分子生物学蛋白组学

分子生物学蛋白组学第一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五梁漱溟-做学问的八个境界形成主见发现不能解释的事情融会贯通知不足以简御繁运用自如一览众山小通透精髓-言简意赅实用-会用-驾轻就熟归纳-系统化比较-推敲-设问求证-旁征博引问题-疑惑中心思想辨真伪-证优劣-识差别文献的阅读-理解-掌握的八个步骤意义-方法-应用第二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet第三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

验证Validation

阐明机制Mechanism

假说（基因型-候选基因）Hypothesis-CandidateGene求证Test

生物表象-疾病（表型）Phenomenon

假说主导的生物系统科研思维逻辑PHTMV给予或剥夺候选基因功能GainorLossofCandidateGeneFunction

生物表象或疾病PhenomenonorDisease候选基因功能体现/丧失系统的组份-结构-功能Component-Structure-Function

候选基因-作用方式，等CandidateGene-style,etc.分子机制验证于新的生物系统Mechanismvalidatedinanewbio-system第四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五LogicalEvolutionaryofBiochemistryLiu(2010)AnnRevBiochem分析-研究

组份-结构-功能某种生命症象重构系统分子功能干预

样品分析

揭示分子机制组份-结构-功能分子特性分子复合物代谢-调节环路转基因动物模型Knock-outKnock-inScientificInterrogationStrategy第五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet第六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

验证Validation

阐明机制Mechanism

生物表象或疾病TraitorDisease求证Test

多个组学数据（DateofMultiomes）

数据主导的生物系统科研思维逻辑DTTMVorDDTMV

表型组数据（DateofPhenome）

第七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五BiologicalSystemsMultiple-OmicsfromMultiomestoPhenomeRitchie(2015)NatRevGenetic,Synder(2012)Cell-Trait第八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五PhenotypicOutcomesGeneratedGenetically&EpigeneticallybyMulti-OmesRitchie(2015)NatRevGeneticEstrogen→carcinogenicbyproduct→DNAdamage→cancercells↑←dysregulationofcellcycleCYPmutant↑↓↑COMTmutant↑DNArepairXRCC↓↓第九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Complex-TraitPhenotypesRevealedbyMulti-OmesRitchie(2015)NatRevGenetAsystemsgenomicsapproachestoachieveamorethoroughandinformativeinterrogationofgenotype-phenotypeassociation,throughbuildingamultivariatemodelassociatedwithgivenoutcomes第十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五CategorizationofMulti-StagedAnalysisofPhenotypeRitchie(2015)NatRevGenet第十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五CategorizationofMeta-DimensionalAnalysisRitchie(2015)NatRevGenet第十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五IntroductiontoProteome&ProteomicsTostudyproteinmolecules,theprinciplesofproteinseparationandquantification,andtheidentityanalysisofproteincharacterizationhavetobedeveloped.Proteome

indicatestheentireofproteinscompletelyexpressedbyagenomeoratissueoracelltype.(theentirety)Proteomicsistostudyquantitativechangeinexpressionlevelsofprotein,

andtheirapplicationtodrugdiscovery,diagnosticsandtherapy.(thequantity)Therightstrategythroughproteomicswouldbeappliedtoquantitativelyanalyzetheinducedbiologicalchangesversustheinherentbackgroundexpressionofavarietyofproteinsinsourcesamplestoidentifythedifferenceinproteinexpressionthatmaycausedisease.(comparisonviadifferentialproteinexpression)第十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五定义：蛋白组与蛋白组学蛋白质组（Proteome）在一个细胞、一个组织、一个个体内，由基因组编码的所有全部的蛋白质组分。蛋白质组学（Proteomics）:研究蛋白质组的科学。蛋白质的种类、数量（2维电泳2DE,液相层析LC,质谱分析MS,蛋白质免疫共沉淀IP&Westernblotting,核糖体轮廓分析RibosomeProfiling）蛋白质与蛋白质、蛋白质与其它生物大分子的相互作用（酵母双杂交Y2H,荧光共振的能量传递FRET,染色质免疫共沉淀ChIP）蛋白质的生物学功能（pathway,circuitry）研究策略（i）组级研究proteome-wideinvestigation(ii)差减比较（subtractivecomparison）第十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五组学研究的基本策略组级的轮廓研究（Ome-wideProfiling）Massive-Highthroughput-Parallel大规模-高产出-平行对照（全部、所有）。差别-差减比对（differential-subtractivecomparison）有比较就有鉴别；差别因子就是差别表观的动因，动因是事物发生机制的线索与事物演变的预设轨道（差别、差异）。第十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五AnnotationofSubtractiveComparisonofProteome甲乙两样品间蛋白质的差别：A+b-c-d+e-F-G乙-样品：B-C-D-E-F-G甲-样品：A-B-C-D-E−)蛋白质蛋白质组级规模的蛋白质轮廓分析与差减比较组级范围的蛋白质的差别：种类-数量次要差异蛋白-疾病关联次要差异蛋白形成原因-机制主要差异蛋白-疾病关联主要差异蛋白形成原因-机制致病机制-疾病诊断-治疗方案-疾病预后第十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Inviewofproteinexpression,whatcancausethedifferenceincolorsensitivity?Feb26,2015Internet第十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五蛋白质组复杂性蛋白质组复杂性，（i）是指蛋白质组的蛋白质数量-氨基酸序列常与基因组的基因数量-核苷酸序列不一致（ii）蛋白质的功能结构与修饰的多样性（iii）蛋白复合物的组成-功能-分布的多样性基因转录的始点与终点是可变的。初始mRNA常经历可选择性剪接，或反式剪接。蛋白质常经历翻译后的修饰，如，P,Ub,Me,poly(ADP),etc。蛋白质多以复合物的形式既参与细胞的代谢活动又参与细胞的组成结构。第十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五OverviewonTechnology&ResourceinProteomicsCelis(2003)CancerCell第十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三个主要应用于蛋白组学的技术与方法2-维电泳（2-DementionalElectrophoresis2DE）液相层析（LiquidChromatographyLC）质谱分析（MassSpectrometryMS）生物信息学（Bioinformatics）第二十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Spatial&TemporalProteinExpressionTimecourseofexpressionLocationofexpressionTissue-orOrgan-specificexpressionCell-specificexpressionMultipleTestsforProteinIDMSanalysisPMF&P/rDeterminationofN-&C-terminalAAMoleculeWeight,pIDifferencesbetweenSamplesHealthyvsdiseaseInducedvsbackgroundSpeciesvsspeciesOverviewonProteinID&AbundanceDIGE-orLC-MSProteinMicroarrayDatabaseSearchProteinResponse&CoordinationSignalingPathwayMetabolicPathwayProteinParticipatinginDevelopmentProliferationDifferentiationMatterMetabolismAnnotationofProteomicsStrategy蛋白质表达的轮廓分析蛋白质相互作用蛋白质细胞综合功能差减对比组设立蛋白质时-空表达差别分析多重验证蛋白质ID*蛋白质组学的研究策略第二十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五HPLC-MS*TechnologicalStrategy(GE-LC-MS-Database)toProteomicsGapelo(2010)Proteomics第二十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2-维电泳层析分离样品蛋白质制备质谱分析肽质量指纹(PMF)、峰值比率(P/R)胰蛋白酶电泳蛋白斑点胶切割与酶消化*蛋白质组学研究策略的方法程序蛋白质类别与丰度比对蛋白质数据库第二十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Celis(2003)CellCancerCell第二十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五ConceptiononExperimentalPlanningBiologicalReplicates:(i)forcellcultures,animalandplantexperimentsusuallythreebiologicalexperimentstendtobesufficienttodetectinducedbiologicalvariationsonthebackground(ii)forpatientsinclinical,itisadvisedtoanalyzeatleastsixpatientsforcontrol,dieased,andtreatedsamples,ormore.PoolingofSamples:YesorNo?No!Poolingofsamplesisonlyperformedforcreatinganinternalstandardfordifferentialgelelectrophoresis(DIGE).Pre-fractionationofSamples:YesorNo?Yes,itwillincreasethenumberofidentifications.WhatistheBestWorkflowforproteinanalysistoStartWith?2-Dgelallowshigh-throughputanalysisontheproteinlevel.第二十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五DIGE原理

DifferentialImagingofGelElectrophoresis

电泳胶荧光差别影像分析不同蛋白样品标记不同染料，1:1混合。1st–等电电泳聚焦

（蛋白等电点）。2nd–SDS-聚丙烯凝胶电泳

（蛋白分子量）。电泳胶分离激光差别扫描的影像-分析

（电泳胶的单个与重叠影像图上的蛋白质斑点位置-色度提示蛋白质ID与丰度）。DIGE电泳影像上的蛋白质斑点位置，代表该类蛋白质分子量和等电点；斑点色度代表该类蛋白质在对比的样品中其含量上的差别。第二十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五荧光差别扫描与影像纪录依样品标记的染料选择激光波长鉴别蛋白质类别与丰度依蛋白质数据库单个、重叠电泳影像分析依蛋白电泳斑点位置-色度（检测-对照）蛋白质标记不同染料蛋白质样品（检测：对照）1:1混合2-维电泳分离（Mw&pI）DIGE方法程序第二十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五等电点电泳聚焦IEF

IsoelectricElectrophoresisFocusingIEFforPurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptides等电点电泳聚焦理论基础

IEF是在含有pH梯度胶上进行的。蛋白质是带电荷的，带正或负电荷取决于(i)蛋白分子结构,和(ii)环境pH.环境pH:在碱性缓冲液,蛋白带负电荷；在酸性缓冲液，蛋白带正电荷。

蛋白等电点(pI):在某个pH,蛋白所带的净电荷为零

。IPG非移动pH梯度胶

immobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3第二十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五等电点聚焦原理：蛋白依等电点在pH梯度胶上分离两性电解质与pH梯度:两性电解质（含有多个氨基与多个羧基的脂肪酸分子）的混合物，在电场条件下，自动排列形成pH梯度，负极具有高pH值，正极具有低pH值。两性电解质特性:(i)在等电点，具有高缓冲和溶解性(ii)良好电导性(iii)无生物学效应(iv)小分子量两性电解质胶:2%(w/v)电解质,4%(T)电泳胶&3%(C)交联度IPG非移动pH梯度胶条:(i)当蛋白上样于IPG，蛋白可以带正、负电荷或零电荷(ii)正电荷蛋白向负极移动，并停留在相当于它等电点的pH处；负电荷蛋白向正极移动，停留在相当于它等电点的pH处。第二十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)第三十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五ThePrincipleofIsoelectricElectrophoresisFocusing+H+-H+OrientationofelectricfieldvspHgradientProteinchargedwithcationoranion第三十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*2-DimensionalElectrophoresisExample:Protein2-DE(-)DecreasingpI(+)(-)DecreasingMr(+)LehningerPrincipleofBiochemistryp95(-)(+)pH10pH3斑点位置，代表某类蛋白质的等电点和分子量第三十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五不同蛋白样品标记不同染料:染料标记帮助区分不同样品来源的同类蛋白质在混合样品中的含量。混合蛋白质样品(1:1),进行2-维电泳:不同来源的同类蛋白质，在电泳中可行进在电泳胶上同一位置，但，具有不同的染料颜色。激光差别扫描:依不同染料选择不同扫描波长，则，不同蛋白样品来源的蛋白质呈现各自颜色的电泳胶影像。结果分析-阅读:蛋白斑点的位置代表蛋白质类别，斑点的颜色代表该蛋白含量或相对含量。单个电泳胶影像和多个电泳胶影像重叠的分析阅读。*电泳胶荧光差别影像DIGEDifferentialImagingofGelElectrophoresis第三十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五MinimalLabelingofLysinewithCyDye0Cx30minGE(2004)2-DElectrophoresisLysineLabeling(minimallabeling)Inpractice400pmolofdyeisaddedto50ugofprotein.Inthiswayonly3-5%oftheproteinswillreceiveatag(95-97%remainunlabeled)Labelingreaction:noIPGbuffer,noreductant,pH8.5,0ocx30minwithdye,theepsilon-aminosidegroupoflysineislabeledwithdye.第三十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五SaturationLabelingofCysteinewithCyDyeCysteineLabeling(saturationlabeling)Thehighsensitivity,downto1000humancells(around2.5ugprotein)couldprovidegood2-DELabelingreaction:noIPGbuffer;TCEPreductantpH8.0,37oC1h;dyeaddedpH8.0,37oC30min;thethiogroupofcysteinelabeledwithdyes(Cy3orCy5).第三十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*DIGE方法程序第三十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*ProcedureforDIGEofProteinSamplesGE(2004)2-DElectrophoresis蛋白样品标记染料荧光差别影像蛋白质2-DE分离蛋白斑点位置-色度分析第三十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五ExampleforDIGEImageDifferentialWavelength

ProteomicsinPracticep69第三十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Cy3redCy5blueCy2greenIEFSDSImageAnalysisSchematicforDIGEProcedureWestermeier(2008)ProteomicsinPractice第三十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2-DEofMouseLiverExtractGE(2004)2-DElectrophoresis第四十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2-DEofProteinsStainedwithSyproRuby(A)&DeepPurpleStrain(B)AndProteinSpot3-DPlotAnalysisDE(2004)2-DElectrophoresis第四十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五ExperimentalStrategyofGE&MSApplication:FusionProteinTagGavin(2002)NatureConstructoffusionproteintagConstructoffusiongeneHRCreateofexpressionlocioffusionprotein第四十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Example:DataAnalysisviaBioinformaticsinProteomicsGavin(2002)NatureActual:Theory第四十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五层析柱

：静止相-层析基质，它与蛋白样品中的各类蛋白组分具有差别的亲和结合力；移动相-蛋白样品和层析洗脱液，层析洗脱液可以降低-减弱层析基质与蛋白组分间的亲和结合力。液相层析原理：蛋白质样品是处于液相中，样品内的各个蛋白质组份与层析基质之间的不断结合-解离作用的强弱差异，决定着各个蛋白质组份通过层析基质所需要时间的长短，即决定各个蛋白质组份通过层析基质的慢-快。在层析过程中，弱相互作用的蛋白，最先通过层析柱；强相互作用的蛋白，最后通过层析柱。如此，各个蛋白质组份与层析柱的相互作用的强弱不同，它们通过层析柱的次序就有先有后，因而达到各个蛋白质组份经层析基质逐个被分离。液相层析原理第四十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2-DLC:2-dimensionalliquidchromatographyIEX:ionexchangechromatographyRPC:reversephasechromatographyMALDI:matrixassistantleaserdesorptionionizationHMW:highmolecularweightPMF:peptidemassfingerprintviam/zvalueP/r:theratioofpeaksatsamemass/zvaluebetweendiffsamplesConcentration&HMWcutoffProteinIsolation蛋白质提取（组织-细胞-体液）蛋白质消化，免疫亲和分离2-次液相层析(离子交换和反相层析）4.质谱分析(PMF&P/R)鉴别蛋白ID与丰度蛋白数据库比对蛋白质层析-质谱分析的方法程序第四十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*举例：离子交换层析分离蛋白质的原理图示Thesequentialorderofproteinstodisassociatefromthesolid-phase(SP)isreversetoproteinaffinitywithSP.Weak(highpI)Strong(lowpI)+++Pr-Pr-Pr2-Peaksequential-site:ProteinIDPeakheight:proteinabundanceProteinscoulddifferentiallyassociatewiththesolid-phase(SP)byproteins’teinstronglyorweaklytoassociatewithSP.AnionExchangeChromatography第四十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五MolecularWeightHydrophobicGroupOppositeChargedIonLigandSpecificityHydrophobicGroupofProteins

PrincipleinChromatographicPurificationGE(2004)Handbook第四十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五ColumnChromatographyLehningerPrinciplesofBiochemistryp90第四十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第四十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*离子交换层析(IECorIEX)蛋白带正负电荷不一

:蛋白的化学结构，溶液的pH值蛋白带电量不一:溶液的pH值与蛋白的等电点之间的差距带电荷的蛋白与带相反电荷的介质（离子交换柱）相互作用，作用的强弱正比于蛋白所带净电荷的量影响因素：盐溶度，洗脱液pH

TheoreticalProteinTitrationCurveASuitableIonExchangerSelectionCationExchangerAnionExchanger第五十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五强结合的蛋白质，最后解离被洗脱(具有较低pI的蛋白质)弱结合的蛋白质，最先解离于离子层析柱，最先被洗脱(具有较高pI的蛋白质)洗脱液的梯度改变(盐溶度-pH)蛋白质(负)结合于阴离子交换层析柱(阳)样品蛋白质经处理而带负电荷pHHtoLAnionConcLtoH*举例:蛋白质经阴离子交换层析柱的分离第五十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五蛋白质被离子化为阳离子或阴离子。离子蛋白在电场或磁场内飞行。由于离子蛋白质质量的差异决定了具有不同质量的离子蛋白质飞过电场或磁场的快慢。小质量离子蛋白-飞行快，大质量-飞行慢检测仪捕获每一个离子蛋白质，依据它们的飞行时间(TOF)或质量/电荷比值(m/z,质-荷比值)，进行排序(TOF=m/z)，

绘制出质谱图（离子蛋白质质量对离子蛋白质检测信号强度作图）。数据分析经蛋白质数据库比对(肽质量指纹PMF&峰值比率P/R），鉴别-定量样品中蛋白质的类别-含量。*质谱分析原理MassSpectrometryMS第五十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*质谱分析原理

蛋白质离子化带正或负电荷离子蛋白质飞经电场或磁场检测仪捕获离子蛋白质，计量飞行时间（TOF）或，质-荷比值（m/z）数据分析与比对蛋白数据库，依据

PMF(TOForm/z)&P/R;第五十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五定义DefinitionTOF(timeofflight):离子蛋白质飞经电场所需要的时间。蛋白质的质量不同，则它们飞经电场的快慢不一、所需要的时间长短不同。小质量离子蛋白-飞行快，大质量离子蛋白-飞行慢m/z(masspercharge)：质-荷比，单位电荷的离子蛋白质所具有的质量。蛋白质的氨基酸的组成不一（种类-数量的不一），就具有不同的质-荷比。PMF(peptidemassfinger)：能够代表某类蛋白质组成特征的一组多肽的特征质量谱图，被称为肽质量指纹。P/R(peakratio)：峰值比率，质谱图中的所检测到的离子蛋白质的信号强度的比较，代表着所检测到的离子蛋白质的相对含量。第五十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五PrincipleforMassSpectrometryMicallef(2010)JHematol&OncolProteinsIonizedwithchargecationoranionProteinsIonizedtoflightthroughelectricfieldProteinsIonizedtobesequentiallycapturedbyDetectorviaTOFMatrix-assistedlaserdesorptionionizationElectrosprayionization第五十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五PrincipleforMassSpectrometrySchematicofQuadrupoleTOFHybridAnalyzerWestermeier(2008)ProteomicsinPracticeProteincouldbeionized,representedasm/z.(M/Zvalue)Differentproteinshavingdifferentialm/zvaluemaybeseparatedbyelectricfield,bigion(bigm/z)takesmoretimeofflyingthroughtheelectricfield.(TOF)Detectorcansequentiallycaptureionshavingpassedtheelectricfield,smallion(smallm/z)flyingfastermayfirstbecaptured,andbigiontobelatercaptured.第五十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Example:MSDataDiagram第五十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2x6x*图示质谱分析原理1xMedialLargeSmall第五十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五质谱数据的提呈和阅读蛋白质样品的质谱图就是该样品中的各个离子蛋白质的质-荷比值对它的信号强度作图。X-轴(m/z，质-荷比值):依离子蛋白质的质-荷比值或离子蛋白质飞行时间进行排序。

小（快）-前，大（慢）-后Y-轴(SignalIntensity，信号强度):用计数检测仪，测量每个离子蛋白质的信号强度（每秒计数或电压），离子蛋白质被检测的信号强度代表该离子蛋白质的含量。注：所测得的信号强度并不能精确反映该离子蛋白质的数量，但其之间是相关的，这是由于许多干扰因素所致。如，离子大小，离子速率，离子的电荷数；设置标准内参可校正误差。第五十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五质谱数据解读:PMF&P/R蛋白数据库：蛋白质可被水解为许多肽段，每一个肽段都有其特定的分子质量与理化特性，如此许多蛋白质的信息汇集总和即为蛋白质数据库，它可作为实验中被检测蛋白质的比对参考。每类蛋白质因其固有的氨基酸组成与序列，在质谱分析中可被电离为一组特定的多肽肽段。能够代表某类蛋白质特征的一组特定多肽的特征质量谱图被称为肽质量指纹(PMF)。肽质量指纹代表蛋白质的类别，即，PMF=ProteinID每个蛋白质离子的信号强度，即峰值高低，即为该蛋白质离子在此系统中被检测到的数量（丰度）。峰值比率(P/R)，在任意两个蛋白质离子的位点上，两个峰值间的比率就代表着这两类蛋白质离子在此系统内的相对丰度。因此，

P/R=蛋白质相对丰度ProteinAbundancerelative第六十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五质谱分析揭示蛋白质的信息肽质量指纹能揭示蛋白质的部分序列信息：

在质谱分析中，由于分子碰撞产生的蛋白质断裂总是出现质量数值特定的成对互补离子—N-末端的离子系列(b-离子)和C-末端的离子系列(y-离子)—据此，逻辑推绎出蛋白质的氨基酸排列顺序。肽质量指纹能揭示蛋白质的组成信息：如，蛋白的酸性氨基酸的羧基可以被酯化修饰。在某种条件下，质谱分析（经比对原初蛋白的质谱）即可揭示这类细微的分子修饰的质量改变。质谱分析揭示某些蛋白质特性：如，蛋白翻译后的修饰。据估计，人类蛋白组含有105潜在的磷酸化位点。蛋白翻译后修饰可改变原初蛋白的质量，质谱分析可鉴别这类因修饰发生改变的蛋白质质量。第六十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*Example:质谱分析揭示小肽的氨基酸组成及序列

Campbell(2002)DiscoveringTheprotonatedtotalpeptidemassis1410.6(13-aapeptide).ThepeptidetobeionizedintoN-terminalions(b-ions)andC-terminalions(y-ions).Thealignmentoftheseions,fromsmalltolargeaccordingtotheirm/z,auniquemassspectrumforthepeptide.Thesignalintensity(theheight)ofeachionrepresentstheabundanceofthefragmentioninsystem.Contrastofb-ionstoy-ionscouldinferthepeptidesequence.CampbellAM(2002):p187第六十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

质谱分析：蛋白质特异结合位点的染色质组蛋白的修饰变化Vermeulen(2010)Cell142:967-980ChIP-ProteinMSAnalysis第六十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五Figure6.TripleSILACPulldownsRevealingHistoneModificationCrosstalkThree-dimensionalrepresentationoftheMSsignalofanSgf29peptideidentifiedinatriplepulldownSILACexperiment(them/zscaleisthexaxis,thechromatographicretentiontimeistheyaxis,andtheMS-signalisthezaxis).Eachgroupofsignalsrepresentsthenaturalisotopepatternofthepeptide.TherelativeintensitiesofthetripletpeakoftheSgf29peptideindicatesthepreferenceofbindingtothemodificationstates(unmethylatedhistoneH3peptide[leftpeak],H3K4me3peptide[middlepeak],andthedouble-modifiedH3K4me3/H3K9,14Acpeptide[rightpeak]).Sameas(A)foraPHF8peptideidentifiedinthesametriplepulldown.NuclearextractsderivedfromHeLacellswereincubatedwiththeindicatedhistonepeptides.TheamountofSgf29proteinboundtothesepeptideswasdeterminedbywesternblottingusinganantibodyagainstendogenousSgf29.BacteriallysatesexpressingrecombinantHis-taggedSgf29wereincubatedwiththeindicatedpeptides.Followingincubationandwashes,theamountofboundSgf29proteinwasdeterminedbywesternblottingusingananti-Hisantibody.NotethatSgf29doesnotbindtoapeptidecontainingH3K9,14acetylationandthatthebindingofSgf29toH3K4me3isnotaffectedbyasymmetricdimethylationofH3R2.(E–G)Three-dimensionalrepresentationofanHP1a(E),Orc5(F),andCDYL(G)peptideidentifiedinatriplepulldownSILACexperiment.ThespectrashowtheMS-signalrepresentingtherelativebindingofthesepeptidestotheunmethylatedhistoneH3peptide(leftpeak),theH3K9me3peptide(middlepeak),andthedouble-modifiedH3K9me3/H3S10Ppeptide(rightpeak).HistonepeptidepulldownsinHeLanuclearextractswereperformedwiththeindicatedpeptides.TheamountofHP1aandCDYLbindingtothesepeptideswasdeterminedbywesternblottingusinganantibodyagainstHP1aandCDYL.第六十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*质谱分析应用:蛋白定量分析

如何鉴别不同来源样品的蛋白种类与数量的差别分子标签：用不同质量的分子标签标记不同的蛋白样品，就是为了在样品蛋白组的比较分析中，区分-鉴别同一类蛋白质的不同样品来源，这是基于质谱分析能很好区分不同的分子标签的细微质量差别，如同位素。在质谱分析中,由于不同来源的同类蛋白质标记着质量细微差别的不同的分子标签，就具有不一致但极为相似的质-荷比值(m/z)；它们的峰值比率(P/R)就代表着该类蛋白质在不同来源的样品中的相对含量。在质谱分析中，用不同分子标签进行样品标记的方法：蛋白消化：在O18

标记的水中。代谢标记：使用重氨基酸

（S35orN15

）同构异质的分子标签

，如，重质量-ICAT或轻质量-ICAT同质异构的分子标签（具有不同的核磁共振）如，iTRAQ第六十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*举例:不同质量同位素经代谢标记于蛋白质样品

Campbell(2002)Discoveringp189不同的蛋白样品标记着不同质量的同位素。混合样品（1:1），电泳分离，部分酶消化。质谱分离与分析：(1)在每个m/z位点,出现成对的峰，意味着标记着不同质量同位素的同一类蛋白质，前峰代表轻同位素标记的蛋白质，后峰为重同位素标记的同一类蛋白质。(2)在每个m/z位点,成对峰的比率代表着那个蛋白质在不同样品中的相对丰度。123PMFAAseq&constituentofprotein***第六十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*质谱图的解读（Massgram）成对峰-等高:不同样品中的同类蛋白质因标记不同质量的同位素而具有相邻的质-荷比值并具有相似的含量。成对峰-不等高:不同样品中的同类蛋白质有着含量上的差别。单个峰:某类蛋白质只存在于一个样品中。2-DE(A:B=1:1),蛋白电泳分离，&斑点切割与消化B-样品蛋白标记为N14A-样品蛋白标记为N15质谱分析与阅读(PMF&P/R)am/zIntensitybm/zIntensitycm/zIntensity第六十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五*举例:质谱分析揭示蛋白质的磷酸化修饰不同的蛋白样品标记着不同质量的同位素。混合样品（1:1），电泳分离，部分酶消化。质谱分离与分析：蛋白质磷酸化，即为Xp;蛋白质未磷酸化，即为X。在Xp位点