分子生物学第四章基因工程常用工具酶

分子生物学第四章基因工程常用工具酶第一页，共四十五页，编辑于2023年，星期五ManipulatingGenes-TransferringGenesExtractDNARestrictionLigationTransformationSelectionCulturing2第二页，共四十五页，编辑于2023年，星期五重组DNA实验中常见的主要工具酶3第三页，共四十五页，编辑于2023年，星期五

我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：1、准确切割DNA分子的工具（“分子手术刀”）

------限制性内切酶2、DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）

------DNA连接酶4第四页，共四十五页，编辑于2023年，星期五

本章内容

第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶的发现

二、I类和III类限制和修饰酶的基本特征

三、II类限制和修饰酶的基本特征

第二节DNA连接酶第三节其它工具酶一、聚合酶二、末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)三、SI核酸酶

四、Bal31核酸酶五、碱性磷酸单脂酶5第五页，共四十五页，编辑于2023年，星期五第一节限制性内切酶上海自来水来自海上黄山落叶松叶落山黄识别序列回文结构6第六页，共四十五页，编辑于2023年，星期五20世纪70年代病毒学研究中最有深远影响的发现之一在对噬菌体与其寄主相互关系的研究中发现的一、限制性内切酶的发现77第七页，共四十五页，编辑于2023年，星期五限制性内切酶的分类（三大类）I类，II类,III类.I类，III类为限制---修饰酶。兼具限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。8第八页，共四十五页，编辑于2023年，星期五原核细胞中限制和修饰系统

I类酶II类酶III类酶

酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分离二亚基双能

识别位点二分非对称序列4-6bp序列，回文结构5-7bp非对称序列

切割位点距识别位点1000bp在识别位点中或靠识别位点在识别位点下游24-26bp限制性反应互斥分开反应同时竟争与甲基化反应限制作用需要ATP需要需要不需要

9第九页，共四十五页，编辑于2023年，星期五

二、I类酶，III类酶限制-修饰酶基本特怔

1、I类酶，EcoK，EcoB。（1）异源多聚体，亚基R.M.S分别具有限制,修饰酶的作用，特异性位点识别活性。（2）I类酶与DNA识别位点结合依赖亚基M与辅助因子S—腺苷甲硫氨酸(SAM)相互作用。（3）S—腺苷甲硫氨酸(SAM)通过变构作用使酶处于活性状态，酶与DNA识别位点结合后，根据甲基化状态发挥相应酶的活性，或限制,或限修饰，或不限制不限修饰

10第十页，共四十五页，编辑于2023年，星期五11第十一页，共四十五页，编辑于2023年，星期五2、III类限制修饰酶基本特怔（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用.（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关

MboII识别5’-AAGA-3’

切割位点5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’12第十二页，共四十五页，编辑于2023年，星期五1、命名原则:HindⅢ

属Haemophilusinfluenzae

d菌株流感嗜血杆菌d菌株的第3种酶①第一个字母是细菌属名的第一个字母，要大写；②第2、3个字母是细菌种名的前两个字母，要小写；

上述字母都是用斜体。③接着是细菌菌株的第一个字母，用正体字母书写；④如果同一菌株有不同的内切酶时，按发现次序分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……表示。种菌株序三、II类限制修饰酶基本特怔13第十三页，共四十五页，编辑于2023年，星期五识别序列特点——

回文结构(palindrome)

即反向重复结构，以DNA分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。

每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点（4~8bp）。2、识别序列：GGATCCCCTAGGBamHⅠ14第十四页，共四十五页，编辑于2023年，星期五

3、切割方式

A．以酶切特点来分同位酶：识别相同序列，切点不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。

B．以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。粘性末端：（CohesiveEnds）两个突出末端可退火互补——DNA是分子重组的基础15第十五页，共四十五页，编辑于2023年，星期五同裂酶

又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。16第十六页，共四十五页，编辑于2023年，星期五同裂酶——同识同切17第十七页，共四十五页，编辑于2023年，星期五同裂酶——同识异切18第十八页，共四十五页，编辑于2023年，星期五同尾酶

同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。19第十九页，共四十五页，编辑于2023年，星期五可变酶可变酶

识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。20第二十页，共四十五页，编辑于2023年，星期五BamHⅠCCCGGGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGSamICCCGGGGGGCCCGGGCCC+平末端（Bluntend）：对称轴切割粘性末端（Stickyend）：交错切割切口：平端切口、粘端切口21第二十一页，共四十五页，编辑于2023年，星期五几个常用限制性内切酶及其切点22第二十二页，共四十五页，编辑于2023年，星期五DNA分子的两条脱氧核苷酸长链是反向平行的，一条链是5’→3’方向，另一条是3’→5’方向。在一般表示DNA分子碱基序列的图中，上边一条链是5’→3’方向，下边一条是3’→5’方向。限制性内切酶的识别序列也是有方向性的，通常写出的限制酶的识别序列是专指5’→3’那条链上的碱基序列。23第二十三页，共四十五页，编辑于2023年，星期五

如果用一种限制酶，切割两种不同的DNA时，产生相同的末端，混合后“退火”，这两种不同的DNA分子彼此可以连接，形成重组DNA分子。24第二十四页，共四十五页，编辑于2023年，星期五限制性内切酶的剪切方式25第二十五页，共四十五页，编辑于2023年，星期五YuZheng,etal.Usingshotgunsequencedatatofindactiverestrictionenzymegenes.NucleicAcidsRes.,2009,37:e1.Wholegenomeshotgunsequenceanalysishasbecomethestandardmethodforbeginningtodetermineagenomesequence.Thepreparationoftheshotgunsequenceclonesis,infact,abiologicalexperiment.ItdetermineswhichsegmentsofthegenomecanbeclonedintoEscherichiacoliandwhichcannot.Byanalyzingthecompletesetofsequencesfromsuchanexperiment,itispossibletoidentifygeneslethaltoE.coli.26第二十六页，共四十五页，编辑于2023年，星期五Amongthissetaregenesencodingrestrictionenzymeswhich,whenactiveinE.coli,leadtocelldeathbycleavingtheE.coligenomeattherestrictionenzymerecognitionsites.Byanalyzingshotgunsequencedatasetsweshowthatthisisareliablemethodtodetectactiverestrictionenzymegenesinnewlysequencedgenomes,therebyfacilitatingfunctionalannotation.Activerestrictionenzymegeneshavebeenidentified,andtheiractivitydemonstratedbiochemically,inthesequencedgenomesofMethanocaldococcusjannaschii,BacilluscereusATCC10987andMethylococcuscapsulatus.27第二十七页，共四十五页，编辑于2023年，星期五四、酶切反应体系DNA或RNA……………..测浓度缓冲液（Mg2+)…………10×双蒸水酶（含甘油）28第二十八页，共四十五页，编辑于2023年，星期五部分消化和完全消化构建载体时，若目的基因内部存在与多克隆位点相同酶切位点时，可以考虑使用部分酶切29第二十九页，共四十五页，编辑于2023年，星期五

常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ30第三十页，共四十五页，编辑于2023年，星期五(1)限制性内切酶能够识别和切割单链DNA，例如有些酶能够识别和切割非回文序列，但这种酶在基因工程应用不够广泛限制性内切酶能否切割单链？(2)基因工程中的限制性内切酶主要是识别和切割双链DNA，因为大多数限制内切酶是以二聚体的形式与DNA结合，酶与DNA形成稳定的化合物，产生反应，也有部分酶是以单体的形式与DNA结合31第三十一页，共四十五页，编辑于2023年，星期五第二节DNA连接酶------“分子缝合针”DNA连接酶（DNALigase）：

催化两条DNA链的3´-OH和5´-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4DNA连接酶。32第三十二页，共四十五页，编辑于2023年，星期五外源基因与载体的连接方式：（1）粘性末端连接方式：①同一限制性内切酶切点的连接②不同限制性内切酶切点的连接33第三十三页，共四十五页，编辑于2023年，星期五（2）平端连接适用于：①限制性内切酶作用产生的平端②粘端经特殊酶处理变为平端34第三十四页，共四十五页，编辑于2023年，星期五（3）同聚物加尾连接

由末端转移酶（Terminaltransferase）作用，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。35第三十五页，共四十五页，编辑于2023年，星期五（4）人工接头

平端加上带有新的酶切位点的寡核苷酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。36第三十六页，共四十五页，编辑于2023年，星期五第三节其它工具酶修补工具酶

DNA聚合酶I可被枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解为2个片段，其中带有C末端的大片段叫DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）。它具有5’——3’聚合酶活性或3’--5’外切酶活性。而N端小片段只具有5’--3’外切酶活性。37第三十七页，共四十五页，编辑于2023年，星期五Klenow大片段----补平或标记限制酶切割产生的3’凹端，例5’----TTCGGACTACG--------3’3’----AAGCCTGATGCCAT---5’T4噬菌体DNA聚合酶具有5’--3’聚合酶活性或3’--5’外切酶活性。其3’--5’外切酶活性比Klenow片段强200倍。38第三十八页，共四十五页，编辑于2023年，星期五末端加工酶S1核酸酶，碱性磷酸单脂酶末端转移酶催化DNA链的3’-OH端加脱氧核糖核苷酸(dNTP)的聚合反应，使载体和待克隆基因接上互补的同聚体尾部（人工加polyA或polyT尾）反转录酶(用原核系统表达具内含子的真核基因)去磷酸化酶：载体去磷酸化防治自身环化39第三十九页，共四十五页，编辑于2023年，星