基因工程宿主与转化

基因工程宿主与转化第一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五基因表达系统4.1植物基因转化4.2原核表达系统第二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五4.1农杆菌介导的植物基因转化一、农杆菌农杆菌：根瘤菌科(Rhizobiacease)；土壤杆菌属(Agrobacterium)，革兰氏阴性。

根癌农杆菌

(Agrobacteriumtumefaciens)

放射型农杆菌(Agrobacteriumradiobacter)

发根农杆菌

(Agrobacteriumrhizogenes)

悬钩子农杆菌(Agrobacteriumrubi)第三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五农杆菌是植物的病原菌

根癌农杆菌感染导致冠瘿瘤的形成Themechanismofcrowngallformationhasbeenextensivelyreviewedbyanumberofauthors(Zupanetal.,2000;ZupanandZambryski,1995;Zambryski,1992;ShengandCitovsky,1996;HooykaasandBeijersbergen,1994).

植物病原菌,天然遗传转化系统载体系统－Ti质粒第四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五宿主范围广泛存在于双子叶植物中，据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根癌农杆菌敏感。裸子植物对该菌也具有敏感性，能诱发肿瘤。

一般认为单子叶植物对农杆菌无敏感性。DeCleeneandDeLay(1976)reportedalistofnaturalhostplantsforAgrobacteriumandtheirlistcontained42gymnosperms,596dicotyledonsand5monocotyledons.Thenumberofmonocotyledonsinthelistwasverysmallandnoagronomicallyimportantcerealswereincluded.Thus,thegeneralstatementthatAgrobacteriumdoesnotinducetumoursonmonocotyledonsisnotliterallytrue,butitreflectsgeneralbeliefsoveralongperiodoftime.第五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五单子叶植物与双子叶植物对损伤的响应不同，对宿主范围有影响3种类型用损伤细胞作为保护层（保护层内的细胞木质化）单子叶植物细胞分裂，形成愈伤组织双子叶植物形成创伤周皮第六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五二、冠瘿瘤形成机制Ti质粒编码蛋白介导T-DNA转移；T链（单链）进入植物细胞核，整合到植物基因组中第七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五1.Ti质粒

双链共价闭环DNA，分子量约200kb迄今已从多种植物分离了不同种类的农杆菌，它们的Ti质粒的，结构特性均已清楚。菌株起源致瘤质粒名称

B6苹果瘤＋pTi-B6番茄瘤＋pTi15955NCPPB1001葡萄瘤＋pTi1001C58樱桃瘤＋pTi-C58pAT-C58长病桃树的土壤＋pTi-1D13527白杨瘤＋pTi-27EU6卫矛瘤＋pTi-EU6pAT-EU6第八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五Ti质粒的功能区

T－DNA整合到植物染色体Vir基因介导基因转化

Ti质粒复制起始区Vir区T-DNA区冠瘿碱代谢区1982，Chilton等人用同位素标记Ti质粒做探针与烟草冠瘿瘤细胞DNA杂交；后将章鱼碱型Ti质粒用内切酶SmaI切成19个片段，分别制备探针后与冠瘿瘤DNA杂交；研究结果：两段Ti质粒DNA能和冠瘿瘤DNA杂交,说明这部分DNA从Ti质粒上切割后转移到肿瘤细胞中第九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五

LBRBAuxiniaaMiaaH

tmsCytokininipt

tmrOpinetmt冠瘿碱代谢区复制起始区Vir区Ti质粒tms的编码产物负责合成吲哚乙酸tmr

的编码产物负责合成细胞分裂素tmt

的编码产物负责：合成氨基酸衍生物T－DNA的结构左右边缘序列编码基因可以在植物细胞中表达T-DNA第十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五Tms和Tmr基因的表达使植物细胞内激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长，形成激素自主的特性，导致冠瘿瘤形成。Tms和Tmr基因是致瘤所必需的基因，称为致瘤基因（oncgene)第十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五Vir区基因的功能V区基因介导T链转移至少6个操纵子在链转移中起作用virA(1cistron),virB(11cistrons),virC(2cistrons),virD(4cistrons),virE(2cistrons)andvirG(1cistron)(StachelandNester,1986).-这些基因在侵染植物时表达2.转化机制第十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五信号受体VirA识别化学信号，通过磷酸化激活VirG；VirG为转录调节因子，可上调V区基因表达损伤后植物体的汁液呈酸性，含各种物质，包括木质素，类黄酮生物合成途径中产生的酚类物质，受损伤后的植物汁液诱导v区基因表达(Stacheletal.,1985)，其中最有效的酚类化合物是乙酰丁香酮第十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五T链的形成及转运

在VirD1,VirC1（and,possibly,VirD3）蛋白的协助下，VirD2蛋白识别左、右边缘序列，在第3和第4个核苷酸之间切割下面单链产生缺口（Zambryski,1992).第十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五VirD2共价结合T链5’端，随着Ti质粒DNA的合成，T链被“释放”。VirE2为单链DNA结合蛋白，VirE2结合T-DNA形成T链复合体；T链的转化仅要求边缘序列VirD2第十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五VirB和VirD4是膜蛋白，在农杆菌与植物细胞之间形成通道，T链复合体经该通道进入植物细胞质，从植物细胞质到植物细胞核由VirD2好VirE2蛋白的核定位信号介导

(ShengandCitovsky,1996).第十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五整合T链复合体进入植物细胞核后，会形成双链，T-DNA编码的基因在整合前会表达，被称为瞬时表达(Kapilaetal.,1997).不清楚双链的形成发生于整合前还是整合后，人们认为整合从左边缘开始(Konczetal.,1994).第十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五整合可能由宿主DNA复制和修复机制中的酶介导，插入位点是随机的(Konczetal.,1994)，有人提出VirD2andVirE2可能参与整合(Rossietal.,1996).第十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五附着

细菌附着植物细胞壁是转化的前提条件；农杆菌从植物伤口进入植物体，在植物体汁液中繁殖并附着到植物细胞壁上(Zambryski,1992)，有学者认为农杆菌染色体编码的基因chvA、chv、pacA、att和植物细胞表面受体（包括蛋白和糖）参与细菌的附着(ShengandCitovsky,1996)第十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五ChvA、ChvB、ChvC农秆菌附着功能有关，这三个基因突变使农杆菌与植物细胞的附着率下降10倍；ChvB基因产物催化合成β-1,2-葡聚糖，由ChvB调控的β-1,2-葡聚糖可能在农杆菌附着过程中起关键作用；ChvA编码产物与多糖从细胞质转运胞外有关。第二十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五ExoC

与环化葡聚糖和琥珀酸多聚糖的合成有关，ExoC基因突变，农杆菌不能合成环化的β-1,2-葡聚糖，细菌不能附着在植物细胞上，无致瘤能力。Cel

与细菌表面纤维丝的合成有关，Cel基因突变体不能合成纤维素细丝，细菌附着到植物细胞表面后容易被水洗脱。Att影响农杆菌细胞表面蛋白的合成，Att突变体缺少一种34kD和38kD的多肽，这些多肽是细胞外膜和细胞周质蛋白，影响农杆菌附着。第二十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五

三、植物基因表达载体tmrtmstmtT-DNALBRBvirTi质粒野生型Ti质粒的缺点:Ti质粒分子量过大，难操作；

Onc基因致瘤onc改造：除去ONC基因安装大肠杆菌复制子；安装植物细胞选择标记第二十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五

一元载体系统也称共整合载体(co-integratedvector),顺势载体(cis-vector)

卸甲载体中间载体一元载体系统第二十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五卸甲载体:切除T-DNA中的Onc基因，称disarmedvector；作用：提供vir功能virori冠瘿碱分解代谢LB卸甲Ti质粒第二十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五经典卸甲载体：pGV3850

T-DNA边界区，胭脂碱合成酶基因(nos)；

T-DNA以外的全部序列；

T-DNA缺失部分被pBR322序列(含Ampr)取代pBR322nosvirpGV3850第二十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五中间载体(intermediatevector)

大肠杆菌的克隆载体(如pBR322),应是多拷贝小质粒。特征:

含与卸载质粒T-DNA区同源的序列，可与卸载质粒T-DNA高频地同源重组；具有细菌选择标记，便于筛选共整合质粒；有bom位点，便于结合转移；含有植物选择标记，如新霉素磷酸转移酶基因(Npt-II)；含单一的限制性内酶位点；植物的启动子。第二十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五作用：

用于克隆目的基因；通过同源重组机制将目的基因整合到卸甲载体的T－DNA上；提供T－DNA边缘序列第二十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五第二十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五共整合转化程序基础：农杆菌与大肠杆菌之间可以高效地接合转移；Tra基因群功能T-DNApBR322oriNPTII

(Kmr

)大肠杆菌质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记多克隆位点重组质粒转化大肠杆菌农杆菌细菌接合T-DNA区同源整合农杆菌感染植物根部细胞T-DNA区整合在植物细胞基因组上第二十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五三亲株杂交(triparentalmating)

通过细菌结合转移机制将中间载体导入农杆菌

农杆菌菌株：

受体；卸甲Ti质粒；农杆菌复制起点大肠杆菌：

辅助质粒；提供Tra功能和Mob功能；大肠杆菌复制起点大肠杆菌：

中间载体；穿梭质粒；bom位点；E.coli复制起点、广谱复制起点第三十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五pRK2013Tra,mob+

E.coliKm

E.coli

pMon200bom+Spc/StrpRK2013pMon200pTiB6S3-SEbom+Spc/StrKmLBRBYFG农杆菌农杆菌三亲株杂交三亲株杂交TriparentalMatingSpc壮观霉素Str链霉素Km卡那霉素pRK2013—结合转移型质粒，E.coli复制子pMON200—中间载体，E.coli和农杆菌复制子第三十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五双元载体系统T-DNA与Vir基因位于两个独立的质粒上，通过反式作用激活T-DNA转移，称反式载体(transvector)辅助质粒virLBRB微型Ti质粒第三十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五微型Ti质粒(mini-Tiplasmid):

T-DNA边界序列广谱质粒复制位点，如RriV

原核和真核选择标记克隆位点辅助质粒(helperplasmid):缺失T-DNA区段的Ti质粒，本身丧失致瘤功能，相当于卸载Ti质粒。主要作用是提供Vir基因功能。第三十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五经典双元载体Bin19:

pTiT37的左右边界序列；Npt-II基因；LacZ基因；多克隆位点；广泛宿主质粒Rk2的复制和转移的起始位点优点：质粒小、宿主广;带有EcoRI、BamHI、HindIII、SstI、KpnI、SmaI、XbaI及SalI组成的多克隆位点;可以进行蓝白斑筛选;可以直接转化农杆菌(冻融法)第三十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五第三十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五第三十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五第三十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五四、植物基因转化程序基因构建农杆菌菌株受体植株组培体系植物基因转化第三十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五植物基因转化程序

培养纯化农杆菌农杆菌菌液预培养植物材料植物材料

共培养

→抑菌和选择培养↓芽分化↓再生植株分子鉴定表型筛选田间试验遗传稳定性研究感染第三十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五1.基因构建启动子目的基因Nos3`LBMCSnosPNpt-IInos3’RBBin19微型Ti质粒EcoRIKpnISmaIBamHIXhaISatIHindIII第四十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五LB启动子目的基因Nos3`nosPNpt-IInos3’RB

大肠杆菌克隆重组质粒

农杆菌工程菌株重组微型Ti质粒转化测序鉴定转化农杆菌第四十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五卸甲Ti质粒LBPNptIIterP目的基因terRBvir农杆菌重组微型Ti质粒-70℃20%甘油保存第四十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五植物基因转化前期研究中，学者们构建了一些载体,主要是双元载体(HellensandMullineaux,2000)。这些载体的应用不依赖于植物材料，许多可选择的载体。但前期研究中仅有几种农杆菌菌株在植物基因转化中得到开发利用(AndersonandMoore,1979)。载体和菌株的选择对转化效率会产生一定的影响，有时候，某一物种的转化只能借助个别的载体和菌株第四十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五农杆菌菌株A281(Komarietal.,1986)具有超强的“毒性”有更宽的宿主，和更高的转化效率(Komari,1989)。该菌株特性与所含质粒pTiBo542有关第四十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五建立在pTiBo542基础上的两个转化系统得到开发；EHA101(Hoodetal.,1986)EHA105(Hoodetal.,1993)都携带卸载pTiBo542EHA105所携带的微型Ti质粒含pTiBo542的virB,virC,virG(Komari,1990)这两菌株在转化各种植物中都表现出很高的转化效率第四十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五额外的virE、virG的拷贝的存在有利于转化率的提高(Srivatanakuletal.,2000;Parketal.,2000).virGN54D(突变的VirG)在农杆菌中组成性表达，较野生型菌株有更高的转化效率(VanderFitsetal.,2000)。当该基因在质粒存在多拷贝时可进一步增加转化效率。virGN54D不需要诱导。第四十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五Hieietal.(1994)和Dongetal.(1996)对pIG121Hm与pTOK233对水稻的转化率进行了比较：容易转化的物种，pIG121Hm与pTOK233转化率差不多，对难转化的物种转化率相差很多pIG121Hm:aderivativeofthemostcommonlyusedvectorspBI121pTOK233:asuper-binaryvector第四十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五

植物细胞具有全能性，在离体培养条件下，通过诱导有可能分化，获得再生植株。

植物细胞、组织完整植株2.植物基因转化的受体系统离体培养植物材料选择外植体选择培养基选择激素选择对抗菌素敏感性试验第四十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五外植体：叶、茎、根、块茎、子叶、上胚轴、下胚轴、成熟与未成熟胚、培养细胞外植体和基因型是植物基因转化中非常重要的影响因子

选择旺盛分裂，将要分裂，有能力再生植株的材料原因：整合需要复制机制中的酶，这些酶在细胞分裂时活性最高；转化株系的再生也需要细胞分裂第四十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五学者们认为转化需要植物具有伤口(LippincottandLippincott,1975).转化强烈依赖植物的损伤响应（细胞增殖和再生的生物学基础）对难转化的双子叶植物，单子叶植物成熟与未成熟胚是很好的材料；未成熟胚的生理状态很重要，仔细选择胚的发育阶段允许细菌进入产生诱导Vir基因表达的信号使宿主细胞进入瞬时感受态，旺盛分裂不同植物对受伤的响应是不同的，未必能引发细胞分裂损伤响应不活跃的植物，可选择未成熟的材料做外植体（子叶、胚轴）第五十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五常规程序：共培养；适于细胞增殖和植株再生的培养基组培技术在准备材料上也很重要,植物基因转化常用组培苗做材料，外植体常培养于愈伤诱导培养基上，组培苗常是良好的转化起始材料。对同一来源的材料要选择细胞，如用愈伤做转化的材料，可在解剖镜下选择好的愈伤。这种选择会影响转化效率这种培养条件下的外植体包含活跃分裂的细胞或即将分裂的细胞植物材料通常预培养在诱导愈伤的培养基上；共培养时植物材料处于脱分化过程（损伤诱导或激素诱导作用）转化细胞经胚胎发生、器官发生再生植株第五十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五基因型会影响转化效率，有的栽培品种更容易转化Forexample,callusculturesfrommatureseedsarethematerialofchoiceforeasycultivarsofJaponicarice,suchasNipponbare,andimmatureembryosarethebestchoiceforIndicacultivars第五十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五外植体的预培养预培养时间一般2-3天，因材料而异，促进细胞分裂，对田间材料起驯化作用，使其适应离体培养条件。第五十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五3.侵染与共培养农杆菌培养：常用培养基：LB、YEB、YEM；温度：25-30℃（28℃）2-3天（固体）/1-2天（液体）；菌的活化：选择培养基上划线挑取单菌落→液体培养/选择抗菌素工程菌侵染悬浮液的制备：12-24h培养→对数生长期4000rpm离心收获细胞，加入植物诱导愈伤或芽分化培养基，使光密度至0.1~0.5OD,作为接种工程菌液。1OD（600nm)=8x108用植物生长培养基悬浮培养几小时再接种有利于转化。第五十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五水稻：1.0×108~1.0×1010(AldemitaandHodges,1996;Dongetal.,1996;Hieietal.,1994)玉米：5.0×108and2.0×109cfu/mlformaize(Ishidaetal.,1996).侵染时间：一般数秒到数分钟，不超过30分钟。菌液浓度OD0.05-0.7,对农杆菌敏感的植物用较低的浓度，较短的时间。滤纸吸去过量的菌体→共培养第五十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五Co-cultivationisadynamicstep,inwhichatleastthreeimportanteventsaretakingplace;plantcellsaredividinganddedifferentiatingunlesstheyarealreadyfullydedifferentiated,bacteriaarealsodividingfurther,T-DNAisbeingtransferredfrombacteriatoplantcells.共培养培养基影响转化率,选择促进细胞活跃分裂的培养条件菌液侵染↓共培养植物、细菌细胞分裂；整合第五十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五共培养植物诱导愈伤培养基或芽分化培养基，一般在固体培养基上进行。要求：

外植体细胞分裂

农杆菌在切口生长共培养时间:农杆菌附着16h后才能发生转化，共培养时间2-7天，因植物材料而异。共培养时间过长植物细胞会因农杆菌毒害而死亡。依据获得转化愈伤频率或转化不定芽频率而定。农杆菌增殖适度:农杆菌增殖不良，切口处只有很少的农杆菌生长，转化机率很小，过渡生长引起外植体褐化死亡，应适度。第五十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五Vir区基因的活化诱导物的使用

农杆菌培养时加AS，制备工程菌侵染液使用前4-6小时；在共培养培养基中加AS，一般农杆菌附着16小时后才会发生转化；农杆菌培养和共培养时都加AS与甜菜碱（1mmol/L)或脯氨酸（1umol/L)同时加入，对Vir基因活化有协同作用。50~200uMAS+100mg/L抗坏血酸可以防止AS氧化。乙酰丁香酮（acetosyringone,AS)羟基乙酰丁香酮（hydroxyacetosyringone,OH-AS）第五十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五诱导物使用的pHpH5.0-5.6时，Vir基因的诱导达到最高水平，pH改变0.3时对多数植物的转化率有明显的影响。温度VirD、VirG基因的活化受温度的影响，必须低于28℃。诱导Vir基因表达的最佳温度在15℃~25℃之间农杆菌培养基pH7.2,植物组织培养基pH5.8(MS高压灭菌后pH下降0.3)T链转移在19℃最活跃农杆菌最佳生长温度28°C~30°C组培温度25°C左右第五十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五有研究报道菜豆和烟草转化中共培养在22℃时转化率最高共培养时要平衡T链转移，农杆菌和植物细胞活力对温度的要求Dillenetal.(1997)reportedthattransientexpressionofthegusdeliveredbyAgrobacteriumtoPhaseolusacutifoliusandN.tabacumwashighestat22°Canddecreaseddramaticallyabovethattemperature.Thetemperatureofco-cultivationshouldbecarefullyadjustedtobalancetheactivityoftheT-DNAtransfermachineryandtheviabilityofboth,theplantcellsandAgrobacterium.Inrice,theefficiencyoftransformationwashighbetween22°Cand28°C(Hieietal.,1994).第六十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五pH值和渗透势影响转Vir基因表达冠廮碱醛缩糖增加Vir基因表达外源Ca+浓度明显影响转化培养基中添加酵母提取液；培养基中的糖和高浓度的肌醇可以促进Vir基因的表达。Duringco-cultivationotherfactors,suchasanacidicpH(Alt-Moerbeetal.,1988;Turketal.,1991)andhighosmoticpressure(Usamietal.,1988),havealsobeenreportedtobeimportantfortheexpressionofvirgenes.Veluthambietal.(1989)foundthatopinesstimulatedtheinductionofvirgenes.Shimodaetal.(1990)andCangelosietal.(1990)reportedthatagroupofaldoses,includingd-glucoseandsomenon-catabolisablesugars,suchas2-deoxy-d-glucoseand6-deoxy-d-glucose,markedlyenhancedtheexpressionofvirgenes.Theeffectsofsugarswereclearwhenlevelsofphenolicinducerswerelimited.Inaddition,Montoroetal.(2000)reportedthatexogenouscalciumconcentrationsignificantlyaffectedgenetransferfromAgrobacteriumtocellsofrubbertree(Heveabrasiliensis).第六十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五共培养后

(1)选择和增殖转化细胞

(2)消除农杆菌

(3)再生植株抗菌素抑制农杆菌:羧苄青霉素头孢类抗菌素抗菌素的选择影响转化率4.选择转化细胞第六十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五选择压、非转化细胞对转化细胞构成胁迫，可能对转化细胞有负面影响。组培条件可能有重要影响

如，培养基成分，继代培养程序

第六十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五常用选择标记：新霉素磷酸转移酶：提供转化细胞对卡那霉素抗性、G418抗性潮霉素磷酸转移酶：提供对潮霉素抗性Npt-II(新霉素磷酸转移酶/氨基糖苷磷酸转移酶）

来自Tn5转座子通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗菌素失活，

对茄科植物烟草、马铃薯、番茄等特别有效，对豆科植物和单子叶植物效果不佳。第六十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五裸子植物相关报道很少(Tzfiraetal.,1998)

落叶松和美国五针松(LarixkaempferiTxL.decidua,Levéeetal.,1997andwhitepinePinusstrobusL.,Levéeetal.,1999).银杏：获得转化愈伤五、植物转基因研究进展Embryoniccelllinespreparedfromzygoticembryoswerethetissuesinfected.transformedcalluswasobtainedfromexcisedembryosinfectedwithAgrobacterium(Dupréetal.,2000).第六十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五双子叶植物

木本植物杨树GenesrecentlyintroducedintoPopulusincludeglutaminesynthetasegene(Gallardoetal.,1999),genesinvolvedinflowerdevelopment(Rottmannetal.,2000)andherbicideresistance(Confalonierietal.,2000).桉树

Typically,leaforstemsegmentsarepreparedfromplantsgrownintissueculturevessels,preculturedonacallusinductionmediumandinfectedwithAgrobacteriumEucalyptuscamaldulensiswastransformedwithaninsect-resistancegeneandaherbicide-resistancegenebyinfectingexplantsfromcotyledonsandhypocotylswithAgrobacterium(Harcourtetal.,2000).第六十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五果树日本柿子梨苹果猕猴桃葡萄柑橘胡桃Examplesare:astresstolerancegeneinJapanesepersimmon(DiospyroskakiThumb.,Gaoetal.,2000);adiseaseresistancegeneinpear(PyruscommunisL.,Reynoirdetal.,1999);agenethataffectsrootingofapplerootstock(Malusdomestics,Zhuetal.,2001);anddiseaseresistancegenesinkiwifruits(Actinidiadeliciosa,Kobayashietal.,2000)andingrapevine(Vitisrupestris,Spielmannetal.,2000).Leafsegmentswerethestartingmaterialsinmostofthecases.Improvementoftransformationwasreportedincitrus(Ghorbeletal.,1999;LuthandMoore,1999;Yangetal.,2000b),inwhichepicotylswereinfectedwithAgrobacterium,andinwalnut(Juglansregia),inwhichsomaticembryoswerethetargettissues(Tangetal.,2000).第六十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五豆科植物

大豆Attemptsattransformationoflegumespeciesweremainlyaimedatdevelopmentandimprovementofthemethodology.Transformationofsoybean(GlycinemaxMerril.)mediatedbyAgrobacteriumhasbeendifficultforalongtimebutappearsrecentlytobewellestablished.Targettissueswerecotyledonarynodes(DonaldsonandSimmonds,2000),immaturecotyledonaryexplants(Yanetal.,2000),maturecotyledonaryexplants(Zhangetal.,1999;Clementeetal.,2000),embryogeniccalliorgerminatingseeds(Kisakaetal.,2000).第六十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五瓜尔豆豌豆木豆四季豆鹰嘴豆花生刺槐Transformationofguar(CyamopsistetragonolobaL.,Joersboetal.,1999),pea(PisumsativumL.,Nadolska-OrczykandOrczyk2000;Polowicketal.,2000;Perrinetal.,2000),pigeonpea(CajanuscajanL.,Geethaetal.,1999),kidneybean(PhaseolusvulgarisL.,Kisakaetal.,2000),chickpea(CicerarietinumL.,Krishnamurthyetal.,2000)andpeanuts(ArachishypogaeaL.,SharmaandAnjaiah,2000)havealsobeenreported,andinfectedtissuesweresimilartothoseusedinsoybean.Transgenicplantsofaleguminoustree,Robiniapseudoacacia,wereobtainedfromleafandstemsegmentsinfectedwithAgrobacterium(Igasakietal.,2000).第六十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五茄科植物烟草矮牵牛番茄马铃薯茄子Tobacco(N.tabacumL.andotherspecies),petunia(Petuniahybrida),tomato(LycopersiconesculentumMill.)andpotato(Solanumtuberosum)aretheplantsmostfrequentlyhandledinstudiesinplantmolecularbiologyandbiotechnology.Theso-calledleafdisktransformationmethodwasfirstdevelopedforthesespecies,whicharestilltransformedbyessentiallytheoriginalmethodofHorschetal.(1985).Occasionally,methodimprovementsforotherspeciesinthefamily,suchaseggplant(Solanummelongena,Hanyuetal.,1999),havebeenreported.第七十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五十字花科拟南芥大白菜洋白菜花椰菜油菜豆瓣菜ThereisnoquestionthatArabidopsisisthespeciesthatismostfrequentlytransformedinthisfamily,andinplantatransformationisthemethodofchoice.Transformationofotherspeciesinthefamilyislessstraightforward,andanumberofstudiesofimprovementshavebeencarriedout.RecentexamplesincludetransformationofcotyledonaryexplantsofChinesecabbage(BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis,Zhangetal.,2000)andcabbage(BrassicaoleraceaL.var.capitata,PiusandAchar,2000);leafdisksofbroccoli(BrassicaoleraceaL.var.italica,Henzietal.,2000);etiolatedhypocotylsofBrassicanapus(Schröder-Pontoppidanetal.,2000);andcalliofwatercress(Rorippanasturtium-aquaticum,Jinetal.,1999).第七十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五工业及药用植物（IndustrialCropsandMedicinalPlants)

棉花Cottonisapopularsubjectofstudiesinbiotechnology,andinsect-resistant,disease-resistantorherbicide-resistanttransgenicshavebeenobtainedfromhypocotyls,cotyledonsorshoottipsinfectedwithAgrobacterium(Wilkinsetal.,2000).第七十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五洋麻橡胶树咖啡罂粟花菱草毛地黄薄荷王不留行青蒿宽叶薰衣草甜瓜Infectedtissuesinsuccessfultransformationsrecentlycarriedoutforthedevelopmentofgenetransfermethodsinotherspecieswere:shootapexofkenaf(Hibiscuscannabinus,Srivatanakuletal.,2001);calliofrubbertree(Heveabrasiliensis,Montoroetal.,2000)andcoffee(Coffeacanephora,Hatanakaetal.,1999);cotyledonsofopiumpoppy(Papaversomniferum,ParkandFacchini,2000b)andCaliforniapoppy(EschscholziacalifornicaCham.,ParkandFacchini,2000a);leaforstemsegmentsoffoxglove(DigitalispurpureaL.,Kogaetal.,2000b),Menthaspecies(Krasnyanskietal.,1999;Niuetal.,2000;Diemeretal.,1999),Vaccariapyramidata(Kogaetal.,2000a),ArtemisiaannuaL.(Chenetal.,2000)andLavandulalatifolia(Nebaueretal.,2000);andsomaticembryosofcasaba(Manihotesculenta,Sarriaetal.,2000).第七十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五其它双子叶植物

冰叶日中花大牵牛花生菜胡萝卜夏堇（蓝猪耳）

Transformationmethodshavebeendevelopedfortwoimportantmodelplants,iceplant(Mesembryanthemumcrystallinum),inwhichrootorhypocotyltissueswereinfectedwithAgrobacterium(Ishimaru,1999),andJapanesemorningglory(Pharbitisnil),inwhichimmaturezygoticembryosweretargeted(Onoetal.,2000).Otherinterestingstudiesincludeintroductionoftheiron-bindingproteinferritinintolettuce(Lactucasativa,Gotoetal.,2000)andenhanceddiseaseresistanceintocarrots(DaucuscarotaL.,TakaichiandOeda,2000),andmodificationofflowercolourinToreniafournieriLind.(Aidaetal.,2000).第七十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五T-DNA两端左右边界为25bp的重复序列，称为左边界(BL)和右边界(BR),该25bp边缘序列属保守序列

TGACACGATATATTGGCGGGTAAACT-DNA的转移由边缘序列决定，与T-DNA的其他基因和序列无关。返回第七十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五用转座子使T-DNA基因突变确定了这些基因的功能P32标记的Ti质粒片段与肿瘤细胞polyA-RNA杂交，检测到章鱼碱型肿瘤有12个mRNA（8个为TL-DNA转录产物，4个为TR-DNA转录产物）；胭脂碱型肿瘤有13个mRNA。已知T-DNA的保守区转录6个mRNA,章鱼碱型和胭脂碱型肿瘤中这些转录产物是相同，他们的转录方向和位置均已确定。第七十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五共同点:T-DNA上每个基因都有各自的启动子基因转录由植物RNA聚合酶II完成

T-DNA具有典型的真核生物RNA合成起始和终止调节信号，其5’端转录起始处有TATA和CAAT盒。同一条链上发现AATAAA加尾信号。返回第七十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五激素合成酶的基因

Aux，后称Tms(tumourmorphologyshoot)基因

Aux-1(Tms-1)，也称Iam或IaaM基因，基因1色氨酸→吲哚乙酰胺(indoleacetamide,IAM)

Aux-2，也称IaaH基因，基因2

吲哚乙酰胺（IAM）→吲哚乙酸(IAA)返回IaaH吲哚乙酰胺水解酶，催化色氨酸单加氧酶(tryptophanmono-oxygenase)催化第七十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五

Cyt基因，突变引起易生根特性，固称Tmr(tumourmorphologyroot)isopentenyl-AMP为细胞分裂素，该基因现称ipt基因,基因4返回ipt基因编码异戊烯基转移酶(isopentenyltransferase)催化异戊烯基焦磷酸盐（isopentenylpyrophosphate)AMP异戊烯基-AMP（isopentenyl-AMP)第七十九页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五冠瘿碱合成酶基因：根据冠瘿碱合成酶编码基因，Ti质粒可分为：章鱼碱型胭脂碱型农杆碱型农杆菌素碱型冠瘿碱为特殊氨基酸衍生物，农杆菌可利用冠瘿碱做为氮源，植物细胞不能利用冠瘿碱返回第八十页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五VirA植物受伤后会分泌化学信号，其中包括乙酰丁香酮（酚类化合物），VirA编码产物位于细胞膜上，可能是乙酰丁香酮的受体。当乙酰丁香酮(AS)与VirA蛋白的TM-2区结合后，会使整个蛋白构象发生变化，其C端活化。VirA蛋白的胞质区有自激酶(autokinase)的功能,可在保守的组氨酸残基上磷酸化，VirA蛋白被激活。磷酸化的VirA蛋白具有转移其磷酸基至VirG蛋白的一个天门冬氨酸残基的能力，使VirG蛋白活化。第八十一页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五VirG

VirG是转录调节蛋白，C端有DNA结合结构域。virG被virA诱导表达，之后它可以诱导其它Vir基因表达。VirA或VirG突变，农杆菌完全失去毒性。返回第八十二页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五VirD该基因座含4个开放读码框，其中两个蛋白可能参与T-DNA转移过程的起始，包括在T-DNA上产生单链缺口，之后共价结合到游离的DNA末端，这些蛋白可能对精确的T-DNA转移负责。

VirD1首先与25bp边界序列结合，使其松弛VirD2在边缘序列特异位点剪切VirD2的功能：特异剪切，并与T链的5’端共价结合，使T链免受核酸酶的攻击；VirD2C端含有核定位信号(nucleartargetingsequence),引导T链进入到植物细胞核。返回第八十三页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五VirE

这个基因座编码单链DNA结合蛋白，保护单链T-DNA，有助于T-DNA-单链DNA结合蛋白丝转入植物细胞。VirE2编码ssDNA结合蛋白，非特异结合任何ssDNA。包被T链形成核蛋白丝。功能：解折叠、保护VirBVirB操纵子由11个基因组成，绝大多数编码跨膜蛋白和附膜蛋白。其中3个确定为膜外蛋白，一个为内膜蛋白，这些蛋白可能在膜上形成通道。返回第八十四页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌基因表达系统

目的基因表达水平高，培养周期短；目前大多数外源基因都是以大肠杆菌为受体系统进行表达的，是迄今为止应用最广泛的基因表达系统。5.2原核表达系统第八十五页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五大肠杆菌质粒表达载体：

大肠杆菌复制起点

原核启动子

SD序列

选择标记

多克隆位点

原核终止子

标签第八十六页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五T7启动子：

T7噬菌体基因10的启动子，不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别和启动；

T7RNA聚合酶特异性地启动T7启动子而不启动其它大肠杆菌启动子，合成RNA的效率比大肠杆菌聚合酶高许多倍，且较少发生转录终止；

宿主RNA聚合酶所进行的转录无法与之竞争，使细胞中几乎所有的转录都由T7RNA聚合酶操纵，外源基因转录产物可达

rRNA的水平。第八十七页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五pET载体要求的受体细胞野生型大肠杆菌不含T7RNA聚合酶基因。前期研究中，T7RNA聚合酶基因已被置于lacuv5启动子的控制下，整合到大肠杆菌染色体上，构建了能诱导表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌菌株。含有上述特征的常用宿主细胞有BL21(DE3)和JM109(DE3)。BL21(DE3)菌株缺失细菌外膜蛋白酶ompT和蛋白酶lon，增加了外源蛋白的稳定性。第八十八页，共一百零一页，编辑于2023年，星期五SD序列（转译起始序列）1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，翻译起始密码子AUG上游能够和16SrRNA3’端序列互补，是rRNA的识别与结合位点，命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列，由3－9bp核苷酸组成的序列，即UAAGGAGGU或其中一部分，一般至少含AGGAGG序列中的4个碱基。mRNA5’——AGGAGGU——UUGACCU-AUG——UCCUCCA

3’——5’

rRNA3’端mRNA在细菌中的转译效率严格依赖于是否有核糖体结合位点即SD序列的存在，以及SD序列与起始密码子AUG之间的距离。第八十九页，共一百零一页，编辑于2