分子诊断基因治疗

分子诊断基因治疗第一页，共四十页，编辑于2023年，星期五一概述：病理学在经历了几个阶段器官病理学组织病理学细胞病理学免疫病理学第二页，共四十页，编辑于2023年，星期五分子病理学：应用细胞分子生物学的理论和技术方法，对人类疾病发生发展、发病原因、机制、疾病的形态变化从分子or基因水平加以认识。病理学诊断也由以形态学观察为基础逐步进入分子水平，既分子诊断—以探查基因的变化来达到诊断疾病的目的。第三页，共四十页，编辑于2023年，星期五分子诊断的特点：

灵敏度高：基因虽然微量，难以检测，但目前已有使用基因or其片段高度扩增的PCR技术，以及应用高灵敏度的基因探针，即可探测。

特异性强：基因诊断检测的目标是基因，不同的基因的碱基序列各不相同，检测基因的分子生物学方法亦是高度特异性的。

适用范围广。第四页，共四十页，编辑于2023年，星期五目前主要应用于：人类遗传病的基因诊断or产前诊断；肿瘤；感染性疾病病原体（细菌，病毒）；多基因病；组织器官移植配型；法医学—个人识别（个人特异性的DNA指纹图）；亲子鉴定。其中肿瘤的分子诊断涉及到，多种恶性肿瘤、癌前病变。诊断的基因涉及多种癌基因，抑癌基因及相关基因。第五页，共四十页，编辑于2023年，星期五二分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用1肿瘤易感基因的检测：肿瘤分子遗传学研究发现，部分肿瘤的发生具有遗传学基础，故肿瘤遗传相关的易感基因检测对于肿瘤高危人群的筛测具有实用价值。已明确的肿瘤易感基因及相关肿瘤有：

第六页，共四十页，编辑于2023年，星期五Rb1-视网膜母细胞瘤，为抑癌基因，定位于13q14.1

染色体,基因产物位于细胞核。APC-家族性腺瘤性息肉病，该基因定位于5q21染色体,

基因产物位于细胞膜，功能不清。WT1-肾母细胞瘤，该基因定位于11p13染色体,基因产物位于细胞核。BRCA1-乳腺癌，卵巢癌等，该基因定位于17q21染色体,

基因产物位于细胞核，为核内磷酸化蛋白与激素信号传导有关。第七页，共四十页，编辑于2023年，星期五抑癌基因与相关肿瘤抑癌染色体基因产遗传性肿瘤散发性肿瘤基因定位物定位Rb13q14核内视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤膀胱癌乳癌食道癌肺癌P5317p13核内膀胱癌乳腺癌食道癌肺癌肝癌卵巢癌淋巴瘤DCC18q12胞膜结肠癌直肠癌APC5q21胞浆家族性多发性腺瘤结肠癌直肠癌胃癌胰腺癌WT111p13核内Wilm’s瘤Wilm’s瘤P169q21核内黑色素瘤黑色素瘤膀胱癌乳腺癌肺癌肾癌卵巢癌BRCA117q21胞浆乳腺癌卵巢癌乳腺癌卵巢癌结肠癌直肠癌前列腺癌第八页，共四十页，编辑于2023年，星期五2肿瘤的分类：对BCR区基因重排的检测，可对慢性粒细胞性白学病进行诊断，该基因定位于22q染色体,该基因称为断裂点群区域基因，9q上的AB1基因与22q34.36区域基因序列相融合。对N-myc和C-myc的扩增和表达检测，对鉴别神经母细胞瘤和神经上皮瘤具有应用价值。N-myc明显扩增和过度表达--神经母细胞瘤。C-myc的扩增和过度表达--神经上皮细胞瘤。

第九页，共四十页，编辑于2023年，星期五3肿瘤的早期诊断：

K-Ras基因突变，在胰腺癌，结肠癌，肺癌中发生率较高，其突变点在第12编码子最常见。应用针吸活检检测胰腺癌中第12编码子突变，检出率达100%。

K-Ras基因编码鸟苷酸结合蛋白，与GTPase结合。其突变降低了Ras蛋白与GTPase的结合能力，导致Ras蛋白与GTP的持续结合，从而促进细胞的生长作用。第十页，共四十页，编辑于2023年，星期五4肿瘤的预后判断：肿瘤相关基因的突变，扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关。如，P53基因突变与乳腺癌，肝癌，结肠癌等多种肿瘤预后相关。P53基因位于17p13，基因产物定位于细胞核，编码393个氨基酸组成的53KD的核内磷酸化蛋白，具有蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质结合的功能，p53是细胞周期中负调节因子，与细胞周期的调控，DNA修复，细胞分化，细胞凋亡等生物学功能有关。第十一页，共四十页，编辑于2023年，星期五肿瘤转移抑制基因nm23的表达水平与肿瘤转移相关。

Nm23位于17q22，基因产物定位于细胞浆，基因功能不太清楚。CerbB-2基因的过表达与乳腺癌预后相关。上皮生长因子受体，为磷酸化蛋白。第十二页，共四十页，编辑于2023年，星期五5肿瘤的预见性治疗：肿瘤的发生是多基因，多步骤，多阶段的过程。在肿瘤发生，发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式，与肿瘤临床治疗敏感性密切关联。如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，则对肿瘤的预见性治疗具有指导意义。如90%的胰腺癌，50%的结肠癌，30%的非小细胞肺癌存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常的基因状态，则可提高放疗敏感性。第十三页，共四十页，编辑于2023年，星期五起动阶段促进阶段进展阶段↓↓↓正常胃粘膜→萎缩性胃炎→肠化→异型增生→原位癌→转移癌↑↑↑基因点突变基因扩增基因缺失or过量表达or重排

Ras,P53erbB2,EGFRApc,P53,P16,Rb,nm23第十四页，共四十页，编辑于2023年，星期五6肿瘤的预后监测：如用多聚酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)技术可使白血病细胞检出率达到1/106左右，应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。分子诊断在肿瘤的监测方面具有重要意义。肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因，抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质，RNA和DNA水平进行判断。

第十五页，共四十页，编辑于2023年，星期五三肿瘤基因过表达及其检测

1基因过表达的形式：癌基因的激活和抑癌基因的失活是肿瘤发生过程中的关键因素，癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为形式之一。癌基因一般为单拷贝基因，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多拷贝，这种基因的扩增，使得基因过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。抑癌基因在正常情况下维持细胞的正常周期。P53其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后其产物半衰期延长。第十六页，共四十页，编辑于2023年，星期五人类肿瘤中的癌基因扩增癌基因肿瘤及扩增百分比（%）C-myc乳腺癌(15-23),结肠癌(3-6)

肺鳞状细胞癌(12-25)N-myc神经母细胞瘤(10-31)c-myc,N-mycorL-myc肺小细胞癌(11-23)C-mycorL-myc肺腺癌(2-11)ErbB-2乳腺癌(16-33),

胃癌和食道癌(5-13),

卵巢癌(20-33)K-ras乳腺癌(3),卵巢癌(4-8),肺癌(4)第十七页，共四十页，编辑于2023年，星期五几种常见肿瘤癌基因的扩增率基因肿瘤类型扩增率(%)基因肿瘤类型扩增率(%)C-erbB-2乳腺癌16-33N-Myc肺腺癌2-11

胃，食道癌5-13K-Ras乳腺癌3-10

卵巢癌20-33胰腺癌45

胆囊癌45-58卵巢癌8-8

肝癌25-45胆囊癌30-61C-Myc乳腺癌25-30N-Ras肝癌24

结，直肠癌3-6

胆囊癌40-60

肝癌25-42

肺鳞癌15-25第十八页，共四十页，编辑于2023年，星期五2基因过表达的检测：1）

表达产物的检测：癌基因，抑癌基因其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，通过免疫组织化学（Immunohistochemistry）方法检测肿瘤组织中蛋白产物，or蛋白印迹(WesternBlot)以及酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测肿瘤细胞or血清中的蛋白产物。免疫组化：在组织切片上进行。特点-是保持组织结构的条件下原位进行分析。

ELISA是在细胞悬液中进行。第十九页，共四十页，编辑于2023年，星期五Westernblot

既可对组织细胞进行分析，也可对释放至血液中的蛋白质进行检测。流式细胞仪（Flowcytometry）新一代测定蛋白质产物的方法,首先标记荧光于相应的抗体蛋白，与含有特异性抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对不同荧光信号的细胞进行分类、测试。在已报道的研究结果中，许多肿瘤都存在其相关基因的蛋白产物过表达。如乳腺癌—C-erbB-2表达，阳性率50%，P53为50%，并与其组织学类型、浸润、转移倾向和预后有关。P53基因产物在大多数肿瘤中都有过表达，包括胃癌，直肠癌，肺癌，食道癌，肝癌，卵巢癌等。第二十页，共四十页，编辑于2023年，星期五2）基因扩增的检测：肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，可通过分子诊断方法进行检测。经典的方法：

核酸分子杂交—原位杂交（Insituhybridization,ISH）

Southernblot(DNA杂交)，Northernblot(RNA杂交)，原位PCR，反转录PCR。第二十一页，共四十页，编辑于2023年，星期五核酸分子杂交：是检测核酸分子间序列同源性的一种技术。不同来源的核酸单链只要彼此间有一定的互补顺序，即可按碱基配对规则以氢键相结合。通常是先对一种核酸进行标记（如放射性同位素or荧光素、生物素等）作为探针，去探测另一核酸序列。先经过变性使DNA双链分开成单链，再进行杂交，可以是DNA-DNA,RNA-RNA,orDNA-RNA之间进行。第二十二页，共四十页，编辑于2023年，星期五原位杂交：用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。用原位杂交技术检测肿瘤细胞内癌基因的mRNA可检出激活的癌基因。用不同种类的癌基因探针检测同一种癌组织内mRNA可以明确有哪些基因被激活。第二十三页，共四十页，编辑于2023年，星期五Southernblot：

1975年由Southern提出并以其名字命名的一种DNA特定序列定位技术。基本原理—从组织细胞中提取基因组DNA，用一种or多种限制性内切酶酶切，通过电泳，转膜，原位变性固定于固相支持物（硝酸纤维滤膜or尼龙膜），用已标记的特异性DNAorRNA探针与固定有DNA的固相支持物杂交，经放射自显影or化学发光自显影，对显影条带进行分析。可以确定在众多酶解产物中某一特定序列DNA片段的位置和大小。最常见的研究对象为基因组DNA，也可以用于质粒DNA的片段分析。第二十四页，共四十页，编辑于2023年，星期五Northernblot：

1977年Alwine等提出的一种类似于Southern的方法，主要用于分析mRNA。基本程序—提取组织细胞中的RNA--电泳，原位转移至固相支持物上--杂交--放射自显影or化学发光自显影—结果分析。以显示目标RNA所存在的位置，含量。第二十五页，共四十页，编辑于2023年，星期五PCR—聚合酶链反应：

1983年美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，1985年公开报道，该技术的发明在生命科学中掀起了一场革命。其实质就是一种在体外经酶促反应将特定的DNA序列进行高效，快速扩增的技术。反应体系：

Taq酶（属DNA聚合酶）。合成的DNA引物。

Mg2＋,缓冲液—提供反应合适的酸碱度。三磷酸脱氧核苷酸dNTP。第二十六页，共四十页，编辑于2023年，星期五第二十七页，共四十页，编辑于2023年，星期五原位PCR：

1992年建立。在组织细胞原位进行DNA扩增的定位，定性研究方法。PCR扩增技术＋原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上or组织细胞内进行原位扩增，使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定位，定性，定量分析。逆转录PCR（RT-PCR）：为RNA的快速体外扩增的一种技术。RNA的扩增需将RNA转化为DNA，用逆转录酶来完成，首先合成的第一条链cDNA，以cDNA作为模板，再用特异的引物进行PCR扩增。第二十八页，共四十页，编辑于2023年，星期五四基因突变及其检测基因突变的结果使癌基因激活或抑癌基因失活，细胞表型发生变化和肿瘤发生。

肿瘤细胞—可检测到突变的基因。

癌前病变or癌前状态组织细胞—存在不同形式和不同程度的基因突变。第二十九页，共四十页，编辑于2023年，星期五1基因突变的形式：

点突变—指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能。研究表明，大部分的肿瘤几乎都存在相应基因的点突变如肺癌，膀胱癌，结肠癌，胃癌，乳腺癌等存在H-Ras,K-Ras,N-Ras的第12，13，61编码子的点突变。

P53,P16,P15等几种抑癌基因也在多种肿瘤中存在点突变。第三十页，共四十页，编辑于2023年，星期五人类肿瘤中的Ras基因突变Ras突变百分比（%）活化的Ras基因肺腺癌30K-Ras结肠腺癌50K-Ras胰腺癌90K-Ras胆管腺癌90K-Ras膀胱癌6H-Ras乳腺癌＜5K-Ras宫颈癌25H-Ras甲状腺癌＞60H-Ras,K-Ras,N-Ras黑色素瘤20N-Ras精原细胞瘤40K-Ras,N-Ras第三十一页，共四十页，编辑于2023年，星期五人类肿瘤中P53基因突变热点和频率肿瘤类型突变频率突变热点(编码子)肺癌56157，248，273结肠癌50175，245，248，273食道癌45不确定卵巢癌44273胰腺癌44273皮肤癌44248，278胃癌41不确定第三十二页，共四十页，编辑于2023年，星期五人类肿瘤中P53基因突变热点和频率肿瘤类型突变频率突变热点(编码子)头颈部鳞癌37248膀胱癌34280肝细胞癌45249乳腺癌22175，248，273甲状腺癌13248，273宫颈癌7273第三十三页，共四十页，编辑于2023年，星期五基因缺失—指基因片段的缺失（Geneloses），缺失的范围差异较大，可以是1-2个碱基，也可以是一个片段。是另一种主要的突变形式。常见的缺失位点如乳腺癌的3p7q11p13q16q17p等，结肠癌的5q17p18q等。基因片段的缺失可使该基因激活、转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。基因缺失是肿瘤形成的原因还是细胞恶性转化后的结果，仍值得深入探讨。第三十四页，共四十页，编辑于2023年，星期五基因易位或重排—某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称易位or重排（Genetranslocationandrearrangement）。易位与重排易使癌基因被激活，或使抑癌基因失活，从而使细胞恶变。细胞癌基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，由内含子分隔，其中有些序列起到促进子和调节基因的作用，如染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因与正常的抑制子分开而被置于活化DNA序列的控制之下，而使其活化。Burkitt淋巴瘤c-myc基因8q24易位于2p11。慢性or急性粒细胞白血病，急性淋巴细胞白血病，癌基因Ab1从9号染色体易位于22号染色体。9q34—22q11。Ewing肉瘤，SiS基因从22号染色体易位于11号染色体。SiS基因编码生长因子类癌基因，其产物为PDGF-血小板生长因子亚单位，作用于PDGF受体，使细胞增殖。第三十五页，共四十页，编辑于2023年，星期五几种常见肿瘤的染色体易位常见肿瘤染色体易位涉及的癌基因小无裂细胞淋巴瘤t(8;14)(q24;q32)c-Myc滤泡性淋巴瘤t(14;18)(q32;q21)Bcl-2Burkitt淋巴瘤t(8;2)(q24;p11)c-Myct(8;14)(q24;q23)c-Myct(8;22)(q24;q11)c-MycEwing肉瘤t(11;22)(q24;q12)c-Sis透明细胞肉瘤