现代生物技术课件 2013925-BT基因工程-绪论和工具酶

第二章基因工程

（GeneEngineering）

2012年9月2

要求

1、掌握基因工程的概念

2、掌握基因工程的基本过程

3、熟悉工具酶和载体类型及应用

4、熟悉原核、真核细胞转染、表

达的基本方法和类型。

5、熟悉基因工程产生的基础和过程

(科研思维与方法)。

6.

设计一个基因克隆或基因表达的程序。

3

第一节概述基因工程—生物技术的核心内容

4

人们按照预定设计，在体外对不同来源DNA分子进行人工切割、连接、插入载体DNA分子，使遗传物质重新组合、改造，经转移、导入到原先不含有重组体的受体细胞，使之持续稳定繁殖，目的基因扩增、表达，获得人类所需的产品的工程。一、基因工程的概念（一）定义：5

基因工程（Geneengineering）DNA重组技术（recombinantDNAtechnology）基因操作（genemanipulation）基因克隆（genecloning）分子克隆（molecularcloning）DNA克隆（DNAcloning）基因修饰（genemodification）

6WithRestrictionenzymesWithRestrictionenzymeswithDNAligaseenzyme(Genetictransformation)7（二）基因工程的基本内涵

基因工程是将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。体外重建、基因转移和外源表达是重组DNA技术的三大环节。8

——

两个水平，六个阶段

二、基因工程的基本步骤

9基因工程包括分子和细胞两个水平的操作分子水平操作指的是基因重组、克隆和表达的设计与重组体构建（即重组DNA技术）；细胞水平操作指转化、筛选和培养工程菌或细胞以及表达产物的分离纯化过程。10

获得含目的基因的重组体分子（亦称重组子）。

本阶段的操作有三个主要环节：

（1）分离：提取、分离含目的基因的DNA分子和载体DNA分子，在分离提取过程中，注意质、量，减少损伤。

（2）切割：选择合适的RE工具酶，分别对外源目的DNA分子和载体DNA分子进行酶解切割。

（3）连接：用DNA连接酶，将目的基因与载体在体外连接为一个重组DNA分子，并进行鉴定。1．分子水平操作阶段：11

2.细胞水平操作阶段：

把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细

胞，赋予其“生命”让其表达，获得产品。

本阶段的操作也有三个主要环节。

（1）转移：利用DNA转移技术，把构建的重组体导入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞。

（2）筛选：利用核酸杂交，酶切分析、PCR和表型特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌/细胞。

（3）表达：大量培养含重组体的工程菌/细胞，诱导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。

重组DNA操作一般步骤：（1）分离：提取和获得目的基因和载体DNA；（2）切割：分别对目的基因和载体DNA

酶切；（3）连接：目的基因与载体连接，形成新的重组DNA分子；（4）转化：用重组DNA分子转化受体细胞；（5）筛选：能在受体细胞中复制和遗传；对转化子筛选和鉴定；（6）表达：对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。供体+载体重组体受体工程细胞分子水平细胞水平

分切连

转筛表

基因工程的四类技术：提取，重组，转移，表达基因工程的三个要素：供体，载体，受体14基因工程的支撑技术核酸凝胶电泳技术核酸分子杂交技术细菌转化转染技术DNA序列分析技术寡核苷酸合成技术基因定点突变技术聚合酶链反应（PCR）技术15（1）填平了生物种属间不可逾越的鸿沟

跨越天然物种屏障（原核和真核生物、植物和动物)，造福人类，过去人们难以置信的事情，已成为现实。三、基因工程的重大意义基因工程?16

（2）缩短了进化时间

遗传和变异是一对矛盾，遗传赋予生物种的稳定，变异赋予生物种的进化。自然变异的进化时间需要千万年，常规育种亦要几年；而重组DNA技术将进化时间大大缩短至几年。基因操作用于育种，缩短进化时间，在解决全世界人民温饱问题上发挥了重要作用。17（3）使人类能对生物进行定向改造

重组DNA技术标志着人类控制和改造生物的历史已进入一个新纪元。以重组DNA技术培育出抗真菌蔬菜为例，几丁质是真菌细胞的组分之一，几丁质酶能水解几丁质，科学家将几丁质酶基因导入西红柿、土豆、莴苣和甜菜中，这一技术将对蔬菜抗真菌感染具有重要意义。18（4）利用重组DNA技术可以在体外大量扩增、纯化人们感兴趣的基因，研究其结构、功能及调控机制，从而拓宽了分子生物的研究领域。19（5）医学上应用更为广泛，涉及各领域

正常人类生命活动的分子机制；

人类各种疾病发生的分子机理；

人类各种疾病如遗传性疾病、肿瘤、肥胖、

心血管疾病、传染病等病因的查明、诊断、

治疗和预防；

药物的研发和生产；

疾病模型的建立；

人类的营养、健康、长寿和保健（亚健康）基因工程不是发现，而是创造。改变传统农业概念

让植物生产人体蛋白质生产促性腺绒毛激素的矮牵牛花发光的水稻23

第二节基因工程的发生与发展24

一、基因工程诞生的理论基础

20世纪中期分子遗传学理论的重大进展

六大发现：

1．确定了生物遗传的物质基础是DNA1944年美国微生物学家Avery等通过肺炎链球菌光滑型和粗糙型的转化试验证实基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体。而后噬菌体DNA转化实验也得到进一步证实。

2．DNA分子双螺旋结构模型和半保留复制

DNA碱基配对规律和X衍射研究

1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型26

3．生物遗传的“中心法则”解决了遗传信息的流向和遗传性状的相互关系，揭示了生命遗传信息传递基本规律。1957年，Crick提出中心法则。27

自我复制，遗传信息由亲代传给子代；通过转录，遗传信息传给RNA；通过翻译，信息传给蛋白质和酶；基因型决定生物的表型。DNA

RNA

protein28

4．“操纵子”学说揭示了基因表达

和调控的概念

基因组结构

基因分布

基因表达

基因调控的原理

酶诱导的本质

1965年，Jacob和Monod提出操纵子学说，开创了基因表达调控研究30

5．破译了全部生物遗传密码，

确定了它在生物界的通用

性，人类更加具体地了解

遗传信息表达规律。

1965年破译了全部64个遗传密码遗传密码表32mRNA分子上从5至3的方向,每3个核苷酸构建一个密码子，编码某一特定氨基酸或作为蛋白质合成的起始、终止信号，称为三联体密码，也称遗传密码子(geneticcodon)。解决了信息语言的对应关系33

6、生物进化，基因突变、获得的性状可以遗传到后代。34

分子遗传学理论上的六大进展解决了

生命现象的遗传物质基础（均是核酸）结构模型（同类构件、双螺旋）复制方式（相似的机制）遗传信息流动方向（共同的中心法则）遗传密码（共用一套相同的密码）表达和调控的机理（类同的方法）基因突变机理、意义（变异与进化）为基因工程技术的诞生典定了理论基础。

理论上的可行性。

35二、分子遗传学新方法是基因工程的技术基础（六大技术）

首当其冲的是要解决：①如何自如地得到目的基因；②如何在体外改造基因，得到重组体；③如何在体外转移重组基因；直到20世纪70年代中期，相继出现了

几项关键性技术，梦想成真。361.工具酶的发现:

DNA分子的切割和连接技术1970年Smith发现了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶

HinfⅠ对DNA分子有特异地切割作用。（手术刀剪）同年Khorana又发现了T4DNA连接酶，能将DNA片段连接在一起。（缝纫机、浆糊）DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机）构成了一个研究DNA、RNA分子的工具酶箱。372.DNA片段载体系统的构建

目的基因、DNA片段不能复制，也易破坏。必须连到具有复制能力的DNA分子上。

载体（vector)

是能携带外源DNA、能自我复制的小DNA分子。最早发现的是：质粒、噬菌体和病毒。383.大肠杆菌受体细胞系统的建立

体外获得的含目的基因或DNA片段的重组体，虽具有自我复制的本能，但没有原料、酶系统和生命活力。必须将其安全转移到宿主细胞才能进行增殖，赋予其“生命”。39

1970年发现氯化钙处理过的细胞易于吸收接纳外源DNA；

1972年CohenC报道，质粒DNA也能被大肠杆菌吸收。而后发现经过改造的质粒、噬菌体和病毒都可以携带目的DNA片段和基因，经过转化大肠杆菌，建立该基因的无性繁殖系。4.大肠杆菌DNA转化体系建立40

酶切分析技术（核酸分辨仪）核酸分子杂交技术（核酸探测仪）

序列分析（密码复读机）生物信息学（密码破译机）

5.DNA分析、鉴定技术41凝胶电泳：Agarose,PAGEgel

离心技术:

层析技术:

印迹技术:Southernblot

……

6.DNA分离、纯化及鉴定技术42

技术上的可行性:六大技术方法的建立

实际上的可操作性:

材料、实验条件、时空

条件、经济条件和政策

基础方面的基本条件（可能性+可行性+可操作性）具备，尚需人的科学创新思维+艰苦的实践。才能得到创新的发明、发现和成果。43

1972年Berg等人使用EcoRI在体外对猴病毒SV40的DNA和λ噬菌体的DNA分别酶消化，再用T4DNA连接酶将两种片段连接起来，得到SV40和λDNA的重组杂种DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA体外不同物种之间的DNA重组实验（片段重组）。基因工程的大胆尝试:44基因工程的诞生1980年Nobel化学奖1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验。

Berg的开创性实验45第三节

基因工程常用工具酶46基因工程技术中，对核酸分子进行体外切割、连接、修饰和合成等步骤，都是在酶的催化下完成的。

凡是在基因操作时应用的各种酶，统称为工具酶。工具酶种类多、数量大，这里仅介绍常用的几种重要的工具酶。

核酸核酸水解酶类核酸合成酶类核酸修饰酶类核酸内切酶核酸外切酶DNA聚合酶RNA聚合酶DNA连接酶甲基化酶核苷酸激酶核苷酸转移酶磷酸酶重组体核酸酶反转录酶工具酶48一、限制性核酸内切酶

(restrictionendonuclease，RE)

核酸酶(nucleases):指可水解核酸的酶。按底物不同分为：DNA酶（DNase）

RNA酶（RNase）按作用部位不同分为：

5´末端外切酶 核酸外切酶

3´末端外切酶 核酸内切酶49

限制性核酸内切酶：又简称为限制性内切酶或限制酶。有严格的序列依赖性，是基因工程中的重要工具酶。505’5’

GCAATGCTTAGCCAT

CGTTACGAATCGGTA核酸外切酶核酸内切酶核酸外切酶5’5’

GCAAGCTTTAGCCAT

CGTTCGAAATCGGTA限制性核酸内切酶51何谓限制性核酸内切酶？是如何发现的…….52

20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如EcoliK株的噬菌体只能感染EcoliK株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。

（一）限制性核酸内切酶的发现及其生物功能53EcoliK株噬菌体

EcoliK株

EcoliB菌株限制现象限制性内切酶细菌的限制与修饰作用54寄主控制的限制（restriction）与修饰(modification)现象简称为R/M体系。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。R/M体系组成：由两种酶活性配合完成；一种是修饰的甲基转移酶，另一种是核酸内切限制酶。限制性核酸内切酶能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，称为限制性核酸内切酶。56

限制性核酸内切酶的发现1968Linn和

Arber从

E.coliB中发现限制酶Ⅰ1970Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ1978W.Arber，H.O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金。57（二）限制性核酸内切酶的概念

限制性核酸内切酶是一类能识别和切割双链DNA分子内部特定碱基顺序，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)，简称限制酶。

限制酶识别位点，切割位点均在分子内部，且具特异性，被称为基因工程“分子手术刀、分子手术剪”，贡献很大。58限制性内切酶的一般特征：

*存在于任何一种原核细菌中

*在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产生相应的限制性片段

*各种生物呈现特征性的限制性内切酶切图谱*在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑事侦察领域极为重要.AGCTAGCTAGCTAGCTAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ（+）（-）电泳NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNN酶切图谱60

（三）限制性核酸内切酶的命名原则

限制酶的命名是采用Smith和Nathans

提议的方案。

属名+种名+株名+编号61

(1)第一个字母（大写）代表产生该酶微生物

（宿主菌）属名。

(2)第二、三个字母（小写）代表微生物种名。

(3)第四个字母代表宿主菌的株或型

（大写或小写）。

(4)如果从一种菌株中发现了几种限制酶，即根据

发现和分离的先后顺序用罗马字母表示。

命名原则如下：62EcoRIEscherichia属名Coli种名Ry13株系编号

举例：大肠杆菌(Escherichiacoli)R株中分离到五种限制酶，分别表示为EcoRI、EcoRⅡEcoRV等。63（四）限制性核酸内切酶的分类

根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。

64

I型限制酶：

属复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种功能；

需要Mg2+、ATP和S-腺苷甲硫氨酸作为辅助因子,具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性；

在DNA链上的识别和切割位点不一致，有随机切割位点，一般在识别位点外上游或下游的1kb至几kb处随机切割，不产生特异片段。

65Ⅲ型限制酶：

有核酸内切酶和甲基化酶功能，但在DNA链上有特异切割位点，其切割位点在识别位点3′以外的24-26bp处。

I、Ⅲ型酶对重组DNA技术无重要价值。

Ⅱ型限制酶

通常指的限制酶。Ⅱ型限制酶分子量小，仅需Mg2+作为催化反应辅助因子。

它能识别和切割双链DNA内部的特异顺序，产生特异的DNA片段，是常用的重要工具酶。66

三类限制性核酸内切酶性质比较性质第一类第二类第三类限制-修饰活性多功能酶限制酶与修饰酶分开多功能酶蛋白质结构三种不同亚基相同亚基二种不同亚基辅助因子Mg2+、ATP、SAMMg2+Mg2+、ATP、SAM分子量大小大切割位点非特定，离识别位点1Kb特定，在识别位点内特定，离识别位点24-26处67（五）Ⅱ类限制性核酸内切酶性状

1.一般性状单链多肽，最适pH为6～8；NaCl有抑制作用,能被Mg2+激活,巯基有保护作用，对热不稳定，常溶于含50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。

68①有严格的识别、切割顺序。它以核酸内切方式

水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段

5′端为P，3′端为OH。

②识别序列一般为4～8个碱基对，最常见的为

6个碱基,

通常是反转重复顺序（正反读出的序列一样），具有180º的旋转对称性（回文结构）。

2.酶的识别、切割特点69Ⅱ类限制酶识别序列特点——

回文结构GGATCCCCTAGG5’3’5’3’限制酶：BamHⅠ正读与反读都相同。以识别序列的中线为对称轴，左右两侧的碱基互补。为便于书写，识别序列可以以5’→3’走向的单链DNA表示。70

5’-GAATTC-3’3’-

CTTAAG-5’5’-GTTAAC-3’3’-

CAATTG-5’EcoRⅠ的识别序列HaeⅠ的识别序列71

常用的限制性核酸内切酶酶切序列限制酶识别序列及切口限制酶识别序列及切口

AluⅠ

AG/CTHindⅢ

A/AGCTT

TC/GAT

TCGA/A

BamHⅠ

G/GATCCSalⅠ

G/TCGAC

CCGAG/GC

AGCT/G

BglⅠ

A/GATCTSmaⅠ

CCC/GGG

T

CTAG/AGGG/CCC

EcoRⅠ

G/AATTC

C

TTAA/G72

酶的识别顺序长度决定了它切割DNA后产生的DNA片段的长短。如DNA链上的碱基随机分布，对于识别四个碱基顺序的酶，识别位点多，切割后片段短。八个核苷酸的Ⅱ型酶，切割后产生的DNA片段长。733.酶切切口

有些酶在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端；很多限制酶不能精确地在2个对称轴部位切割，而在识别序列2条链对应位上错位切割，切割产物有些形成5’-突出的粘性末端,另一些为3’-突出的粘性末端。这些粘性末端的任何一侧都能和另一末端互补配对，使任何含有该识别序列的DNA分子都能和另一个含相同识别序列的DNA分子容易地连接成新的重组分子。74①平末端：

在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割，产生平末端（bluntend），

例如AluI识别的顺序是：

5′AGCT３′

3′TCGA5′

它的切点在G和C之间，在对称轴上将DNA从G与C之间切开：

5′AGCT3′5′-AG

CT-3′

3′TCGA5′3′-TCGA-5′

切口类型：75

5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘

3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT

pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp

TTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）76

②5′粘末端：在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5′末端切割，产生5′端突出的粘性末端（cohesiveend或stickyend）。例如：EcoRI的识别序列：EcoRI5’5’5’775’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG

3’NNNNNCTTAApEcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）pAATTCNNNNNN3'GNNNNNN5’（CohesiveEnds）78

③3′粘末端：

在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3′末端切割，产生3′端突出的粘性末端。例如：PstⅠ（3′端突出的粘性末端）5’-

CTGCAG

-3’3’-GACGTC

-5’795’NNNNNNNCTGCAGNNNNNNNN3’3’NNNNNNNGACGTCNNNNNNNN5’5’NNNNNCTGCA3’NNNNNGpPstⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）

pGNNNNNN3'ACGTCNNNNNN5’5’-CTGCAG

-3’3’-

GACGTC-5’PstI的识别序列3’3’80限制内切酶切出的三种断口814.少数有特殊性质的Ⅱ型酶

（1）异源同功酶又称同裂酶，识别位点相同，酶的来源不同。

从不同原核生物中分离出来的不同的酶，但有相同的识别顺序，切割DNA的位点可以相同，也可不同。这些工具酶可互相代替。82GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ（a）切点位置相同83CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ（b）切点位置不相同84（2）同尾酶识别位点不同，切出片段有相同末端序列有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中。这些酶虽来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端，故称为同尾酶。例如：BamHⅠ、BglⅡ的识别切割序列分别为

BamHI:

5′GGATCC

3′，

Bg1Ⅱ：5′AGATCT

3′85上述２种酶的识别序列中均有5′-GATC-3′，切割后产生的互补粘性末端可彼此连接起来。这种能产生互补末端的同尾酶在分子克隆中有一定作用，增加了灵活性。在少数情况下，两种同尾酶产生的粘性末端连接后得到的重组体不再被原来的任一种同尾酶所识别。例如由SalⅠ（G↓TCGAC）和XhoⅠ（C↓TCGAG）分别切割，然后连接得到的重组体不能再被SalⅠ和XhoⅠ切割。这适用于载体构建需清除某个限制酶切位点时用，但在克隆过程中，若要回收插入片段时，则要慎重选择适当的同尾酶。865’-GGATCC-3’

3’-CCTAGG-5’

BamHⅠ5’-TGATCA-3’

3’-ACTAGT-5’

BclⅠ5’-AGATCT-3’

3’-TCTAGA-5’

BglⅡBamHⅠ

BclⅠ

BglⅡ三种酶可产生相同的

5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的

DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。87

（3）远距离裂解酶（distantcleavage）

这类酶的识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。它们在某一核苷酸区域与识别序列结合，然后滑行到识别序列以外的另1个位点进行切割。此类酶在重组DNA技术中有一定的应用价值。88

（4）可变酶

这类酶是Ⅱ型酶中的一个特例，它们的识别序列中1个或几个核苷酸是可变的，并且识别序列一般大于6个碱基对。

（5）同位酶：识别相同序列切点不同。89

（六）RE应用注意事项酶的活性单位和质量

在适当反应条件下(包括温度、缓冲液的种类、pH、离子强度等)，1小时内完全分解1μg特定DNA底物所需的限制酶量定为1个活性单位。目前出售的几乎所有限制酶均以λ噬菌体DNA(λDNA)作为底物测定其活性单位。好的限制酶应不存在任何核酸内切酶或外切酶的污染；长时间酶解不出现识别序列特异性的下降；以及酶解的DNA片段再连接后能被重新识别并切割等技术指标。90

操作时应注意如下原则：①许多购得的限制酶为浓缩液，当需要从管中取出少量酶液时，必须使用新的灭菌微量加样器吸头，将其稍稍接触液面，这样可取出少至0.1μl的酶液，一个吸头不能反复使用。值得提醒的是加入限制酶的体积不能超过反应总体积的10％，否则酶液中的甘油终浓度达到5％时将会抑制酶的活性。整个操作过程在低温进行，一般总是在加完其他试剂后，最后加酶。91

③酶应分装成小份。当切割大量DNA时，通常用延长反应时间来减少酶的用量，这样做比较节约。④当需要许多管DNA样品中用同一种酶时，应计算所需酶的总量，再将酶稀释液分别加至各个反应管中，以减少酶液贮存管的污染机会。92

⑤当DNA需两种以上的酶切割，且两种酶需不同的缓冲液时，最保险的方法还是单个酶切后，酚／氯仿抽提、乙醇沉淀，改变缓冲液后再进行下一个酶切反应。

⑥贮存与应用限制酶对热不稳定，贮存于-20ºC，为避免反复冻溶使酶失活，商品酶均含有50％甘油，使用时添加相应的缓冲液稀释，降低反应液中甘油的浓度。93酶的星号活力(“星”活性)

限制酶在非标准反应条件下，能切割一些与其特异识别顺序类似的序列，降低酶切的特异性，这种酶的特异性改变或特异性降低而呈现的活性现象称星号活力。

星号活力一般在相应限制酶名称右上角加一个星号(*)表示，如EcoRI

EcoRⅠ：GAATTC

EcoRⅠ*：NAATTN

*代表EcoRI星号活力。94诱发星号活力出现的常见原因有：①反应体系中甘油含量高(>5％)，应使用能完全酶切DNA的最小酶量避免之；②限制酶用量过大(>100μg／gDNA)；③低离子强度(<25mmol／L)；④高pH(pH8.0)，用缓冲液pH降至7.0防止之；⑤含有机溶剂(如二甲基亚砜、乙醇、二甲基乙酰胺等)；Mn2+、Cu2+、CO2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。95（七）II型限制性核酸内切酶

酶解反应的操作1)大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl2

10mMNaCl0-150mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTt

37℃1-1.5hr96

2)II型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切。对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时切低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切973)限制酶切反映要求较纯的底物DNA:

DNA溶液中不能含有痕量酚、氯仿、乙醚、大于10mmol／L的EDTA、SDS和过量的盐等，这些物质的存在均可不同程度地影响限制酶的活性。98在缓冲液中添加2—巯基乙醇或二硫苏糖醇的目的是防止酶的氧化，稳定酶活性。牛血清白蛋白对某些限制酶活性有稳定作用；绝大多数限制酶的反应温度为37℃(有些酶需25℃或50～65℃，请看使用说明书)，酶量和酶切时间则根据DNA底物上酶切位点的多少与DNA总量位点的数目比较后再决定。限制酶反应时间一般1～2小时，也可酌情延长。酶切反应时各液体的混匀不可忽视4)其他因素99限制酶活性不良的可能原因酶已失活，反应体系中有抑制剂存在，缓冲液组成或反应温度不适，电泳凝胶的浓度不适，DNA已甲基化或其他修饰，DNA的纯度未达到，底物中没有所选酶的识别序列，等等。100

1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(1igase)。

二、DNA连接酶101

DNA连接酶催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键，而将两段DNA分子拼接起来。连接酶主要有两种：

T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶在重组DNA技术中常用前者。102

DNA连接酶利用NAD+或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。（一）DNA连接酶的连接机制103连接酶的作用机理104

（二）T4DNA连接酶的特征

分子量为68kD的多肽，催化两个独立DNA片段5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键，把两个DNA分子连接在—起。切口和缺口的区别

DNA分子糖-磷酸主键的破坏称为切口(nick)，这可以通过形成磷酸二酯键来修复。

DNA分子中核苷酸缺失，称为缺口(gap)，这不能单独用连接酶来解决问题。105106T4DNA连接酶可连接：

①两个不同片段双链DNA间存在的互补粘性末端；②两个双链DNA分子间的平末端；③也可连接带切口的双链DNA分子或是RNA—DNA杂交体。两个互补粘性末端的连接效率比两个平末端高得多。107

1、粘性末端连接1092.连接平头双链DNA分子5‘…

G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…

C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…

5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…

3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…

5’

T4-DNA连接酶110

3.与RNA链结合的DNA链上的连接nick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHP5‘…

G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’DNA连接酶111

反应时需ATP、Mg2+和巯基(二硫苏糖醇，DTT)存在，最佳pH为7.5-8.0。连接两个互补粘性末端DNA时，10％聚乙二醇(PEG)可增加水溶液中大分子间的有效作用，促进DNA分子间的连接。连接两个平末端DNA时，单价阳离子(150～200mmol／LNaCl)及低浓度的PEG可大大提高平末端连接的速率。（三）DNA连接酶的反应特征：112（四）DNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP

0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTt4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：

在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量。113平头双链DNA片段的连接操作：从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）

加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用

加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM114三、与DNA合成相关的酶类115（一）

DNA聚合酶DNA重组技术常需要在DNA聚合酶的催化下，在体外合成DNA。常用：大肠杆菌DNA聚合酶I

大肠杆菌聚合酶IKlenow片段

TaqDNA聚合酶反转录酶

116

大肠杆菌DNA聚合酶I是由分子量为109kD的单条多肽链组成的多功能酶。

5′→3′DNA聚合酶活性催化单核苷酸结合到DNA的3′-OH末端，使DNA链从5′→3′延伸。1）DNA聚合活性：

1.大肠杆菌DNA聚合酶I(DNApolI)117

3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’

5‘…

C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘

…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI118聚合反应的特点：

1、聚合反应具有方向性:5’3’2、DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。5’5’引物1192）核酸外切酶活性:5’AGCTTCAGGATC3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAG5’

5′→3′外切酶活性

3′→5′外切酶活性

1205’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’?3’5’外切酶活性

5’3’外切酶活性能切除突变的DNA片段能辨认错配的碱基对，并将其水解AC121DNA聚合酶的用途①催化DNA切口平移反应，制备高比活DNA探针。②对DNA分子进行末端标记。122

1)缺口平移法标记DNA

在DNase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α32P，就能使生成的双链带有标记物。1235‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘Mg2+5‘dNTP5‘pppdA

5‘…G-C-T-C

A-G-C-T-G-G

A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5‘DNaseIDNApolI切口平移标记法制备32P标记的探针（a-32P-dATP）124

2)3-粘端的末端标记先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其补平，在高浓度的dNTP条件下，使3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端带标记的DNA。1255’3’5’3’126大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）1.Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得大肽段，即为Klenow酶。Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。2.Klenow酶小片段N端C端蛋白酶大肠杆菌DNA聚合酶I5核酸外切酶活性大片段（

Klenow片段）

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性1282.Klenow片段的基本用途:

用于:1）随机引物标记核酸探针2）5’-粘端补平3）合成cDNA的第二链4）DNA序列分析5）3’-端的末端标记129TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶。

本酶具有5′3′的聚合酶活性和依赖聚合作用的5′3′外切酶活性。3.TaqDNA聚合酶

1976年从Thermusaquaticus菌中分离纯化到此酶后，直至1985年PCR概念的形成，才将此酶应用于PCR技术的建立和完善。对基因的克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大的作用。130最适温度75℃-80℃

需要Mg2+(10mmol／L)

在低浓度Mn2+(2mmol/L)中有低活性

Ca2+使其完全失活一价阳离子高至0.1mo1