第四章酶的分离纯化

第三章

酶的分离纯化与保存酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化的方法主要沿用蛋白质分离提纯的方法。酶的分离纯化又有其自身特点：难点：目标酶在细胞中含量少优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪酶的分离纯化是一门实验科学酶的分离纯化，就是将酶从细胞或者其他含酶的原料中释放出来，再与杂质分开，而获得符合研究和使用要求的酶制品的过程细胞结构与酶分布胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到各个作用部位，并不断补充和更新胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质空间、外膜及细胞外环境中的酶不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化选用技术前，需考虑：1.目标酶分子特性及其他物理、化学性质2.酶分子和杂质的主要性质差异3.酶的使用目的和要求4.技术实施的难易程度5.分离成本的高低6.是否造成环境污染不同酶的分离、提纯方法，主要根据：

酶分子之间各种选择性的差异

分子大小和形状

酸碱性质

溶解度

吸收性质

对其他分子的生物学亲和力等等

酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。酶的分离纯化可以分为三个阶段1、粗蛋白：多使用盐析沉淀法，可以粗略去除蛋白质以外的物质；2、部分纯化：使用各种层析法；3、均质酶：目标酶的进一步精制纯化，常用电泳或者色谱法。主要过程：细胞破碎酶的提取离心分离过滤沉淀层析电泳萃取浓缩干燥结晶保存。。。一、酶分子制备的前处理1、生物材料的选择选择目的酶含量高的选择容易取材的利用细胞培养技术和基因工程重组DNA技术。目前，酶的来源大都为来自微生物

材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存，且动物材料则需深度冷冻保存：动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。2、细胞的破碎将细胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。

机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎（酶解破碎）自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理机械邻法（临注意休预冷境）：捣碎为法：10覆00轻0r廊pm研磨宾法：匀浆锤法：禾研杆卷和管泽壁间选只有圆几百啦微米DY佛89烂-I型绒电动危玻璃柏匀浆久机物理斧法：反复罚冻融鸽法：桑时间我长，冲需加捡蛋白浩酶抑述制剂哗（PM紧SF、ED船TA等）超声然波处屠理法昆：处谈理时糊间尽植量短叶，避份免局四部过词热使舱得酶旋失活渗透锤压法票：冷热擦交替它法：JY捐92肉-I这I祝D超声闹波细胞柿粉碎敬机高压先细胞僵破碎篇机化学爹与生盘物化锁学方自法自溶蝇法：呜利用赛细胞县自身匆酶系蚂，保残持一捧定pH和温蚊度条那件，勒使细塌胞破恩坏有机拨溶剂私处理董法：毁通过庙有机甜溶剂决对细尖胞膜壮的作州用，隆使得年细胞跨破碎抛（Tw闯ee桶n,恢Tr番it忍on，氯劳仿等物）酶解凯法：碰根据遇细胞劣外层完结构达特点械，加帝适当绸的酶斗破坏膝细胞梢壁，膏并在千低渗延溶液助中使桐细胞留破碎如：遇霉菌基：几旁丁质边酶,酵母艘细胞播：β－葡假聚糖量酶

动物细菌植物

∣研磨∣超声波∣纤维素酶

∣匀浆∣溶菌酶∣

↓捣碎机↓化学溶剂(甲苯)↓

提取液

3.生物己大分己子的船提取梢（抽恼提）“提取”是在宇分离章纯化经之前犬将经估过预仰处理柔或破搅碎的俱细胞督置于梢溶剂逢中，针使被阁分离修的生由物大条分子汪充分仙地释麻放到场溶剂唤中，木并尽就可能比保持样原来谊的天公然状达态不还丢失翻生物棉活性杀的过筐程。酶的塞定位颂不同于，其简提纯予难度劳也不绵相同“固素相转伯入液污相”承，或尖“从初细胞付内的甩生理图状况挑转入裁外界锁特定邀的溶爆液中椒”。——相似身相溶酶提徐取时偷首先移应根袍据酶的瞎结构侦和溶吐解性效质，络选择伏适当娇的溶贵剂。一般模说来承，极鸭性物肤质易耐溶于其极性被溶剂纱中（水疫、稀兄酸、写稀碱于、稀挡盐溶碌液等所），非毙极性圾物质绳易溶成于非喝极性糖的有生机溶猫剂中外，酸连性物摘质易秒溶于乱碱性俩溶剂春中，净碱性事物质复易溶贫于酸无性溶树剂中提高威温度啄，降堪低溶盆液粘纱度、吼增加些扩散困面积朴、縮盗短扩姑散距障离，圈增大藏浓度稳差等静都有暑利于效提高拆酶分资子的饲扩散讲速度购，从被而增顶大提万取效陷果。为了腿提高讽酶的迟提取苗率并停防止设酶的料变性用失活遍，在他提取栏过程两中还萍要注义意控田制好旋温度仪、pH值等寄提取侍条件驱。⑴盐溶粥液提各取：一般亭以低盐剥溶液(0助.0恨5-幼0.肯2m航ol坟/L船)为主狡。稀军盐溶芽液和颈缓冲勿液对炉蛋白中质的夫稳定河性好尝，溶工解度甚大，起是提婆取蛋贿白质碰和酶涛最常临用的斥溶剂柔。盐溶乳：在乱低盐筐浓度获条件样下，热酶的挑溶解晴度随羞盐浓搏度增偏大而请增大盐析粘：当假盐浓狱度达辛到一榜定界侮限后按，酶区的溶刻解度使随着蜘盐浓顷度增闲大而篇降低大多匆数蛋样白类概酶都主溶于吩水，义而且品在低撑浓度火的盐槐存在才的条际件下左，酶眨的溶管解度落随盐陆浓度要的升卸高而许增加权，这碎称为咳盐溶路现象药。(2暮)稀酸坝（碱阀）溶初液提城取在偏者离等没电点0.秒5左右黄，溶趴解度市增大根据形等电腿点，鹿选择廉合适晓的pH注意陵，不都能采忌用极叛端pH值，芒操作旗时要坑注意墙避免仇局部血过酸星或过区碱(3书)变性厌剂的蜜使用如：劣脲、卫胍等膜（胃蛋白凝）酶届，包骂涵体谎形式接的酶疤等有变技性剂笛，蛋堂白结爪构松担散，顾易于肃溶解去除瓜变性阅剂，尚又可江恢复日原来笨构象典型拣的抽名提液漏组成离子艘强度沿调节朋剂：辈蔗糖犬、KC胜l、Na针Cl等pH缓冲麦剂：谈各种栏缓冲炒液温度茅效应察剂：DM钥SO、甘潮油蛋白蹦酶抑孤制剂愉：PM鹅SF、亮砌肽素抗氧板化剂:D温TT篮,巯基丽乙醇重金搁属络女合剂葱：ED搬TA增溶蹲剂：Tr彩it捧on葬-1晌00（4）有机煌溶剂利提取一些端和脂患类结睛合比白较牢慰固或守分子币中非厨极性肃侧链魂较多棵的蛋摸白质晴和酶墙。常用赠的有哗机溶昆剂有诞乙醇煮、丙思酮、炕异丙均醇、霞正丁榆酮等伴，这令些溶嫂剂可勉以与盈水互雾溶或番部分金互溶状，同碗时具命有亲嘱水性膜和亲冒脂性岗，因趴此常判用来添提取同与脂殿结合衣较牢骆或含汉非极格性侧鹿链较恩多的允蛋白伟质、乱酶和妄脂类挎。酶的次主要辫提取踩方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶二、记酶分篮离纯闹化的涨基本纤技术遇（简蓝介）溶解烧度：殿盐析深、沉位淀分子拐大小欣：离陵心、挥凝胶纽奉层析逃、过超滤电荷是：离商子交鄙换层亩析、额电泳亲和猫性：摇亲和丑层析萃取结晶等等(一)沉淀——根据梢不同睛物质跃在溶硬剂中融的厚溶解仅度不径同而渴分离沉淀边是溶奔液中绘的溶笋质由乞液相帽变成痰固相求析出距的过雕程溶解塞度的胆大小踩与溶餐质和柜溶剂鼻的化水学性饮质及伞结构姑有关赌，溶遥剂组签分的脱改变锋或加烤入某卵些沉史淀剂风以及段改变前溶液蒸的pH值、鹅离子爪强度捡和极闪性都箩会使辣溶质荒的溶糕解度丸产生率明显特的改愁变。+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化筒膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液李中蛋弟白质董的聚缘瑞沉酶分锤子制沾备中盲最常护用的滔几种喂沉淀战方法⑴中性灰盐沉惠淀（赖盐析征法）吊：⑵有机睁溶剂犁沉淀宽：⑶选择言性沉走淀⑷等电剥点沉佛淀：⑸有机帅聚合童物沉岔淀：聚乙贸二醇中性桶盐的臭亲水娱性大磁于蛋姥白质红和酶反分子件的亲浪水性萄，所额以加泛入大疮量中相性盐艺后，详夺走涉了水梁分子呼，破坏毒了水突膜，暴唐露出核疏水啦区域巨，同动时又中和洁了电拦荷，破塘坏了扔亲水匀胶体包，蛋琴白质肃分子顿即形袄成沉穗淀。优点北是：①成本欧低，闹不需线要特居别昂皮贵的叛设备云。②操作萌简单片、安油全。③对许览多生干物活竖性物花质具拼有稳以定作未用。1、中缎性盐妻沉淀在盐馋浓度赖达到柴某一扛界限藏后，转酶的愿溶解串度随思盐浓薪度升贺高而雀降低庄，这肆称为垒盐析球现象呼。中性凭盐的恶选择常用透的中冒性盐粱有硫拿酸铵婶、硫冠酸钠屿、硫爸酸钾德、硫秃酸镁侦、氯犯化钠忍、磷洋酸钠新等，裁其中白最重窜要的宗是（NH4）2SO4：①溶解夸度大歌：尤其禾是在突低温屠时仍诸有相翼当高顷的溶电解度盼（酶惯和各扰种蛋幸白质交通常爪是在份低温狂下稳笛定，洗盐析丑操作啊也要看求在缝低温返下（0～4℃）进章行）

0℃20℃80℃100℃（NH4）2SO470.675.495.3103Na2SO44.918.943.342.2NaH2PO41.67.893.8101②分离体效果盲好：有的企提取汤液加偿入适昆量硫升酸铵苗盐析膜，一梯步就腹可以撑除去75％的弃杂蛋依白，溪纯度训提高栗了四寇倍。③不易覆引起琴变性，有哪稳定改酶与增蛋白册质结呆构的廉作用。有慌的酶耻或蛋董白质棍用2～3m攻ol现/L的(N缩慧H4)2SO4保存笛可达耀数年炕之久坑。④可以泪分级沉淀:半饱瞒和硫存酸铵净溶液返可沉芒淀血常浆球阅蛋白喝，而供饱和份硫酸渔铵溶约液可察沉淀尤血浆管清蛋澡白。⑤价格佛便宜舅，废血液不辱污染材环境挡。影响虫盐析现的因层素盐饱难和度亮的影欠响不同扛的蛋捆白质概，所参需的借饱和侨度不紧同蛋白县质浓鼓度的添影响在相类同的假盐析沾条件残下，浪蛋白境质浓榆度越苦大越冈易沉默淀蛋白淹质的乡丰浓度仪愈高场，其挪它蛋遇白质锋的共渡沉作昏用也禾愈强蹄，分愚辨率盖降低炸，一掩般常柱将蛋略白质驻浓度渴控制割在2～3％丈为宜pH的影其响但硫诸酸铵城具腐朝蚀性虾且缓违冲能技力差办，饱段和溶居液的pH值在4.意5～5.谣5之间饰，使航用时监多用虽浓氨骗水调纺整到pH反7左右递。进产行盐漫析时幼的pH，要野选择天在被届盐析营的蛋顽白质辽的pI附近温度炎的影廉响在高缘瑞盐浓蔑度下价，它且们的熔溶解等度随翁温度参的升撑高反鸦而降引低。其另外俯，高阻温还创易导蹄致蛋茄白质克变性惯。蛋永白质兰的盐哑析一尝般在悼室温妻下进条行。注意殿事项年：添加这固体音时，脂要加兔粉末陆状的胳盐并且颗缓慢驾分批醒添加并缓情缓搅户拌，训避免半局部冲浓度云过高且注浪意不沉要产什生泡州沫2、有科机溶淡剂沉脸淀有机胀溶剂究对于质许多妹蛋白胁质（兼酶）爷、核荐酸、兴多糖功和小额分子座生化罚物质肚都能缝发生掌沉淀灾作用查，是构较早亲使用勤的沉页淀方去法之冒一。有机粱溶剂晶之所稳以能吗使酶裕沉淀华析出妈。主远要是播由于怖有机尺溶剂港的存药在会绣使溶薪液的丝式介电恒常数挣降低骄。例两如，20勺℃时水支的介飞电常踢数为80，而82％乙窑醇水益溶液怖的介王电常注数为40。溶液畅的介病电常脑数降目低，蚊就使骂溶质闲分子季间的顿静电丛引力裙增大忧，互猾相吸莫引而谋易于洁凝集脸，同刻时，炭对于鞋具有点水膜摘的分毕子来彩说，捷有机页溶剂蛮与水腹互相繁作用缝，使旁溶质沟分子殿表面军的水六膜破衬坏，焦也使幼其溶坝解度掏降低鞭而沉拿淀析熔出。常用随于酶勤的沉就淀分蚊离的勒有机借溶剂吸有乙首醇、归丙酮柴、异疤丙醇殃、甲粪醇等基本框原理有机失溶剂建沉淀斑主要趟是降低龟水溶傍液的体介电付常数，减尚小溶绣剂的洞极性加，削等弱溶冻剂分修子与搜蛋白茄质分质子间场的相适互作培用力判，增右加了乞蛋白贞质分仇子间密的相傍互作泽用，滨导致把蛋白渐质溶拢解度井降低奖而沉肢淀。由于减使用追的有面机溶骆剂与芽水互禽溶，渗它们园在溶买解于初水的侮同时艘从蛋朝白质秤分子偿周围店的水骄化层活中夺冤走了搬水分葡子，破坏壮了蛋业白质刻分子妈的水耻膜，因坚而发泽生沉锤淀作霉用溶液惑介电悠常数壳的减疫少就圆意味夏着溶渣质分裙子异膀性电航荷库挠仑引拴力的趴增加头，使带电摇溶质待分子圣更易巡寿互相皱吸引恋而凝街集，从贤而发今生沉溉淀。优点俱：①分辨窄能力晓比盐舅析法吧高，眠即一叉种蛋断白质裹或其趟他溶班质孙只在近一个辞比较弄窄的积有机理溶剂膏浓度贪范围成内沉砌淀。②沉淀纠不用宾脱盐械，过宾滤比号较容鸦易（末如有蚁必要期，可错用透超析袋兆脱有继机溶系剂）躺。缺点馆：对津某些所具有遵生物某活性冰的大押分子盯容易寇引起圈变性哥失活特，操撇作需雀在低竟温下粱进行刷。3、选卫择性名变性术沉淀配法利用墙蛋白传质、术酶与吧核酸族等生绣物大桶分子越与非鞋目的泉生物释大分夕子在物理轻化学亭性质等方疗面的段差异版，选御择一精定的勤条件缎使杂固蛋白洋等非目器的物榨变性哪沉淀而得动到分豪离提事纯，融称为摄选择医性变押性沉斜淀法唯。方法剂：加脱热、贺大幅扁度改奖变pH，加默有机启溶剂食（丙言酮、冤乙醇商等）艰、加慎重金英属离旬子如Ag+、Cu2＋、Pb2＋等、递加有俯机酸梳如三堵氯乙源酸、舍水杨诸酸、狐苦味军酸、摘鞣酸穿、过菌氯酸需等及吃表面梅活性妇剂。4、等摸电点脖沉淀携法等电错点沉末淀法光是利傍用具惜有不引同等缘瑞电点请的两成性电拔解质蔑，在摄达到惑电中陕性时尿溶解释度最差低，帅易发梨生沉焦淀，扎从而算实现枝分离慰的方谢法。此法棚主要谷用于可在分超离纯镇化流百程中斩去除弦杂蛋削白，景而不偷用于脚沉淀爹目的福物氨基初酸、隆蛋白窃质、等酶和蹄核酸捉都是候两性岔电解牛质由于芝许多雾蛋白喉质的眯等电亲点十富分接签近，扇而且荐带有对水膜瓣的蛋哄白质软等生惕物大差分子用仍有仗一定缎的溶德解度参，不世能完锻全沉敬淀析给出，店因此姿，单辟独使涉用此涨法分扛辨率赠较低璃，效捎果不策理想因而脾此法寻常与画盐析下法、绳有机塑溶剂皮沉淀匪法或估其他颠沉淀柴剂一耳起配灾合使纳用，覆以提坝高沉那淀能睁力和是分离慰效果熟。5、静有机江聚合王物沉暗淀法有机夺聚合东物是纤六十裹年代杂发展絮起来哲的一裳类重筛要的筋沉淀疲剂，党最早臂应用蠢于提咽纯免嫁疫球私蛋白划和沉棉淀一镜些细识菌和本病毒殃。近关年来培广泛惯用于墨核酸锦和酶园的纯援化。应用珍最多革的是次聚乙闸二醇(P溉EG驶)，它城的亲粪水性拖强，甚溶干窑水和系许多沸有机停溶剂河，对近热稳鸦定，牵有广氧泛围凯的分钻子量法，在勺生物勒大分韵子制某备中谜，用欺的较休多的水是分状子量搏为60灿00～20伯00拌0的PE孔G。作弱用机最制不蛮明。优点脆：①操作泥条件忧温和川，不索易引烂起生闭物大毛分子暂变性胁。②沉淀铸效能羊高，半使用苦很少眯量的PE姑G即可软以沉诱淀相专当多朋的生每物大煌分子剂。③沉淀板后有赌机聚方合物右容易狗去除秃。（二速）透析利用嘱透析例袋把挺大分惭子蛋缎白质托与小执分子滚化合权物分军开的警方法究。袋内狡：大醋分子赤量的妄生物垄大分骄子袋外咽：盐末和小帮分子鞭物质不断敌扩散闪透析诵到，枯直到纷袋内购外两随边的热浓度魔达到忌平衡该为止弯。（三倚）过滤过滤惊的分鹅类及姜其特男性(根据搂过滤然介质茶截留绞的物欧质颗守粒大禁小不恰同)类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜四种厅常用序膜分侵离过属程的领截留咳特性超滤超过喜滤即委超滤删，超袭滤是斯一种肃加压道膜分按离技范术，族即在哀一定既的压询力下击，使钱小分套子溶明质和宏溶剂泳穿过娃一定滋孔径顶的特乎制的蛮薄膜宣，而欲使大公分子邀溶质钥不能味透过凭，留校在膜麻的一弄边，扣从而岸使大表分子她物质所得到望了部支分的贩纯化念。加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液优点音：操作辟简便陆，成巾本低司廉，怨不需勾增加世任何住化学驰试剂段，尤暑其是还超滤病技术锋的实担验条债件温辱和，卵与蒸华发、沾冰冻矛干燥恶相比妙没有易相的世变化洁，而得且不摆引起可温度庆、pH的变承化，占因而圣可以臣防止唤生物杰大分柏子的奏变性澡、失滤活和骑自溶尤。缺点统：不能鼻直接尖得到洗干粉携制剂隶。对慌于蛋梢白质罪溶液唤，一漂般只限能得之到10～50％的瞎浓度牵。超滤仁技术污的关们键是膜。在生烈物大块分子膊的制傻备技桌术中蜡，超籍滤主松要用钻于生享物大老分子鸟的脱纷盐、姨脱水滥和浓芝缩等慕。（四单）电余泳电泳揉是指殿在电约场的初作用腹下，师这些掀带电龄颗粒羽向着扛与其棚所带御电荷胆性质诞相反袖的电柳极方偷向移锡动。电泳芦技术外就是劲利用疏在电多场的歼作用犹下，局由于扁待分轧离样尤品中号各种阅分子止带电蹲性质筹以及椅分子击本身销大小矩、形浅状等贸性质展的差百异，旧使带黑电分闪子产校生不矩同的队迁移煤速度祝，从绣而对援样品中进行遗分离撞、鉴火定或皱提纯乒的技昂术。琼脂搂糖凝间胶电近泳和叉聚丙展烯酰肚胺凝应胶电桃泳。琼脂炒糖凝唉胶电禽泳聚丙点烯酰坡胺凝务胶电耍泳1、聚寄丙烯按酰胺偏凝胶涂电泳群（PA鹿GE静)聚丙知烯酰映胺凝束胶电农泳简兔称为PA尿GE（Po吓ly炼ac渴ry逃la损mi茂dege陵l丧el扔ec匀tr码op倘ho药re傲si贱s），关是以锹聚丙棵烯酰弦胺凝绕胶作悠为支咏持介丑质。悉聚丙肾烯酰置胺凝车胶是睁由单填体的恐丙烯蜓酰胺缝和甲命叉双职丙烯付酰胺反聚合目而成粪，这殖一聚奋合过船程需光要有立自由江基催孟化完叹成。SD铲S－聚磨丙烯窗酰胺序凝胶前电泳牢（SD队S－PA侵GE）SD熄S(十二节烷基处磺酸要钠)-啄-阴离诵子表罪面活盾性剂盼即去煎污剂仅，它诊可以梦断开挠分子婶内和想分子栋间的竭氢键晨，破塞坏蛋秧白质丢分子君的二歼级和银三级危结构秆，使斥蛋白量质舒爷展。冈并且迈每2个氨启基酸期与一苹个SD写S结合恶，使得飘每个箩蛋白抢质分初子所杰带电饶荷基悲本相绕同。这样女就消叮除了锄各种柔蛋白然质本豆身电苗荷上志的差晒异，电泳董迁移涛率只烟与蛋揭白质遵分子扔量大悟小有均关制备虏式电渐泳通庙常以规不含SD罗S的原推态di运sc多-P迷AG绢E进行羡，以枝便回等收具包有活闯性的宿蛋白纲质；苦蛋白宝质样济本要顿先经旗过部堆分纯鉴化，扒否则朵效果例不佳巧，并器先以歉分析齿式电晴泳确戚定所融要色混帶的港位置绣。有几桌个方观法可救以鉴誉定蛋大白质交的位则置：(1斤)Co烫om序as依si改eBl找ue染色车法;朋(2惯)活性耽染色;弓(3跟)完UV照射倒呈像悠。定卷位后敌要把广含有差目标架酶的郑凝胶镰切出胁來，桨进行样电泳查分离疗，获萌得酶（五滋）离浴心离心计技术植主要扒用于属各种散生物浓样品悉的分之离和鼻制备窜，生例物样肌品悬奋浮液屈在高幅速旋籍转下宪，由傻于巨垄大的佩离心庙力作才用，备使悬住浮的勉微小林颗粒炭（细轿胞器后、生玩物大茂分子贴的沉更淀等色）以乓一定露的速饱度沉腰降，木从而裹与溶时液得鱼以分嫁离，税而沉任降速丛度取皂决于踏颗粒卸的质温量、率大小竿和密阴度。密度前梯度五区带疯离心仍法（难简称眠区带聚离心点法）差速约离心俊法（六徐）层陶析层析洽法又睬称色窄谱法郊（Ch刻ro有ma研to轧gr问ap漆hy），帐是一签种基苏于被糠分离你物质广的物薄理、剩化学家及生咱物学啊特性菜的不年同，恐使各肚组分忽以不怨同程仔度分甲布在浊两个岛相中古，其母中一绘个相啊为固罩定的(称为琴固定言相)，另说一个悦相则偏流过淋此固彼定相(称为侮流动吨相)并使衰各组尼分以趟不同剖速度士移动传，从限而达桑到分教离。层析讽分离咸方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离离子偿交换厚层析凝胶匠渗透逗层析亲和粥层析--利用竹生物刻分子菊与配议基之郑间所榆具有杀的专链一而烤又可涨逆的伏亲和离力，弊而使夜生物该分子馆分离升纯化赖的技笑术酶与享底物酶与非竞争篇性抑疫制剂酶与留辅助嘴因子抗原彼与抗趁体酶RN炎A与互黄补的RN态A分子厌或片汽段RN优A与互锹补的DN横A分子删或片猴段（七着）浓圆缩、筹干燥胁和结帜晶浓缩颗：低寇浓度高浓男度离心水、沉芝淀、意吸水窗剂（PE陡G、硅前胶等泊）蒸发歪浓缩尿：通冷过加日热或苗者减毫压方博法，吃使得岔溶液汽中部呆分溶锻剂汽距化蒸海发，萝常采拾用真谱空浓群缩。酶高庸温失傅活，一般技在60瘦℃以下，真咬空条眯件下铃进行被浓缩食或干见燥——真空勉干燥散，另栋外还约有冷村冻干粗燥、侧喷雾痕干燥闷、吸逝附干徐燥、搬气流刚干燥洋等。冷冻际干燥将酶茫液降猾温到定冰点饥以下迟，使见之冻韵结成培固态健，然飘后在标低温柳状态挂抽真缴空，口使冰弦升华孝，得捧到干双燥的福酶制卧剂酶质攀量高吧，结蒸构完筒整，描活力兆损失娃少，候但是隆成本烧高，春适合菜对热够敏感地而价女值较茧高的沉酶类结晶结晶插与沉限淀的另区别沉淀锡和结忧晶在羡本质努上同霉属一雁种过佳程，付都是拘新相肉析出寻的过竞程。广两者田的区希别在汗于构辰成单宇位（吗原子筑、离伪子或骑分子跳）的步排列愉方式到不同在条沫件变庸化缓各慢时赌，溶拜质分耽子具灵有足炭够时隶间进污行排料列，司有利寒于结怕晶形鲁成；于相反术，当贴条件亦变化的剧烈市，强耐迫快霸速析慈出，耀溶质挥分子历来不搁及排思列就驻析出泡，结扫果形哄成无浮定形壤沉淀蚊。由于泄只有悔同类呼分子们或离际子才湿能排县列成头晶体认，故赖结晶责法具异有高扭度的派选择岂性。酶在忠结晶册之前鉴，酶液蛛必须她经过越纯化涛达到筛一定衫的纯疾度。总饲的趋违势是因酶的谢纯度测越高秤，越炕容易毁进行脊结晶默。如与果酶伴液纯厘度太超低，煌不能技进行熊结晶冬。通常还酶的俭纯度艳应当围在50缴%以上辟，方价能进辣行结增晶。不同炭的酶棉对结盒晶时田的纯许度要蹲求不谈同。有些搬酶在势纯度鞋达到50军%时就眨可能恨结晶扔，而抢有些绸酶在搭纯度竭很高冬的条弯件下叠也无盛法析祖出结杯晶。桐所以迅酶的枣结晶碗并非蛋达到呈绝对骄纯化刺，只并是达然到相走当的久纯度献而已觉。常用斜方法盾：盐劳析结桨晶、见有机挠溶剂挑结晶僵、透杆析平妇衡结丑晶、双等电永点结炉晶等吃。三、航分离险纯化久方法阅的选课择及衬基本扁步骤生物城大分景子能突否高闪效率横地制蓄备成叔功，额关键牢在于么分离乎纯化隔方案籍的正压确选狂择和雹各个莫分离婶纯化绑方法潮实验眨条件纱的探视索。犁选择纤与探角索的河依据邮就是找生物圣大分肆子与纪杂质什之间吊的生起物学屡和物共理化规学性烈质上霉的差洋异。毙由本蝇章前工述的登生物塞大分愉子制崖备的浓各种用特点涉可以振看出头，分离僻纯化稼方案晓必然困是千婶变万京化的前处理：粗分离：细分级：结晶：生物组织破碎、溶解、离心分离无细胞提取液盐析、等电点沉淀、超滤、有机溶剂分级层析、电泳精制品结晶或者冻干四、损分离滩提纯戏操作指要求尽量率减少长酶活奸性的中损失低温0～5℃、有哨机溶钻剂：-1猛5～-2店0℃抽提坟液加决入ED与TA（络转合金普属）抽提惧液加龙入巯王基乙杀醇（次防止惰含-S之H酶失窝活）不能疑过度失搅拌犯，以遇免产吵生大夜量泡期沫，马使酶罩变性pH值和气盐浓灾度的饰控制抗菌咽、抑舍菌测定记酶的万比活溉力⑴早期袍分离铺纯化特点幸：①粗提忠取液欧中物优质成练份十考分复裂杂。②欲制嗓备的配生物抗大分核子浓是度很犯稀。③物理晚化学畅性质债相近烂的物贼质很帮多。④希望锦能除锁去大廉部分糟与目讽的产哲物物砍理化指学性撇质差制异大冤的杂量质。对所开选方介法的田要求供：①要快轰速、珠粗放征。②能较遥大地拥缩小索体积孤。③分辨驶力不照必太兄高。④负荷刮能力猜要大万。可选弟用的碗方法天：吸附再；萃慨取；瘦沉淀顷法（时热变勉性、械盐析仪、有彩机溶距剂沉贫淀等值）；敲离子碰交换系（批旷量吸衣附）胃；亲是和层亡析等替。⑵晚期皆分离猪纯化可选民用的腐方法异：吸骑附层捡析、准盐析读、凝似胶过啄滤、妙离子躲交换升层析盲、亲炎和层奔析、歪等电籍聚焦兔制备吵电泳佛、制棚备HP肃LC等。注意献的问盘题：①盐析酒后要洁及时果脱盐嫩。②用凝芒胶过吗滤时横如何疼缩小来上样贵体积欧，因畏为凝她胶层暴析柱座的上资样体醋积只扒能是沃柱床愧体积左的1/路10～1/晕6，也些可以浅使用川串联锣柱以帮加大淡柱床掘体积族。③必要舒时也袜可以垂重复饱使用钢同一返种分为离纯厅化方宾法，毁例如零分级笼有机少溶剂蒸沉淀仓，分唇级盐臣析，已连续决两次部凝胶宏过滤捏或离改子交表换层核析等衰。④分离缝纯化莲步骤歉前后五要有投科学宋的安驱排和券衔接樱，尽退可能壮减少鼠工序糊，提输高效日率。句例如掠吸附哗不可舱以放冰在盐堂析之佩后，维以免陵大量涌盐离拖子影瓦响吸摇附效脉率；好离子米交换伏要放纳在凝里胶过链滤之无前，稿因为缘瑞离子趋交换胞层析即的上宴样量咽可以尖不受北限制界，只央要不端超过堡柱交色换容黑量即帅可。⑤分离窄纯化仰后期性，目绑的产昂物的但纯度显和浓奸度都锤大大辈提高黑，此型时对肯于很遍多敏碎感的巨酶极删易变会性失谢活，恼因此间操作路步骤却要连续眨、紧肯凑，尽亮可能孤在低雷温下育（如伐在冷赏室中河）进火行。⑥得到宵最终滨产品饲后，届必要则时要针立即骡冰冻挂干燥亏，分份装并善写明业标签愿，－20绘℃或－70辈℃保存五、咐酶的张活力刮测定劲与纯晨度测乒定1.酶的春活力桑测定饿与比怨活性——评价蛛提纯歪方法会好坏漏的指顷标总活修力的蔬回收化率反映照提纯旨过程妻中酶姨活力姓的损由失情农况比活漠力提赖高的晃倍数反映科纯化否的效妨率在酶压纯化接的每矛个阶鉴段，拼都需职要进然行上悔述测义定两者堤合理杨安排忙，但同通常葱不可耻兼顾闷，根责据具撤体情晓况取店舍。2.纯度然鉴定锈：方法振很多泻，检快验是乳否还拾有继殿续纯抛化的投必要由于规酶分部子高坑度复封杂，完不同叔方法身检验拖出的监结果袭可能些不同酶纯袭度要据注明订：电朴泳纯佛、层籍析纯辜、HP缩慧LC纯。鉴定惨依据痛：酶分饮子的辜大小仆、形贴状：林超速甩离心得法、戒凝胶丙层析帅等酶分蜂子的骗电荷爷性质溉：离揉子交查换层哪析、孩电泳仗等酶分知子的赚化学西性质炎：一哲级结慰构测基