精准医学环境下的肺癌分子病理诊断及检测

精准医学环境下的肺癌分子病理

诊断及检测肺癌的分子分型与靶向治疗的地位ALK:Crizotinib,Ceritinib,Alectinib,AP26113,PF-06463922EGFR:Gefitinib,Erlotinib,Afatinib,Dacomitinib,AZD9291,CO-1686ROS1:CrizotinibRET:CabozantinibMET:CrizotinibBRAF:DabrafenibHER2:Dacomitinib,AfatinibKRAS:SelumetinibAdenocarcinomaASCO2014,EducationBookMinutiG,etal.ExpertOpinBiolTher.2013;13:1401-12Squamouscellcarcinoma对于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他类型肺癌，应在诊断的同时常规进行表皮生长因子（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突变检测病理诊断内容包括：肿瘤部位、组织学亚型、累及范围（支气管、胸膜、脉管、神经、伴随病变类型、肺内播散灶、淋巴结转移情况等）、切缘及必要的特殊染色、免疫组化结果或分子检测结果。包含的信息应满足临床分期的需要，并给出pTNM分期。合格的肺癌诊断需标注基因变异状态：右肺上叶腺癌TheyNameM（骨）-IV期

ALK阳性或EGFR突变阳性原发性肺癌诊疗规范推荐NCCN指南对于EGFR/ALK检测人群的推荐中国肺癌患者中已经发现的驱动基因及比率DrivergenesinAdenocarcinoma(China)

GuangdongLungCancerInstitutePanY,etal.LungCancer.2014May;84(2):121-6.上海肿瘤医院，1139例肺腺癌样本DNA基因重排融合mRNA或5’/3’mRNA差异表达嵌合蛋白表达肺癌中ALK基因变异的表达调控FISH/CISHNGSRT-PCR5’/3’比较qRT-PCRRACE-PCR…IHCCFDA批准的三种ALK阳性NSCLC诊断试剂盒ALKbreak-apartFISH试剂盒(AbbottMolecular)Ventana全自动ALKIHC(罗氏诊断)SplitIsolatedredAmoyDxEML4-ALK融合基因检测试剂盒

（厦门艾德）FISH检测的劣势操作流程复杂，评判标准要求高结果判读需标准化，必需经过培训的病理科医师进行判读晚期患者小活检标本(2mm)，很难保证每个视野存在50个癌细胞价格昂贵，5000元左右/例，无法适用于筛选无法保证每个非鳞癌患者均接受ALK检测FISH检测的优势FISH是检测融合基因的经典方法之一前期的ALK+NSCLC的临床研究的结果均是以FISH为检测手段，最近新进行的临床研究，检测方法趋于多样化FISH的特点总结全自动VentanaIHC检测原理：在常规IHC之后加入信号增强，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性全自动VentanaIHC：信号增强常规IHC：无信号增强PayattentiontotheALKpositivetumorcellsVentanaIHC与FISH检测比较FISH总数敏感性特异性一致率阳性阴性VentanaIHC(1)阳性46753100%98.20%98.40%阴性0377377VentanaIHC(2)阳性3103194%100%99.10%阴性2198200VentanaIHC(2)阳性32032100%100%100%阴性0217217VentanaIHC(3)阳性4024291%96%94%阴性45357VentanaIHC(4)阳性1801890%100%99.60%阴性2503505(1)JinghuiWang,etal.PLoSONE20149(7):e101551(2)EugenC.Minca,etal.JMolDiagn2013,15:341-346(3)MurryW.Wynes,etal.JThoracOncol.2014;9:631–638(4)Greta,etal.ArchPatholLabMed.doi:2014,10.5858VentanaIHC已经成为其它ALK抑制剂3期临床研究的首选检测方法LDK378VersusChemotherapyinPreviouslyUntreatedPatientsWithALKRearrangedNon-smallCellLungCancer（NCT01828099）InclusionCriteria:Patienthasahistologicallyorcytologicallyconfirmeddiagnosisofnon-squamousNon-smallcelllungcancer(NSCLC)thatisAnaplasticlymphomakinase(ALK)positiveasassessedbytheVentanaImmunohistochemistry(IHC)test.ThetestwillbeperformedatNovartisdesignatedcentrallaboratories.ALEXStudy:ARandomized,PhaseIIIStudyComparingAlectinibWithCrizotinibinTreatment-NaiveAnaplasticLymphomaKinase(ALK)-PositiveAdvancedNon-SmallCellLungCancer(NSCLC)Patients(NCT02075840)InclusionCriteria:Histologicallyorcytologicallyconfirmeddiagnosisofadvancedorrecurrent(StageIIIBnotamenableformultimodalitytreatment)ormetastatic(StageIV)NSCLCthatisALK-positiveasassessedbytheVentanaIHCtest多重RT-PCR测序EML4-ALK变异体的多种引物，GAPDH作为对照GLCI内部数据：所有12个ALK融合阳性样品均通过多路RT-PCR测序技术得以证实。国家药品食品管理局（CFDA）已批准的可用于临床的ALK融合基因检测的试剂盒（人类EML4-ALK融合基因检测试剂盒，荧光PCR方法）RT-PCRALK检测性能临床标本196例RT-PCR（艾德）Vs

FISH（雅培）

阳性符合率：98.4%阴性符合率：94.6%RT-PCR（艾德）Vs

IHC（罗氏）

阳性符合率：98.5%阴性符合率：96.2%1.Tuononenetal.,BioMResInt.20132.J.Yinget,AnnalsofOncology,July31,2013在NSCLC中常规IHC可以用于筛查ALK2010年Mino-KenudsonM,etal研究发现采用高灵敏度的检测抗体D5F3后，IHC可以有效的检测ALK异常的NSCLC检测的灵敏度和特异度都可达到100％和99%对阳性样本和阴性样本的检测准确性分别为96%和100%与FISH相比，IHC是一种更常规的技术，成本更低，且工作强度也更低ALKIHCFISH患者1：IHC显示ALK强表达，FISH显示重排患者2：IHC显示无ALK表达，FISH显示无重排Mino-Kenudsonetal.ClinCancerRes2010;16:1561–1571.常规IHC筛选ALK阳性NSCLC研究汇总研究

病例数FISHIHC3+IHC2+IHC1+IHC0HyojinKim,etal.464阳性14300

阴性1714425EunheeS.Yi,etal.101阳性8110

阴性022069Fiona，et,al.1281阳性20620

阴性24461201XHan,etal.119阳性37710

阴性21566Parketal.262阳性91150

阴性021234ZhouJ,etal.368阳性25500阴性1451282Takamochi,etal.360阳性10000阴性012347JH,Paik,etal.735阳性151300阴性0720680Paiketal.640阳性22600阴性01016586Christina,etal.594阳性4120

阴性123581合计4924阳性16453110阴性7401784471Total4924阳性16453110阴性7401784471价格便宜，适合于NSCLC患者的筛选操作流程简单、易行判读标准主观操作流程需标准化优势IHC（3+）与FISH（+）符合率95.9%劣势IHC（2+）与FISH（+）符合率57%IHC（+）与FISH（+）符合率5.8%IHC（-）与FISH（-）符合率100%ShanLing,DongmeiLinetal.DiagnosticPathol.2013:9,3ALK常规IHC与克唑替尼疗效存在相关性EL.Kwak,etal.NEnglJMed2010;363:1693-1703ALK-ATLAS：ALKIHC作为ALK筛查工具的优势快捷，便宜

只要有可见的肿瘤细胞存在理论上均可检出

标本多样：石蜡切片，细针穿刺细胞，细胞刷片，流体细胞学标本等ALK重排在NSCLC中阳性率较低，要考虑经济因素IHC已被国际上大部分协会推荐作为ALK的筛查手段NSCLC活检组织标本阴性或未知；据组织类型选择合适技术§新鲜标本VentanaIHC常规IHC检测*

阳性FISHRT-PCR＆（qPCR、多重PCR或RACE-PCR-Seq）EFGR突变且使用EGFR-TKIs后出现原发或继发耐药的患者石蜡标本3+/2+/1+阴性ALK阳性非小细胞肺癌EGFR突变检测中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013版）中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会

常规IHC初筛ALK阳性NSCLC专家共识目的：推动我国ALK阳性NSCLC的初筛工作,提高初筛的有效性、可重复性和可比性2015年7月ALK阳性NSCLC的初筛和确诊流程筛查和验证专家组建议NCCN指南对于ALK阴性/EGFR突变阴性检测人群的推荐推荐进行ROS1检测，尤其是双阴患者2012年ROS1定义了一种新型的NSCLCROS1fusionsoccurredin∼2.0%ofChinesepatientswithNSCLCandhadnospecificclinicopathologicalfeature.JournalofClinicalOncology,Vol30,2011AnnalsofOncology2013ROS1fusions:∼1.7%(18of1,073)ofbyFISHinwesternNSCLC.25伴ROS1基因重排NSCLC患者靶病灶肿瘤负荷变化的最佳百分比A：ROS1阴性，但ALK阳性,M：ROS1阳性且MET扩增阳性*2例患者在开始使用克唑替尼后6周内死亡，其疗效未知†后来证实为ROS1阴性的肿瘤ShawAT,etal.NEnglJMed.2014;371(21):1963-1971总体客观缓解率为72%，中位缓解持续时间为17.6个月无论哪种ROS1融合基因类型，肿瘤均有缓解中位无进展生存时间为19.2个月ROS1现有筛选/检测方法FISH:（Abbott-Vysis）分离探针法IHC：克隆号D4D6，CST公司(VENTANA)RT-PCR：AMOYDXNGS结合IHC与FISH/RTPCR可以有效的检测ROS1LingShan,DongmeiLinetal.PLoSone10(3);March,2015LingShan,DongmeiLinetal.PLoSone10(3);March,2015IHC可以有效用于ROS1阳性患者的筛选NCCN指南关于其它潜在靶点的推荐NCCNguidelineVersion4,2015肺癌中cMET扩增比率800consecutiveNSCLCsamplestestedatColoradoMolecularCorrelatesLabfrom2009to2012.Detaileddemographicdatanotavailable.Sampleswereunselectedwithrespecttootherbiomarkerstatus,butmayhavebeenenrichedforadenocarcinoma,neversmokers,youngage,andfemale,basedontimeperiodoftesting.MET/CEP7ratioNumberofspecimensMETamplificationclassification%oftotal<1.8741Negative92.6%≥1.8–≤2.229Low3.6%>2.2–<5.024Intermediate3.0%≥5.06High0.8%Total800100.0%METamplificationlevelcategories:ExpectedfrequenciesGarciaL,UniversityofColorado,personalcommunication在MET中高拷贝数的肺癌患者中克唑替尼的疗效aConfirmedobjectiveresponses.bBasedoninvestigatorassessment.cTwopatientsintheintermediateMETgrouphadanunconfirmedPRthatwasnotconfirmedinasecondassessment.BestpercentchangefrombaselineintargettumorlesionsabypatientLowMET

n=2IntermediateMET

n=6HighMET

n=6100806040200–20–40–60–80–100100806040200–20–40–60–80–100DiseaseprogressionStablediseasePartialresponsebCompleteresponseb%ChangeFromBaseline100806040200–20–40–60–80–100Threshold

forpartial

responseccC-MET过表达免疫组化诊断判读标准方法：用免疫组化技术（IHC）检测晚期NSCLC患者denovo

c-Met表达情况，FISH技术检测基因拷贝数变化。c-Met阳性为有50%以上肿瘤细胞中高强度染色Poster#8090,ASCO,2015克唑替尼治疗与c-METFISH状态的关系缓解的11例患者IHCc-Met都为高表达，其中有8例FISH检测为阳性.提示c-Met过表达可作为NSCLCc-Met

denovo扩增的标志物c-Met抑制剂克唑替尼可能是NSCLCc-Met

denovo过表达患者较好的治疗方法使用IHC检测c-Met对治疗效果的指示作用不劣于FISH法。Poster#8090,ASCO,2015MET14外显子的剪切突变可能是MET抑制剂的一个重要潜在靶点Poster#8021,ASCO,2015结论MET14外显子跳跃是NSCLC一个新的驱动基因，伴有MET14外显子跳跃的NSCLC对MET抑制剂治疗有响应MET14外显子跳跃是EGFR突变和ALK融合后，NSCLC中又一个比较高比例的亚型（4%）需要有更大型的临床研究来进一步证实MET14外显子跳跃与MET抑制剂治疗的关系Poster#8021,ASCO,2015高通量测序技术（High-ThroughputSequencing，NGS）高通量测序以其高数据输出量与高解析度的特性;同时检测多个基因的突变，融合和拷贝数变化情况，而且使得检测的费用和时间大大缩短。目前国内市场即将用于临床的主要测序系统IonProtonfromLifeTech/BGISEQ-1000基因测序仪NextSeq500IonTorrentPGMMiSeqNGS可以有效的检测出ALK阳性的NSCLCSirajM.etal.JCO。32:5s,2014(suppl;abstr8049)总结:在ALK融合基因检测方面，靶向NGS比FISH具有更高的灵敏度和特异性.本研究对FISH作为ALK融合基因检测的金标准提出了挑战52%的患者存在驱动基因的突变（LCMC2.0项目)驱动基因的突变比率MET和PTEN蛋白检测结果在15%

的受检患者中检测出PTEN基因缺失、在54%的受检者中检测出MET表达。下一代测序平台在81%的LCMC2.0项目参与机构中使用。16%的患者参与选择靶向治疗或试验poster#8094,ASCO,2015有6%的患者存在一个以上的驱动基因的改变poster#8094,ASCO,2015

什么是NCIMatchTrial-就是依据病患的基因组图谱信息进行分类选择合适的临床测试方案。会参与检测3000例临床样本什么是Oncomine数据库-包含各类突变，copynumber和genefusion的数据，这些数据来至于超过700,000的细胞系，xenografts和临床肿瘤样本所鉴定得到的突变。什么是Oncominecomprehensivepanel-它包含了143个肿瘤相关的基因。其中73个原癌基因，49个CNV变化的基因，26个肿瘤抑制基因和22个有融合突变的基因。完全由Oncomineknowledegebase支持其变异位点的临床解析。需要极少量的样本20ngofDNA和15ngofRNA，4小时内完成DNA和RNA同时测序检测用已知有398中突变的panel进行性能验证显示，365种SNV检出364个，检出率高达99.7%,33种indel检出25个，检出率达75.8%三组FFPE样本进行性能验证，104个有常规分子诊断信息，101肺癌样本，106个前列腺癌样本，其中