T-DALN 029-2023 生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测

ICS65.020.30CCSB40团 体 标 准T/DALN029-2023生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测StaphyiococcusQuantitativetestinginFreshmilk 2023-05-04发布 2023-05-19实施辽宁省奶业协会协会发布T/DALN029-2023T/DALN029-2023前  言本文件参照GB/T1.1-2020《 化工作导则第1部分： 化文件的结构和起草规则给出的规则起草。本起草单位：辽宁省奶业协会、辽宁奉牧联合奶业有限公司、沈阳师范大学食品学本主要起草人：佟艳、李润国、朱旻鹏、杨明洁、贾丽娇、王南南、白春生、唐莹、高忠梅、白子金、高林、杜宏伟、郑晓明、王长霞本由辽宁省奶业协会提出并归口。本版权归辽宁省奶业协会。本首次发布。生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测范围本 规定了生鲜乳中金黄色葡萄球菌定量检测的术语与定义及仪器设备和试剂鉴定金黄色葡萄球菌引物与探针说明、实验方法、结果判定、人员防护、注意事项等。本适用于生鲜乳中金黄色葡萄球菌的定量检测。规范性引用文件（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范NY/T541动物疫病实验室检验采样方法YY/T1173聚合酶链反应分析仪JJF1527聚合酶链反应分析仪校准规范术语和定义下列术语及定义适合于本文件金黄色葡萄球菌 Staphyiococcus实时定量聚合酶链反应 QuantitativeReal-timePCR）PCR（QuantitativeReal-timePCR）DNADNA引物PrimerDNAPCR模板TempiateDNAPCRYY/T1173JJF1527-201仪器设备和试剂仪器和设备灭菌处理器具:1.5mLPCRTipPCR微量离心机可调微量移液器（10μL～1000μL）微量蛋白-核酸检测仪试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂,水为灭菌双蒸水。DNAAceQUniversalUProbeMasterMixV2。5扩增基因金黄色葡萄球EbpS基因（GenBank:U48826.2）。引物使用说明引物EbpS-F、EbpS-R、EbpS-Probe在使用时用灭菌双蒸水稀释成浓度为10umol/L。探针说明EbpSTaqMan5’端标记为：6-FAM（6-羧基荧光素）；3’端标记为：BHQ1（）。目的片段预计扩增目的片段134bp。质控质粒EbpS-pMD-19-T-DH5αLB20mLLB180rpm/min12h5mLEbpS实验方法样品准备模板制备按照基因组DNA提取试剂盒的说明书提取各乳样DNA。检验步骤PCR30min，根据检测数量和孔反应，设置荧光收集反应孔数和反应参数，反应程序和条件如下表所示：表1PCR反应程序要求PCR反应程序反应温度反应循环污染消化21个循环预变性51个循环95℃1045个循环60℃3045个循环8EbpS10DNA3表2PCR反应体系PCR反应体系反应组分添加量（μL）AceQUniversalU+Probe10F、R(10μM)0.4TaqManProbe(10μM)0.2模板2无酶水25μLPCRPCRCtCty=-3.3141x+44.364（yCtDNA。数据处理，根据曲线，计算每个反应孔中检测核酸浓度。结果判定根据曲线计算孔中检测核酸浓度，当孔内DNA浓度超过9.6ng/μL时，判定检测9.56×104CFU/mL；当孔内DNA9.6ng/