第三章第一,二节酶及细胞的固定

第三章化学酶工程教学内容及教学要求：了解酶在实际应用中的缺陷；掌握酶的固定化，辅酶的固定化，细胞的固定化，固定化酶和固定化细胞的表征，固定化酶和固定化细胞的应用；理解酶蛋白化学修饰的原理，了解酶蛋白化学修饰的方法，酶蛋白侧连的修饰，酶的亲和修饰，酶化学修饰的应用。重点：掌握酶的固定化，辅酶的固定化，细胞的固定化，固定化酶和固定化细胞的表征，固定化酶和固定化细胞的应用；理解酶蛋白化学修饰的原理。难点：理解酶蛋白化学修饰的原理目前一页\总数九十七页\编于六点第一节酶的固定化一、游离酶在实际应用中的缺点1、稳定性差，易失活，易水解2、难回收利用3、难连续化生产4、酶与产物混合，难分离目前二页\总数九十七页\编于六点二、固定化酶的定义及基本要求1、定义：借助物理或化学方法将酶固定于水不溶性或者水溶性载体，使酶与整体流体分开，但仍然能进行底物和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种酶制剂形式。2、固定化生物催化剂酶微生物细胞细胞器动植物细胞、组织和器官目前三页\总数九十七页\编于六点3、酶固定的基本要求保持酶活性和专一性载体与酶结合牢固载体不与底物发生反应酶固定化后的位阻效应小酶固定成本应尽可能的低目前四页\总数九十七页\编于六点三、酶固定的方法目前五页\总数九十七页\编于六点1、吸附法通过氢键、疏水作用、离子键等物理作用，将酶固定于水不溶性载体表面的固定化方法。1）、物理吸附：通过氢键、疏水作用、范德华力等物理作用，将酶固定于水不溶性载体表面的固定化方法。有机载体：纤维素、面筋、骨胶原和淀粉无机载体：氧化钙、硅澡土、高岭土和二氧化钛2）、离子交换吸附：将酶分子通过离子键固定到含有离子交换基团的固相载体上的固定方法。阴离子交换剂：DEAE（二乙基氨基乙基）-纤维素阳离子交换剂：CM（羧甲基）-纤维素目前六页\总数九十七页\编于六点优点和缺点制备简单，酶活力受到的影响小；固定化费用低；酶容易从载体上脱落目前七页\总数九十七页\编于六点

2、包埋法将酶分子截留在具有特定网状结构的载体中。常用的包埋材料有：琼脂，海藻酸钙，明胶等天然高分子以及聚丙烯酰胺，光交联树脂等合成大分子。

1）、凝胶包埋：聚丙烯酰胺：制备简单，酶活力不易破坏，缺点是酶容易漏失。丙烯酰单体有毒性，注意清洗。目前八页\总数九十七页\编于六点海藻酸钙

目前九页\总数九十七页\编于六点琼脂和辐射

琼脂包埋法：利用熔化的琼脂在温度低于50℃凝固的特性来包埋酶分子。特点是包埋活性高，制作容易，容易受到扩散限制。辐射包埋法：酶溶于纯单体水溶液、单体加聚合物水溶液或纯聚合物溶液中，在常温或低温下，用x—射线、Y—射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X—射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年H．Maeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。（光交联树脂）目前十页\总数九十七页\编于六点③其他凝胶包埋法。

a.淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。为增强机械强度和重新水合可加入—定量的甘油。

b.胶原包埋法即大分子络合法。胶原有纤维性，易成膜，能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。或者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶—胶原复合物便在电极上沉淀。目前十一页\总数九十七页\编于六点c.卡拉胶包埋法：卡拉胶(K—Carrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将酶在37—50℃溶于水中，又将卡拉胶在40一60℃溶于生理盐水中，二者混合后冷至10℃，所成凝胶浸在0.3mol/LKCl溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。ｄ.大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60℃用碳酸镁处理使其凝结，过滤。制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化。从而制得固定化葡萄糖异构酶。目前十二页\总数九十七页\编于六点2）、纤维包埋将酶溶液在高聚物的有机溶剂溶液中乳化，然后通过多孔喷丝头将乳化液挤压进入凝结液中，即形成丝状的纤维包埋体，酶即包埋在纤维束中。血纤维不会引起抗体形成，且无毒。在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白的谷氨酰胺残基之间发生交联而将酶固定化。目前十三页\总数九十七页\编于六点此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触．从而增加了酶的稳定性．同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微囊一般直径约1～100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞.因此，此法在医疗上极为有用。例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。３)、微囊化法（半透膜包埋法）目前十四页\总数九十七页\编于六点①界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂．使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造细胞”制备：25ml10%％血红蛋白水溶液(内含适当酶）。目前十五页\总数九十七页\编于六点②界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。

此法曾用来制备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇)用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体(如多异氰酸)溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化。这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜内。（例如用含酶的10％血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1％Span85的氯仿-环已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(疏水单体)后，便在油-水界面发生聚合反应，弃除上清液，加入Tween-20去乳化，洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固定化酶。）目前十六页\总数九十七页\编于六点③液体干燥法。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。它是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中。加入酶液后，加入油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有保护性胶质如明胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化。在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。目前十七页\总数九十七页\编于六点④红血球包埋法。在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球．再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出来。目前十八页\总数九十七页\编于六点

⑤脂质体包埋法。上述微囊法是一种半透性膜将酶包埋，近年来采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。例如：将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于氯仿中。再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中，在氮气下32℃转动乳化。然后在室温下保持2h，再在氮气气流中，4℃用超声波处理10s，在室温下保持2h，过Sepharose6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续超声波处理，并过Sepharose（琼脂糖凝胶）6B柱，可得含酶的微囊。这种微囊液膜当底物产物穿过时、与膜的径无关。但与产物或底物对膜成分的溶解度有关。目前十九页\总数九十七页\编于六点优点和缺点操作简单，对酶活力有影响（但小），适合于酶甚至是细胞。存在扩散限制，不适合于底物或产物分子过大的酶催化反应；容易发生酶的漏失。目前二十页\总数九十七页\编于六点3、共价结合定义：酶分子与载体间以共价键作用而实现结合的固定方法。①对载体的要求：尽量选择亲水性强的载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度与酶共价反应的条件温和非专一性键合易获得目前二十一页\总数九十七页\编于六点②对酶(蛋白)上结合基团的要求目前二十二页\总数九十七页\编于六点载体活化共价法的反应条件较为剧烈，因此一般选择首先将载体的功能基团进行活化，然后再加入酶进行偶连。

活化原则：不影响酶活性中心，酶活性不能损失过多；偶连试剂的获得价格和安全性。

目前二十三页\总数九十七页\编于六点1)、溴化氢法目前二十四页\总数九十七页\编于六点2）、乙基氯甲酸酯法

3）、碳二亚胺法目前二十五页\总数九十七页\编于六点4）、重氮法目前二十六页\总数九十七页\编于六点5）、3-氨基丙基三乙基氧硅烷法目前二十七页\总数九十七页\编于六点6）、戊二醛法目前二十八页\总数九十七页\编于六点优点和缺点结合牢固，不易脱落；反应条件苛刻，操作复杂，酶易发生结构的破坏而降低活性。目前二十九页\总数九十七页\编于六点4、交联法定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白（或载体）间进行交联反应。

双功能或多功能试剂有：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯。

1）、共价交联法（载体交联法）是指酶分子在双功能试剂或多功能试剂的作用下，与一些惰性蛋白或水不溶性的载体之间发生交联。

目前三十页\总数九十七页\编于六点2）、交联酶法（直接交联或交联可溶性酶法）借助双功能试剂使可溶性酶分子之间发生交联，制成网状结构的固定化酶的方法。目前三十一页\总数九十七页\编于六点优点和缺点操作简单，但固定化的条件控制比较困难；酶活力影响较大。目前三十二页\总数九十七页\编于六点5、无载体固定化1）、定义就是在无外来载体的情况下固定酶的方法。目前三十三页\总数九十七页\编于六点目前三十四页\总数九十七页\编于六点目前三十五页\总数九十七页\编于六点3）、交联酶聚集体

采用物理方法使酶分子聚集，再经交联剂交联而成的不溶性酶聚集体。目前三十六页\总数九十七页\编于六点目前三十七页\总数九十七页\编于六点优点和缺点回收方便，便于重复利用；催化活性高；稳定好。制备较难，固定化成本高。目前三十八页\总数九十七页\编于六点6、不同固定方法的优缺点及联用目前三十九页\总数九十七页\编于六点1、酶活性的改变1)、构象改变2）、屏蔽效应四、固定化酶的性质目前四十页\总数九十七页\编于六点3）、微扰由于固定化载体的亲水、疏水性质与介质的介电常数等直接或间接地影响酶的催化能力，或影响酶对效应物作出反应的能力。4）、分配效应跟载体的种类,底物,产物的性质以及反应离子强度有关。（所带电荷，极性）目前四十一页\总数九十七页\编于六点5）、扩散限制

目前四十二页\总数九十七页\编于六点2、稳定性的改变目前四十三页\总数九十七页\编于六点3、最适温度

温度一般提高目前四十四页\总数九十七页\编于六点4、最适PH载体电荷性质的影响造成酶催化的微环境发生改变：载体带负电，PH升高载体带正电，PH下降目前四十五页\总数九十七页\编于六点5、动力学载体的带电性质和极性可以影响固定化酶的表观Km值：载体所带电荷与底物的电荷相反时，Km值减小，亲和力增大，反之亲和力减小；载体的极性与底物的极性相似时，Km值减小，亲和力增大，反之亲和力减小。目前四十六页\总数九十七页\编于六点6、专一性

作用于低分子底物的酶，特异性不会改变;

既可作用于大分子底物，又能作用于低分子底物的酶，特异性将发生改变，大分子底物由于空间位阻的影响将难于接近酶分子，小分子则不受影响。目前四十七页\总数九十七页\编于六点五、固定化酶的表征（评价）1、酶活力固定化酶的活力即是固定化酶催化某一特定化学反应的能力。其大小可以用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。它的单位可定义为每毫克干重固定化酶每分钟转化底物的量：用μmol/min·mg。活力测定方法分为：间歇测定：在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样测定条件下进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按常规进行测定。连续测定：固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以不同流速流过底物，测定酶柱流出液，根据流速和反应速度之间关系，算出酶活力。目前四十八页\总数九十七页\编于六点2、酶比活力一般采用每克固定化酶所具有的酶活力单位数3、固定化效率酶在固定化时并非所有酶都被固定，总有一部分没有固定，因此需要计算酶与载体结合的百分率，体现固定化的效果。目前四十九页\总数九十七页\编于六点4、活力回收率同时酶在固定化后会造成程度不等的酶活力损失，因此需要测定活力回收率。固定化效率＞活力回收率5、相对酶活：具有相同酶蛋白量的固定化酶活力与游离酶活力的比值。反映固定化酶的应用价值。

目前五十页\总数九十七页\编于六点6、操作半衰期（用来评价固定化酶的稳定性和实用性）固定化酶在连续长期使用过程中，活力会发生衰减即半衰期(t1/2)，酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间。可按下式计算：式中ED为反应t时的酶浓度，E为原有酶浓度。一些固定化酶的半衰期如下表:目前五十一页\总数九十七页\编于六点目前五十二页\总数九十七页\编于六点

六、固定化酶的应用

1、固定化酶在工业生产中的应用：现已用于工业化生产的固定化酶主要有：

(1)氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸；生产成本仅为用游离酶生产成本的60％左右。目前五十三页\总数九十七页\编于六点(2)葡萄糖异构酶

这是世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构酶的放线菌细胞用60～65℃热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，用于连续生产果葡糖浆。此固定化酶在国内外均进行过广泛的研究和应用，1973年就已用于工业化生产。固定化葡萄糖异构酶的制备，除用上述热处理法外，也可用吸附法、结合法、凝胶包埋法、交联法或双重固定化法等进行固定化。目前五十四页\总数九十七页\编于六点(3)天门冬氨酸酶

1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产天门冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。目前五十五页\总数九十七页\编于六点(4)青霉素酰化酶：这是在医药工业上广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢霉素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢霉素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或7-氨基头孢霉烷酸(7-ACA)，也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧键基团的青霉素或头孢霉素。

其他用于工业生产中的固定化酶见下表目前五十六页\总数九十七页\编于六点目前五十七页\总数九十七页\编于六点酶反应器的选择定义：以固定化酶作为催化剂进行酶促反应的设备。类型：类似于发酵过程中的生物反应器。目前五十八页\总数九十七页\编于六点罐式搅拌结合牢固，载体机械强度高流化床和鼓泡式固定化酶的颗粒不宜过大，密度接近1固定化床结合牢固，载体机械强度高，颗粒不宜过小膜式颗粒状以外的其他固定化酶目前五十九页\总数九十七页\编于六点2、固定化酶在传感器方面的应用传感器：获取、放大与处理信息的装置。生物传感器：以固定化的生物材料作为敏感元件（探头）（1）酶传感器酶传感器是由固定化酶与能量转换器(电极、场效应管、离子选择场效应管等)密切结合而成的传感装置，是生物传感器的一种。已广泛应用于临床诊断、工业发酵过程控制和环境监测等领域。其中研究最多、应用最广的是酶电极。目前六十页\总数九十七页\编于六点亲和型与催化型，酶属于催化型。目前六十一页\总数九十七页\编于六点（2）酶电极酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。电位型和电流型。（P212，表9-1）葡萄糖氧化酶电极（电流型）

1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出葡萄糖氧化酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。（见下图）

目前六十二页\总数九十七页\编于六点

用聚丙烯酰胺凝胶包埋法将葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度为20～50μm的酶膜，再与氧电极和使氧容易通过的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切结合，组成葡萄糖氧化酶电极。使用时，把酶电极浸入样品溶液中，样品液中的葡萄糖扩散到酶膜中，酶催化葡萄糖与氧反应，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧电极测定氧浓度的变化，即可知道样品中葡萄糖的浓度。目前六十三页\总数九十七页\编于六点青霉素酶电极以固定化青霉素酶的酶膜与pH电极结合而成。将青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝胶或光交联树脂膜内，然后紧贴在玻璃(pH)电极上即成。当酶电极浸入含青霉素的溶液中时，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氢离子浓度增加，通过pH电极测出pH值变化，即可测出样品溶液中青霉素的含量。目前六十四页\总数九十七页\编于六点（3）离子敏场效应晶体管酶传感器目前六十五页\总数九十七页\编于六点（4）其它酶传感器（P214）1、热敏电阻（图9-12）2、光纤（图9-13）3、声波目前六十六页\总数九十七页\编于六点3、固定化酶在医疗治疗上的应用：（1）作为治疗药物固定化酶由于其高稳定性，低免疫性，使其在作为治疗药物时，较之溶液酶，表现出极大的优势。作为治疗药物，溶液酶具有一些“致命”弱点：①酶作为异体物质，反复应用会导致免疫反应②酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白酶水解破坏。③由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度。溶液酶的这些缺点，通过选择适宜的载体与方法将它们固定化以后就能逐一地加以解决。目前六十七页\总数九十七页\编于六点（2）作为“人工脏器”

固定化酶可做成“人工脏器”参与体外循环，其应用主要有两方面：

a.用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢废物

如清除尿毒症病人体内积累的尿素；进行这类应用时除了要考虑半寿期、免疫过敏等问题外，还要在“人工脏器”中偶联多种组成成分以彻底除去毒性产物。如处理尿素时，除了脲酶外，还要解决尿素分解生成氨的问题，这就需要另外加入谷氨酰胺合成酶或加入去氨的树脂等。目前六十八页\总数九十七页\编于六点b.除去(一种或多种)氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死”治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的“人工脏器”加以处理，然后再流回体内。目前六十九页\总数九十七页\编于六点

酶应用方式

载体应用对象半寿期

优缺点尿酸酶门冬酰胺酶脲酶脂肪酶酪氨酸酶谷氨酰胺酶β-葡糖苷酸酶β-葡糖苷酸酶胆红素葡糖醛酸基转移酶过氧化氢酶组成体外循环移接体内循环口服体内循环体内循环体内循环体内循环体内循环体内循环血液透析装置Dacron脉管修复用和移接管尼龙微囊肠衣包被可溶性的聚顺丁烯二酸与聚丙烯酸聚合物可溶性的聚乙二醇血影细胞脂质体和聚乙烯吡咯烷酮结合的微粒体尼龙微囊急淋白血病尿胰机能不全癌瘤癌瘤取代和补偿先天缺失补偿先天缺失黄疸约2d1d1d24h24h18h短暂优点：加速尿酸移去缺点：需移去尿素优点：无免疫原性质优点：易缺点：消亡快；载体有毒优点：抗酸优点：最适pH向中性偏优点：无抗原性半寿期长优点：抗原性优点：载体能被代谢缺点：对载体内含物敏感优点：不需分离酶缺点：需辅助因子扩散优点：能做成糊状缺点：在唾液很快移除目前七十页\总数九十七页\编于六点4、固定化酶与基础理论

用固定化酶研究亚基间关系：在适宜的条件下将寡聚体酶的一个亚基和载体偶联固定变性并除去其他亚基复性及活性检测亚基重组和酶性质的测定

目前七十一页\总数九十七页\编于六点七、固定化酶和水溶性酶比较具有以下特点：优点：(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺.(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化。(3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。(5)较能适应于多酶反应。(6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。目前七十二页\总数九十七页\编于六点缺点：(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。(2)比较适应水溶性底物和小分子底物。(3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经分离后，才能固定化。目前七十三页\总数九十七页\编于六点第二节辅酶及细胞的固定一、辅酶固定1、辅基的固定：1）、概念：将载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。2）、载体：琼脂糖，纤维素，玻璃珠，及合成高分子载体，他们均具有：非特异性吸附，多孔，稳定性好，耐一定的机械强度。3）、连接臂：如溴化氰等小分子。目前七十四页\总数九十七页\编于六点2、辅酶的固定1）方法载体结合法目前七十五页\总数九十七页\编于六点目前七十六页\总数九十七页\编于六点包埋法类似于酶的包埋目前七十七页\总数九十七页\编于六点3、辅酶的再生1）、酶法再生目前七十八页\总数九十七页\编于六点目前七十九页\总数九十七页\编于六点2）、电化学再生法介质可避免电极的吸附作用和帮助电子定向传递。提高辅酶的再生效率。目前八十页\总数九十七页\编于六点二、固定化细胞1、概念：就是将具有一定生理功能的生物细胞用一定的方法将其固定，作为固定生物催化剂而加以利用的一门技术。目前八十一页\总数九十七页\编于六点2、固定化细胞的特点1）、优点省去了酶分离的成本；无需辅助因子的固定与再生；耐受性增加，细胞可重复使用；保持酶在细胞内的原始状态，稳定性增加。目前八十二页\总数九十七页\编于六点2）、缺点细胞膜和壁会阻碍底物的渗透与扩散；副产物多，难分离目的产物；维持固定化细胞的活性较固定化酶难。目前八十三页\总数九十七页\编于六点3、固定方法目前八十四页\总数九十七页\编于六点1）、吸附法天然载体：纤维素、葡聚糖、琼脂糖、明胶、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等；人工载体：多孔塑料、金属网丝、微载体和中空明胶以及合成的离子交换介质。目前八十五页\总数九十七页\编于六点2）、共价交联3）、包埋法琼脂糖凝胶；海藻酸钙凝胶；角叉菜胶；明胶；聚丙烯酰胺凝胶；光交联树脂。目前八十六页\总数九十七页\编于六点4）、无载体固定化1）、用双功能试剂或多功能试剂进行细胞间的交联；2）、诱导细胞形成细胞团，诱导物有：钛或锆的氢氧化物聚合物，但钛或锆的氢氧化物通常要对细胞产生毒害；3）、自聚体。目前八十七页\总数九十七页\编于六点４、固定化细胞的优点如下:(1)省去了酶的分离手续．为多酶系统，无须辅因子再生。(2)细胞生长快、而且多、反应快。(3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污染因子的抵抗力增加。目前八十八页\总数九十七页\编于六点５、固定化细胞存在的缺点：(1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。

(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性阻止副产物的形成。

(3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。目前八十九页\总数九十七页\编于六点4、固定化微生物细胞的应用1）、利用固定化微生物细胞生产各种产物：