行阴性〔空白对照和/5、方法处理与细胞收获在代谢或非代谢活化的情况下，受试物和细胞作3～61.51.5时收获细胞。对某些受试物与细胞接触时间/1.5读片分析：一般油镜下每种浓度至少观察200数目畸变，但不计入畸变率中。6、结果判定结果中应描述各浓度组细胞毒性大小和沉淀情况，结果表示为染色体结构畸变细胞的百分率。多倍体数目的增加提示受试物可能会抑制有丝分裂或诱导染色细胞周期。〔三〕小鼠淋巴瘤细胞试验〔Mouse lymphoma assay，MLA〕1、细胞L5178Ytk+/-3.7.2C型或有无支原体污染等，必要时进展自发突变细胞的去除。-80℃液氮冻存备用。2、浓度〔平行处理〕度。/度一般采用倍比稀释法：a10mMb、对于可溶性的有细胞毒性的受试物，应根据细胞毒性大小确定最高浓度，如通过评价平板接种效率或相对总生长率确定细胞毒性，最高浓度应能产生至少80%毒性〔即存活率不大