2022脊髓小脑共济失调2型家系ATXN2基因中间重复病例表型与分子遗传学特征(全文)

2022脊髓小脑共济失调2型家系ATXN2基因中间重复病例表型与分子遗传学特征（全文）目的探讨脊髓小脑共济失调2型（SCA2）致病基因ATXN2异常等位基因中间重复个体的表型和分子遗传学特点。方法针对2005—2018年中日友好医院神经科运动障碍与神经遗传病研究中心收集的1383个常染色体显性遗传共济失调家系的先证者和部分家系成员，采用荧光标记毛细管电泳片段分析方法进行动态突变检测，对携带ATXN2基因中间重复的个体进行临床表型和遗传特征分析。结果共检出163个家系（包含先证者和家系成员共203人）携带异常扩展的ATXN2基因CAG重复序列，其中93个家系中有107例的异常扩展等位基因重复次数在29~34次之间。在其中的20个亲子对中，父系遗传16个，异常等位基因的代间扩展增加0~28次，母系遗传4个，异常等位基因的代间扩展增加0~4次。结论对于临床拟诊SCA2家系患者，需对其亲代或成年子代个体进行ATXN2基因检测，以免漏诊。动态突变基因检测有助于识别中间重复的个体，对明确家系致病基因和遗传咨询至关重要。脊髓小脑共济失调（spinocerebellarataxia，SCA）是一组主要累及脊髓、小脑、脑干等部位的神经系统退行性疾病，呈常染色体显性遗传，具有高度的遗传异质性和临床变异性［1,

2］。脊髓小脑共济失调2型（spinocerebellarataxiatype2，SCA2）表现为共济失调、慢眼动、腱反射减弱或消失、姿势性震颤等，其致病基因ATXN2定位于12q24.1，编码ataxin-2蛋白，由第1外显子内CAG三核苷酸重复扩展而致病。ATXN2基因的CAG正常重复范围是13~31次，异常重复次数>34次介于两者之间的重复次数为中间重复。我们回顾性总结了携带ATXN2异常等位基因中间重复个体的临床资料，对其临床表型及分子遗传学特点进行细致分析。资料和方法临床资料研究对象来自2005—2018年中日友好医院神经科运动障碍与神经遗传病研究中心收集的1383个常染色体显性遗传共济失调家系先证者及部分家系成员。排除感染、中毒、缺血、代谢、免疫或肿瘤等继发性原因。本研究为家系研究，经中日友好医院伦理委员会审批（批号：2013-39），所有受试者及其家属均签署知情同意书。研究方法1.样本采集及基因组DNA的提取：在知情同意的情况下，采集患者及家系成员外周血5ml，以质量分数为3.8%的枸橼酸钠进行抗凝，采用标准酚氯仿提取法提取基因组DNA。2.聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）和琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物：根据ATXN2基因第1外显子CAG重复片段两侧序列设计引物，由北京赛百盛基因技术有限公司进行合成，正向引物序列：5′-TTTGGTAGCAACGGC-AAC-3′；反向引物序列：5′-CGGGCTTGCGGACA-TTGG-3′。PCR反应体系制备方法：依次加入脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）2.50mmol，2×GC缓冲液Ⅰ12.50μl，引物各5pmol，模板DNA100ng，r-Taq1U，加灭菌去离子水补充至25μl；反应条件为94℃预变性5min，以94℃30s、58℃30s、72℃45s，共循环35次，72℃延伸10min。PCR扩增产物以质量浓度为3%的琼脂糖凝胶电泳，100V电压电泳40min，对于出现2个电泳条带的样本进行毛细管电泳片段分析。基于毛细管电泳的片段分析：对上述电泳中出现2个电泳条带的样本进一步行毛细管电泳分析。采用荧光标记M13末端加尾法扩增ATXN2基因CAG重复片段，引物序列包括M13-反向引物（即反向引物5′端加M13序列，该序列为：5′-CACGACGTTGTAAAACGA-反向引物序列-3′）、经D4荧光标记的M13引物序列（为5′-CACGACGTTGTAAAAACGAC-3′，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）以及上述正向引物。PCR反应体系为dNTPs2.50mmol、2×GC缓冲液Ⅰ12.50μl，正向引物3pmol，M13引物3pmol，带有M13序列的反向引物0.2pmol，模板DNA100ng，r-Taq1U，加灭菌去离子水补充至25μl。采用美国BeckmanCoulter公司生产的CEQ-8000核酸分析仪对PCR扩增产物进行片段分析：取20μl甲酰胺，0.25μlCEQDNASizeStandardkit-600片段作为标准内标，1μlPCR扩增产物混匀后上样；预设程序进行电泳分离，分离条件为毛细管温度达50℃时，90℃变性120s，2.0kV电压下注入样本30s、4.8kV电压下电泳70min，以预设的分析参数进行片段分析。结果一、基因检测结果1383个临床拟诊常染色体显性遗传共济失调家系中有来自163个家系的共203人携带异常扩展的ATXN2基因CAG重复序列（图1A），其中107例（来自93个家系）异常重复次数为29~34次，男性59例，女性48例，发病年龄为18~56（36.88±9.63）岁，病程0~30（5.53±6.03）年。其中64例中间重复个体毛细管电泳合图见图1B。图1

临床拟诊为脊髓小脑共济失调患者的ATXN2基因CAG重复片段分析毛细管电泳图。A：1例CAG重复次数为15/32次：正常重复次数为15次，异常重复次数为32次，黑箭头为正常片段，红箭头为异常重复片段；B：64例合图：异常等位基因CAG重复次数为29~32次，黑框内为正常重复区间，红框内为异常重复区间

携带异常扩展ATXN2基因CAG重复次数29~34次者的93个家系中共受检20个亲子对，其中父系遗传16个，异常等位基因代间扩展0~28次（表1）；母系遗传4个，异常等位基因代间扩展0~4次（表2）。二、亲代与子代临床表型差异与动态突变扩展相关性1.子代发病年龄早：亲子对1、2、3、8、10中亲代均无明显发病表现，与子代同时就诊，经检测亲代均携带ATXN2基因中间重复，代间传递中重复序列明显扩展，引起显著的遗传早现。典型家系（亲子对8）：先证者女性，21岁，主因“行走不稳3年”于2014年9月就诊，其父51岁陪同就诊。先证者于3年前（18岁）出现上下楼不稳，写字欠灵活，紧张时身体晃动，后出现言语不清，逐渐加重。神经系统体检：构音障碍，慢眼动，未见眼震。四肢肌力Ⅴ级，肌张力适中，腱反射未引出，病理征阳性。指鼻、跟膝胫试验不稳，快速轮替试验轻度笨拙。站立时轻度摇晃。其父自觉正常，神经系统体检：足跖反射中性，余未见异常。家族史：其大伯、姑姑60多岁出现行走姿势异常。头颅MRI显示：脑干小脑萎缩。基因检测结果：先证者ATXN2基因CAG重复次数为13/41次，其父CAG重复次数为16/31次（表1）。2.亲代发病年龄晚：亲子对6、13、14、18、20中亲代发病年龄晚，经检测携带ATXN2基因中间重复，其子代处于婚育年龄，均未发病。典型家系（亲子对18）：先证者女性，55岁，主因“行走不稳6年”于2013年6月就诊，其女28岁陪同就诊，无异常表现。先证者于6年前（49岁）出现下肢发僵，行走不稳，易抽筋，后逐渐出现言语不清，眼花，饮水呛咳，逐渐加重，激动时身体晃动。神经系统体检：轻度构音障碍，慢眼动，未见眼震。四肢肌力Ⅴ级，肌张力偏低，腱反射未引出，病理征阳性。闭目难立征阳性，姿势性震颤。家族史：其父62岁去世，其母59岁因脑干脑炎去世。头颅CT显示：明显小脑萎缩。基因检测结果：先证者ATXN2基因CAG重复次数为15/33次，其女CAG重复次数为15/34次（表2）。讨论SCAs是一类具有高度遗传异质性和临床变异性的神经系统退行性疾病，目前已报道的亚型多达40余种［3,

4］，且与SCA致病相关的新基因还在不断被发现。目前已知有7种是由致病基因编码区CAG三核苷酸异常重复扩展突变导致编码蛋白的多聚谷氨酰胺链延长而致病，分别是SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA17、齿状核红核苍白球路易体萎缩（dentatorubral-pallidoluysianatrophy，DRPLA），属于多聚谷氨酰胺疾病（polyglutaminedisease）［5］。其中，SCA2由Wadia和Swami［6］在印度人群中首次报道，也被称为Wadia-Swami型共济失调，之后陆续在其他多个国家报道。研究结果显示，世界范围内SCA2约占SCAs家系的15%［7］，在特定人群如古巴、意大利南部、印度、墨西哥人群的发病率更高［8,

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10］。SCA2的确诊依赖于检出ATXN2基因CAG异常重复扩展，该基因正常重复和异常重复区间差距很小，介于正常与异常交界区的重复次数称为中间重复。目前较为公认的观点是，ATXN2基因CAG重复序列正常重复次数为13~31次，>34次者可出现共济失调表现，32~34次可出现外显不全现象，27~31次重复具有不稳定性，代间传递过程中可能发生进一步扩展［11］。在致病基因CAG重复序列动态突变检测中，由于CAG重复区GC含量较高，DNA片段形成二级结构，导致PCR扩增产物在电泳中的迁移不同于碱基随机组成的片段。随着分子遗传学技术的发展，目前国际公认检测动态突变的方法包括：毛细管电泳片段分析、三代测序，而后者由于成本高，分析流程需要优化，目前尚未用于临床常规检测。其他方法如一代直接测序和克隆测序，因为等位基因重复序列大多为杂合，克隆过程繁琐且不稳定，目前已被弃用。毛细管电泳片段分析方法采用变性后的单链DNA，电泳时可发生“发卡”形二级结构，导致DNA链变短，以GC含量相对均衡的DNA片段内标作为参照，判读的单链DNA长度小于实际长度［12,

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14］。通过本中心长期的动态突变检测实验数据积累，我们认为基于毛细管电泳的片段分析在判读重复序列时尽管存在一定偏差，但属于系统误差，可预估，且结果重复性好，不影响基因检测结果的判定［15］。本研究基于毛细管电泳片段分析方法检出163个家系共203人携带异常扩展ATXN2基因CAG重复序列，重复次数位于29~34次者107人，明显多于其他多聚谷氨酰胺疾病的中间重复者，应引起更多的关注。对于存在ATXN2基因中间重复者的家系而言，有2种可能的情况：（1）家系中子代患病就医，基因检测显示其病因为ATXN2基因动态突变所致，陪同就诊的亲代自觉无明显临床表现或仅有早期疾病表现，检出亲代ATXN2基因CAG重复次数为中间重复，从而明确了家系致病基因。代间传递过程中，CAG重复次数明显扩展，表现为明显遗传早现。（2）家系中亲代患病就医，基因检测显示ATXN2基因CAG重复次数位于中间重复，子代处于婚育年龄，尚无临床表现，检测结果显示子代ATXN2基因CAG重复次数异常，对于家系后代的遗传咨询和生殖干预非常重要。CAG重复序列在代间传递过程具有不稳定性，即动态突变在代间传递过程中可能发生突变，进而增加了个体罹患多聚谷氨酰胺疾病的风险。在一项研究中，研究者对13536名欧洲人进行了ATXN2基因检测，发现携带中间重复和异常重复者分别是10人和8人，其中异常等位基因重复的次数分别为33次和36次，说明携带中间重复或异常重复低限的个体在人群中存在一定比例，提示在配子形成过程中可能进一步扩展突变，导致生育下一代患有非多聚谷氨酰胺疾病的风险增大［16］。本研究共检出重复次数位于29~34次的个体107人，其中84例均有不同程度的SCA2临床表现，其余23人无症状，对于携带中间重复等位基因的无症状个体，需结合家系上下代的动态突变情况，开展遗传咨询，尽力阻断致病基因突变的代间传递。既往研究显示，携带ATXN2基因中间重复的SCA2家系在代间传递过程中可出现重复次数增加、缩短和不变的情况［17］，且父系遗传比母系遗传具有更显著的长度多变性。SCA2发病年龄与扩展的CAG重复序列呈负相关的现象仅能解释50%~70%的发病年龄变异性［18］。本文提及的携带ATXN2基因中间重复的20个亲子对中，父系遗传16个，子代重复次数增加和不变的亲子对分别是14个和2个，代间扩展幅度最多增加了28次；母系遗传4个，子代重复次数增加和不变的亲子对分别是3个和1个，代间扩展幅度最多增加了4次。父系遗传较母系遗传代间扩展显著，与以往的研究结