第二章基因工程制药新

第三节基因工程制药生产的基本过程一、工具酶的分离纯化二、载体的分离纯化三、外源DNA和目的基因的分离和获得四、外源DNA与载体DNA的切割与连接五、宿主细胞的选择和基因导入操作六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点七、基因工程菌中试八、基因工程菌的扩增和发酵生产九、基因工程药物的分离和纯化技术十、变性蛋白的复性十一、基因工程药物的质量控制十二、基因工程药物的制造实例血红蛋白基因血红蛋白基因排列顺序血红蛋白的结构血红蛋白的运送氧气功能血红蛋白的基因工程流程一、工具酶的分离纯化（一）基因工程制药所用到的工具酶

（二）关于限制酶（三）关于连接酶

（一）基因工程制药所用到的工具酶限制性内切酶 甲基化酶Klenow聚合酶

T4-DNA聚合酶T4-多核苷酸激酶 碱性磷酸酶核酸酶-S1 核酸酶-Bal31绿豆核酸酶 核糖核酸酶人外切核酸酶 DNA酶-1外切RNA酶-III 外切RNA酶-VIDNA聚合酶1

T4-DNA连接酶末端脱氧核苷酸转移酶 T4-RNA连接酶逆转录酶大肠杆菌-DNA连接酶

（二）关于限制酶1、宿主限制现象2、限制酶的定义3、限制酶的特征4、限制酶的作用5、基因工程所用到的限制酶6、影响限制酶作用的因素

1、宿主限制现象

病毒或噬菌体在宿主A细胞中生长良好,但在宿主B细胞中生长很差,原因是它的DNA受到宿主B的限制,这种现象是宿主控制性限制（restriction）与修饰(modification),简称（R/M体系）。细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。R/M体系：是由两种酶活性配合完成的：一种是修饰的甲基转移酶另一种是核酸内切限制酶E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶※当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。

※EcoB(大肠杆菌B株)的核酸酶不能识别已甲基化的序列。

R/M体系的作用：保护自身的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解TGAN8TGCTACTN8ACGATGAN8TGCTACTN8ACGAECOB核酸酶甲基化酶CH3CH3CH3CH3噬菌体来源序列宿主来源序列※限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源ＤＮＡ的一类酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。※由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。2、限制酶的定义

凡是能够识别和切割DNA分子内特定核苷酸顺序的酶称为限制酶。限制酶分为三个类型：（1）Ⅰ型限制酶-----由于其切点不固定，很难形成特异性的切割末端。（2）Ⅱ型限制酶-----是位点特异性酶，是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型限制酶-----对DNA的识别与切割点不同，不产生特异性DNA片段。3、限制酶的特征

具有专一性的识别位点。能够形成固定的核苷酸单链末端。比较适合于进行DNA结构的分析和进行基因重组。4、限制酶的作用（1）进行DNA重组。（2）构建新载体。（3）构建基因文库。（4）进行DNA序列分析。（5）制备DNA放射性探针。5、基因工程所用到的限制酶通常是Ⅱ型限制酶，具体有以下几种。EcoR-I

Hind-III

BamH-IPst-I Sst-I Sal-IAva-I Bcl-I Hind-IIHpa-I Bgl-II Cla-IHae-III Hha-I Hinf-IHpa-II Mbo-I Sma-IXba-I

Xho-I6、影响限制酶作用的因素（1）DNA的纯度（2）DNA的甲基化程度（3）DNA的结构（4）反应的温度----最适温度为37度（5）反应的缓冲体系----反应体系中通常含有MgCl2、NaCl、KCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、牛血清白蛋白。它们具有激活酶、稳定酶的作用。（三疲）关扫于连奖接酶1、定货义--掌--凡是苍能够筛催化DN错A片段5’-末端阶的磷播酰基与3’-末端避的羟梢基结合休成磷酸馆二酯貌键的酶骗，称狠为连恢接酶识。2、作朽用--阅--主要起用于进（1）正挡常DN搁A的合裁成。盒（2）损滤伤DN阿A的修厚复。3、种库类皇（1）DN雄A-连接笋酶--热--广泛尝存在言于生引物细别胞之秆中，耕主要蚁取自胞于大则肠杆甘菌E.多co侧li。拖（2）T4惧-D坛NA连接安酶--扑--来自痛于经稍过T4符-噬菌驰体感琴染的聋大肠骂杆菌E.窑co肢li。（3钞T4蜂-R音NA连接替酶--颤--催化买单链DN屿A或RN肿A的5‘磷酸值与另握一单念链DN厕A或RN瞧A的3’羟基伤之间尊形成尸共价鉴连接蒸。二、液基因戴工程房诚载体托的分视离纯荒化（一猜）定姓义（二际）基壶因工添程载唯体的桌必备肃条件（三也）基勇因工赖程载送体的蔑种类（一匙）定保义能够路将目污的基堵因携带进宿异主细宇胞、厨并可物使得回目的心基因肢能够御在宿臭主体迈内进隶行自主汗性复川制的遗讲传因榜子，输称为御基因跑工程鹊载体借。（二读）基教因工妈程载筐体的世必备循条件（1）具死有有眠效运载能力清。寸（2）载彻体自嗓身能股够独立唯复制，并通且在佛宿主诉体内呼进垂行饿自主弹性复巩制。打（3）载丙体在蕉携带西目的豪基因错之后赤，还机能够触在宿制主体谨内进饶行自主史性复逮制。侵（4）在障宿主雾体内率，能递够控呆制外刑源基谱因的肉表达就活动排。撑（5）能妨够携惰带大色小不简同的愤外源胳性目涨的基潜因。坡（6）鉴由定方谈便、各装卸雷技术烘简单谢。劲（7）容隶易控更制、签安全狭可靠常。（8）应到具有挪灵活学的克隆鹅位点、并掠且有找方便别的筛选帽标记。祸（9）应羊具有免很强欺的启动里子。拣（10）应鸟具有阻遏碍子，使趋启动浴子受废到控妇制，姑因为什外源撇基因凝的高狐效表患达会熊抑制判宿主置细胞渗的生掀长、沫增殖怕，而集阻遏抱子可牙使宿锹主细馒胞免咸受这钥种影唐响。煎（11）应驶具有肢很强秒的终止镇子，以玩便重睬点克所隆外守源基写因区尽段，蜻而不朴转录摸其它屈无关例基因款。勺（12）所潮产生里的mR篇NA必须锅具有租翻译椅的起鞋始信兄号，现即含勇有起勾始密醉码AU遣G和SD序列掠，以严便转奇录之走后能俩够顺饼利于答进行决翻译炕。（三搞）基捞因工熟程载现体的专种类1、细昼菌质纺粒2、真蜓核基根因病羊毒DN陆A3、λ噬菌太体DN猪A4、单律链DN是A噬菌阵体M1胳3载体5、人令工质鸡粒载克体--衡--科斯钳质粒6、酵母人工鸽染色痒体7、其密他载衔体1、细涝菌质缸粒（1）质前粒的悉定义（2）质剪粒的饮特性（3）质第粒的践分类（4）质精粒载务体的施具备距条件（5）常桌用的冬细菌辅质粒（1）质池粒的歉定义存在展于天予然细吼菌体今内的骆一种睬独立谋于细袖菌染销色体城之外锄的双链稍环状DN脉A，具弱有独立酬复制的能辉力，述常带择有细谣菌的抗药障基因。也缸存在稀于某运些真劫核细皮胞（酵母啦的2μ环状吐质粒）质粒粥载体(p废la翼sm列id中)（2）质集粒的甩特性独立吐于细陆菌染潮色体虑之外顺的环状DN轰A或RN谎A。其遗狡传特构性属沿于非染昂色体庸控制。能够膝进行自我俯复制。容易别在宿扛主体勇内进枣行转移貌和迁牧移。可编刃码宿匹主染花色体戴所不督具有环的基牛因。要能够惠赋予新宿主踏额外据的遗翅传特观性：A、编俩码产孩生抗生驱素酶的抗道性基帽因，B、编傻码产技生糖酵逃解酶描系的基伍因，C、编善码产滑生抗重伐金属流酶的抗蹦性基编因。质粒葬的复权制类共型◆严谨泄型（st卸ri奏ge啄nt跳p爸la户sm平id库)：复制旁与宿闲主染翁色体踢同步骨受宿两主染牢色体电复制珍的限条制，博在宿慌主细孝胞中督拷贝怠数低导约１～抵３份莲拷贝。◆松弛坝型（re支la愈xe高d赌pl粘as筑mi压d)锦:复制尸不受个宿主酱染色牛体复石制的限制章可独周立复然制，毅在宿超主细棋胞中址拷贝数的高，躲宿主润细胞械中质起粒有10共-2我00拷贝。基因茧工程且常用召载体。质粒DN康A的构烫型三种惰不同袖的构恐型：当其接两条猫核苷怀酸链宜均保鸭持着出完整犁的环闷形结齐构时加，称嫂为共价顽闭合辜环形DN腰A(源cc黑cD傍NA地)，这组样的DN艰A通常室呈现悲超螺闪旋的SC构型面；如果是两条浊多核郑苷酸默链中锡只有患一条骆保持阳着完虏整的替环形菌结构词，另唐一条暖链出氧现有母一至彼数个廊缺口掏时，酬称之则为开环DN舟A(咏oc昏DN稠A)；若质惹粒DN甲A的双韵链均飞发生捕断裂至而形衫成线粒形分装子，缓则通当称为L构型。单链切割连接单链切割连接共价丈闭合提环形DN悦A（SC型）开环DN喉A（oc型）线性DN旋A（L型）环形袖双链碍的质叫粒DN脉A分子彩具有煌三种舅不同驾构型（3）质功粒的瘦分类F质粒--甜--可使优宿主A的部盖分基牺因随菜着F质粒糖一起芒转移脂到不师存在闭该质天粒的膏另一冒宿主B的体谜内。R质粒--消--可编版码宿主A的一幅种或李者数似种抗惹生素杂抗性困基因著，并刘能够宰将它棍们带到不存彻在该咸质粒恭的另姥一宿主B的体坦内，潮使得富宿主B也获吨得同芳样的务抗性灾。Co扶l质粒--番--能编研码大肠板杆菌捕毒素桨基因，通叫过表叼达之娘后产染生的命大肠伟杆菌身毒素慕可以闹使得闭不带Co具l质粒袄的其寄它菌毅株死搏亡。（4）质区粒载赢体具殃备条他件质粒雪载体贯，也挖称质至粒克孩隆载玩体，未是指休用于齐实现允基因捕工程影操作最的质末粒。踢必须牙具备阳以下欲条件纤：（1）其肠分子胞结构帽中必戴须具译有多稀个单蹄一限制侦酶的燥切割赶位点。（2）构挪建重歇组质锯粒之暂后必慎须具租有转化据功能。（3）分光子量愿较小缴，易再于操辨作。（4）宿窃主范尼围较批为单取一、馆无感鸟染性援。（5）常发用的扭细菌里质粒pB捆R3载22罩p晌BH图10觉pB俭H2上0pT猾R2扁62狠p处AT授15厅3迁p往Xf痕3Pm固k1树6费pG泽EM蚀-3梨Z扎p恼UC瓣19[A尚]、pB掏R3汽22质粒[B布]、pU委C1妈9质粒[C皆]、pG缩慧EM斑-3叙Z质粒[A痕]、pB胁R3晚22质粒①丹4巴36达3辰bp②含一绢个复史制点含一似个抗掘氨卞网青霉筑素基桥因(am辩pR)④一个伞抗四棵环素高基因(te衰tR)⑤am住pR和te喇tR抗性男基因独内各猎有一盘些限织制酶备的酶律切位杜点，棋供外辣源基讯因插竹入当外都源基咽因插友入抗绕药基匀因内们，抗场药基龄因失队活。Am僻pR→A记mp敏感(Am斤pS)、Te肉tR→T守et敏感(Te层tS).pB魂R3释22胳:人工虹构建咐重要克质粒优点断：具互有较共小的血分子造量．具有碗两种毙抗生钩素抗叫性基沸因，棚作为悠筛选竞标记扔．具有回高拷抬贝数新．是松企弛型舒质粒铜．[B悬]、pU乡丰C系列平质粒由pB种R3躁22和M1院3噬菌旬体构扭建而酸成的轻双链闹质粒柳载体欠；（1）26哥74朱bp；（2）却有am激pR和位蛙于la礼cZ补+基因滨中靠解近5’端多绢克隆州位点(M歉CS墨)和来源利于pB徐R3眯22质粒呆的复澡制起奔始点（3）大环肠杆我菌β-半乳咬糖苷秩酶(l委ac夏Z)的启及动子挑及其章编码迹该基穴因氨烟基端α-肽链毛的DN司A序列,此结辰构特乏称为la非cZ河+基因拦，便于花蓝白糠筛选pU霸C质粒触优点昆：１．直具有矮更小挨的分俭子，斧更高范的拷岂数２．右适于范组织坝化学蜜检测湾重组湖体．[C案]、pG签EM耕-3汇Z质粒含一龟个am课pR基因抽和一头个la断cZ’编码线基因;有多抖克隆耗位点染（MC跪S）;正选枝择颜沿色标渔记la需cZ’;有两炼个来娃自噬袍菌体氏的强新启动片子PT7和PSP翁6,用于翁外源田基因告的高馆效表猴达注意食：T7和SP拿6启动礼子特辟异性更地由巡寿噬菌辟体DN音A编码架的RN蚀A聚合技酶所留识别抢，因倦此相这应的裙受体导菌必堆须表每达噬坦菌体RN封A聚合把酶，如：E.童co凯liBL视21（DE躲3）等27北43秃b尘pMC伐Sla下cZ烧’PT7or德iAprpG异EM区-3屋ZPSP奖62、真音核基别因病乞毒DN宝A（1）病熟毒载荒体的跳优点（2）已夹经研猎究的逗真核有基因盘病毒DN组A（1）病岗毒载皮体的启优点[A愚]、具恐有很嘉高的渔拷贝爸数量嚷。[B蔬]、有赏强大给的启皱动子愿。[C喊]、可逢保证器目的惊基因踪蝶的高赴效表蹈达。（2）已行经研匀究的帅真核沉基因欠病毒DN趋A[A氧]、SV绑40病毒DN滑A[B昌]、牛智乳头土瘤病卖毒[C女]、RN疤A病毒[D扩]、昆备虫杆些状病展毒[E刻]、人雅痘病便毒DN池A[F编]、猴空钱泡病甘毒DN乌A[G愿]、人腺闯病毒DN温A[H涉]、人牛顿痘病勺毒DN跳A[泻I屑]、逆转嘴录病析毒载筝体[A颜]、SV贩40病毒DN声A（A1）、SV吐40病毒DN树A的特清性（A2）、SV瞧40病毒DN滔A的基佣因组（A3）、SV很40病毒DN士A载体锅的构喝建（A4）、SV禾40病毒DN透A载体谷的使愚用方牛法（A1）、SV资40病毒DN彻A的特河性为环状丈双螺棉旋结构蹦。其叉宿主雁为动棕物细厌胞。SV台40病毒洪有二熊种表渣达方钩式：某（1）游躺离表惩达方垒式，SV琴40肌DN销A+外源守性DN靠A，形胀成重河组DN传A，进乐入宿魄主体柳内，参以重留组DN秤A的方扑式表摔达。碧（2）结业合表疤达方鸟式，绑重组DN液A整合到宿椅主染指色体暑的DN魔A之中藏，与雅染色欢体基竞因一着起表口达。（A2）、SV夕40病毒DN时A的基篇因组（A3）、SV辆40病毒DN贷A载体甲的构比建（A4）、SV爽40病毒DN岁A载体辉的使晒用方蕉法[G探]、腺倒病毒（G1凑）、腺病风毒DN刑A载体（G2撤）、腺病丈毒DN堪A载体揭的特轮点3、λ噬菌姿体DN恼A（1）λ噬菌艰体DN膏A的特骗性（2）λ噬菌幅体DN逆A的改朝造（3）λ噬菌蹦体DN藏A的体汤外包亩装（4）λ噬菌卵体载铃体的丈构建（5）λ噬菌尝体载兽体的广使用（6）λ噬菌便体载崇体的吧优点（1）λ噬菌恢体DN界A的特停性λ噬菌俯体DN悉A为双链魄的DN香A病毒，宿方主是投大肠寺杆菌甩。已发似现λ噬菌照体DN智A可编红码61个基丛因。[A屑]、λ噬菌铅体DN肃A在宿课主体赔内的乡丰生活缴方式[B伪]、λ噬菌岔体DN熔A的结习构[A还]、λ噬菌告体DN悼A在宿欲主体抓内的覆生活拿方式（1）溶解源方菌式：λ噬菌臂体DN谎A整合膛到大宣肠杆算菌的DN裹A中，惩伴随核大肠喂杆菌DN事A的复茎制而笛复制序，这锦种方项式是λ噬菌项体DN爸A作为堪基因碧工程有载体熄的理吸论依口据。（2）溶钩菌方乳式：λ噬菌横体感刻染大由肠杆誉菌后穷，终肥止了士大肠消杆菌温染色敏体DN砍A所控拾制的觉遗传顿信息寸表达泄，并思进一园步分绣解大翠肠杆恐菌DN柴A，最删后导拣致大茎肠杆语菌完士全溶善解。[B绳]、λ噬菌歉体DN佳A的结蛮构λ噬菌敞体基锦因组基因规组长还度：耀约为50精kb的双箩链DN总A分子队，实凶际大额小为48絮50意2b暗p。DN骡A是线物状双巩链分然子带萝有单粱链的尾互补捞末端愧，末帖端长12个核才苷酸切，称嚷为粘贼性末根端（co炮s序列）。搏当噬垄菌体厅感染无宿主凯细胞奴后，粉双链DN斯A分子型通过co艺s而成被环状愚。61个基吗因，夹每个娘基因尸平均弱为10逼00记bp，其辉中32个较振为重涉要，羽它们卫的分芬布和吧排列厚与其朴功能鸦有一吨定关想系。基因弹组分期为二需部分均：栋（1）其休中一竿半基机因，滨控制蜡着生织命活剑动周信期。纸（2）另籍一半侵基因井，可冶被外仿源性孙目的娘基因伴所取烤代，而不御影响酬噬菌今体的剧生命窜活动蛋。基因往组分湾为几蒸个不摧连续馆的区恰域，捡三个聋片段罗组成帖：（1）左抗臂，19争.6榜kb，含尖噬菌泼体头融、尾思蛋白苹质编堵码基必因，A～J的12基因昼都是势构成尊外壳督蛋白能的基瓶因。（2）中墓央片长段，12甚kb～24妇kb，含PL控制re姿d和ga猴m基因傻。（3）右胡臂，9k池b～11颗kb，含λD友NA复制司和溶刚菌有霜关蛋善白编买码基罗因。您与裂牲解有全关的S和R基因局、与DN缎A复制移有关较的O基因稼和P基因套等分岭别聚兽集在贪一起挎。噬菌惩体左滥右两禁臂包催含了λ复制镰和成烤熟所赠必须谅的全且部机乳能蛋庙白编况码，回而中央字片段丸为非进必需谜区，即弓位于J基因永和N基因拿之间度的片脑段可满被其判他大皇肠杆催菌DN责A片段弯所替析换。λ噬菌废体基娃因组非必北需区（2）λ噬菌清体DN秀A的改锐造野生探型λ噬菌雀体DN瞧A分子茅较大寒，其蚊结构纺基因隐也很圈复杂长，并肉且常笑常容状纳不碍下分连子量朽更大邪的外辞源性术目的双基因DN宝A片段国。需善要对半其进伟行改水造。改造掘方法熟：（1）遗传灵学方穷法--状--扑--转-将λ噬菌佣体DN壳A交替少地在安不含壳质粒俩的大稀肠杆仔菌、夸和含蹈质粒竭的大桃肠杆卸菌的州宿主貌内生伪长，伞来删绕去其舟过多买的限躬制酶葛位点子。（2）体外锣删除丹法--兽--粒--耍-将λ噬菌衰体DN笋A在体畅外进乘行限岔制酶档消化患，再吐将未融被切控割部它分经慎过蛋众白质乘包装脊后，登去感葡染大乡丰肠杆咬菌。治经过器几代箭连续训培养熄之后耻，λ噬菌少体DN晶A就会躁失去坐不需屡要的遗限制室酶位伐点。（3）λ噬菌封体DN避A的体伯外包优装[A猫]、体逝外包塑装的劝作用[B可]、λ噬菌妥体DN雪A包装购的原台理[C房诚]、λ噬菌倘体DN矮A的包青装过屈程[A映]、体药外包岭装的域作用λ噬菌冈体DN嫂A连接仆上外壁源性被目的余基因肾，就朵成为鲜重组DN还A分子回，但趋是，敬重组扭之后扁的DN助A分子宁必须穴经过包装，加亡上蛋白印质外损壳形成蹲完整漏的病弟毒颗犁粒，朗才具娘有感染宿主兆的能般力。[B少]、λ噬菌脆体DN浮A包装雅的原旱理λ噬菌围体DN西A的头部四蛋白+重组DN覆A分子+λ噬菌大体DN项A尾部西蛋白，在包适当质条件茧下混亮合，毛就能她够自蜘动地收包装袄成完会整的λ噬菌击体病卵毒颗支粒。（4）λ噬菌旨体载侧体的懒构建（A）缩短筹长度（B）改造片酶切棍位点（C）增加浓选择俊标记（A）缩短臭长度插入钻型载卸体：①失去旱了非徐必需魄区②仅腔保留仇了Ec腹oR株Ⅰ的单剖一切箱点③切远点又永位于止报告竞基因稍上，悦故在柿切开DN况A并插司入外沈源基膀因后桨，报竟告基咏因失炭活，冰即可的依此机进行征重组慢体的猪筛选④可朵插入歪长度期为10在kb的外使源DN沾A只含枯一个伐限制旷性位按点可全供插造入外祸源DN亦A的载题体，形这类λ噬菌否体载那体称插概入型勿载体。注意颗：λ噬菌货载体搜作为订载体勿，其奴重组胆噬菌世体DN洋A大小址只能愤：37败kb姜~跪5次1k踢b。λ噬菌锅体载得体是动主要守用于cD心NA文库唱构建如，也算经常牲用于塑外源研目的术基因补的克估隆。置换型载迈体置换徐型载那体：捐可被思外源DN文A置换饶的λ噬菌裁体非晌必需阀区两毯侧有贩一对遭限制朝性酶炮切位雾点的坑载体疮，称陪为置腹换型句载体腹。适用艰基因炮组克加隆特殊沉性质烟：中间吼区域训约长18誉kb，这默一段DN健A可以嘉被外京源置监换而铜不会熔影响λp伟ha炼ge裂解外生长眯的能感力。包装痕限制肥：λp芳ha胸ge头部清外壳笑蛋白杨容纳DN陷A能力宇上限≤10点5%，下亚限≥75级%。包进装范统围[5储1k顾b,崇3萄6k别b]救.只有λD永NA的长良度大母于野辞生型λph碎ag晴e部DN群A长度嫩的75％而映不超畏过其10错5％时每，才筹能被散包装输成ph助ag斑e颗粒赞，当DN谈A的长旬度短晃于野继生型斯的75倦%或超缝过10嘴5%时，ph百ag锯e活性烦就急亮剧下弓降，故要助求λ载体DN啄A和外瓣源DN凉A长度商之和卫在36～51悼kb之间御。λ载体位必要查区是28怀kb挑,理论绳上克训隆能鉴力为23漏kb碗.（B）改造橡酶切暖位点野生稼型的λ-吼DN晒A链上吓有5个Ec加oR炉I位点具和7个Hi唉nd昼II轻I位点灿，不搬利于衣重组搬操作逆，必牧须删冲除至1薯-随2个。为了弓便于舅各种给来源兵的DN据A片段多的克余隆，已还需竞要增卡加一全些单润一的滤酶切乐位点左。（C）增加类选择伯标记加装本选择只标记la员cZ（5）λ噬菌己体载基体的跨使用重组λDN睁A的构建(酶切塘，连溪接）λ噬菌醋体的体外舱包装λ噬菌肝体侵染大肠氏杆菌重组λDN喝A的分离（6）λ噬菌声体载科体的曾优点容量驶大，装略载能吉力可转达23誓kb，便欲于构禁建基拥因文涂库重组铜子筛闭选较雾为方在便DN轧A提取婶操作红较为比简便4：单过链DN另A噬菌供体M1贿3载体M1晌3噬菌砖体（M1存3择ph腔ag捡e）是晌一种膏大肠习杆菌或雄性掘特异甲丝状辫噬菌砌体，遗传毒物质竖是环昨状单挎链DN才A,全长坚约6.堂5k蜻b。宿主龙是丝状朵大肠佩杆菌。它柳是单做链DN怎A噬菌捡体中类的一全个典包型的盛代表写。M1民3感染络细菌洋后，甚经过稠复制辣转变希为双礼链的上复制帅型（RF）。灶复制柱型M1威3可用糠作克更隆载智体。噬菌侍体M1喂3感染引宿主挨之后侧，在疲含有蛇异丙勿基硫嫁代半窑乳糖今苷（IP艇TG）的X-留ga拔l培养朵基中懂生长环时，熄会形盛成蓝京色噬派斑。木通过挥蓝色迅噬斑阔的出伏现可妖以显眉示噬湿菌体M1渴3的存破在。感染怒宿主协之后悔，噬折菌体M1烈3所释文放的公单链DN伍A可用蹦于制倘作放射饲性标剥记探疮针，用说来检旋测RN故A的结摄构。M1愿3噬菌漆体的告组成胡和结努构M1档3噬菌秤体颗廊粒是配丝状匠的，示只感榴染雄轧性大碰肠杆挎菌。田感染近宿主涂后不舞裂解误宿主悟细胞愤，而哈是从罚感染示的细纸胞中月分泌壁出噬惜菌体扒颗粒僵，宿卸主细吹胞仍最能继既续生灰长和宾分裂档。M1骗3噬菌揭体的辅外型督呈丝天状M1痕3噬菌胜体由散外壳翼包装赵蛋白馆和正丢链DN肢A组成M1肆3饼DN护A全长64拖07个核佳苷酸M1怒3棋DN兄A上至业少有11个基骗因27住00个外俭壳蛋话白分领子M1勾3噬菌泻体不租裂解驾宿主训细胞皮，但待抑制怖其生玻长M1逮3噬菌赢体的蠢组成亿和结发构单链DN灶A，由64铲07碱基悠组成挥。90昨%以上膏的序认列可糕编码敲蛋白让质，传共有11个编危码基暗因基因宰间的殃间隔区区多蚊为几好个碱击基。较大君的间兔隔位于价基因Ⅷ/炉Ⅲ以及冶基因Ⅱ/所Ⅳ之间义，其葛间有呢调节仔基因壤表达慨和DN胜A合成鞋的元赌件。M1巡寿3噬菌爆体的赛基因削组M1农3噬菌仁体的桶基因馒组编码3类蛋杠白质打：①复制愤蛋白携（基蜜因Ⅱ，Ⅴ和Ⅹ）②形态桐发生掠蛋白芬（基辜因Ⅰ，Ⅳ和Ⅺ）③结构添蛋白昏（基鄙因Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和Ⅸ）M1带3噬菌藏体载授体的叉构建M1突3噬菌估体作公为载齿体的泡重要它特点：①M1粱3噬菌梁体的苏感染扁与释善放不挽会杀粘死宿呼主菌握，仅碗导致椅宿主搁菌生捎长缓熄慢；②M1拳3噬菌举体DN旁A在宿练主菌糟内既欠可以逮是单猾链也晴可以旬是双船链，通过慢感染赚或转脑化的艰方法贱能将M1筹3噬菌铅体DN济A导人话宿主拨菌中；③M1贞3噬菌具体的左包装领不受DN舒A大小略的限戒制，其她噬菌美体颗故粒的恳大小均可随DN员A的大拜小而闪改变碎，即粱使DN清A的大彻小比病本身DN锁A的大幅小超现出6倍，雁仍能笑进行唤包装稠。⑤M1捞3噬菌闲体在询用作夜载体详时是利用享其双退链状鸟态的RF别D题NA：单链DN英A的酶厨切和泻连接夕是比分较困骂难的勾。⑥外源练片段术插入镰位点会在基因Ⅱ和基凶因Ⅳ之间趟的50攀8b馅p间隔丸区--德--M1映3不像λ噬菌豪体基困因组辩那样罗含有溜较大次的可里替代忆区。汤它的漫基因手组中锹绝大夏多数到为必挽需基伞因，筒只有驱两个凝间隔婚区可买用来侵插入兵外源DN影A（基因Ⅱ/扔Ⅳ和基穷因Ⅷ/缠Ⅲ之间）。5：人晋工质湿粒载托体--科斯戏质粒19埋78年Co坊ll的in造s和Ho创hn构建筐一种倍新型猛的大袍肠杆五菌克歌隆载狭体，钞命名钥为co汁sm刑id亭(柯斯喇质粒)，又而叫粘粒。柯斯格质粒判（co贪sm蛾id）=残co额s序列+质粒悼。实际济是质否粒的阴衍生吊物，宿它是份用正黄常的载质粒鸽同λ噬菌缎体的co旷s位点香构成妻。[A茎]、科偶斯质拒粒的弃基本阵组成[B负]、科邀斯质赛粒的翼特性[C冷]、科聪斯质晕粒的躬用途Co服s质粒冻（考艰斯质瓣粒Co妄sm蹦id）[A膏]、科揉斯质双粒的厚基本怎组成（1）含纳有λ噬菌宾体DN更A的粘笋性末陶端序姑列（CO波S序列搂）。（2）含块有质突粒的远一个态复制可起始双区。（3）含帖有质惠粒的耍一个眉抗药纪性标芦记。（4）具纹有多参种限踩制性尽内切谅酶的嘉单一渣性切候点。柯斯裂质粒pH蔑C7窗9系由质凑粒pB孩R3爪22和λ噬菌滴体的co闯s位点辰的一杠段DN构A构成付。包装色时，co笑s位点址打开券而产咸生λ噬菌农体的票粘性达末端含。由目于pH摇C7霉9有pB奶R3苹22羊DN简A，所涝以也拦就有剪氨苄料青霉五素抗夜性和救四环用素抗贯性两汤个标秋记。凡具盼有co额s位点佛的任军何DN顽A分子过只要浮在长祖度相腔当于夫噬菌偶体基磁因组巾，就欢可以绪同外陈壳蛋发白结独合而托被包晌装成涝类似λ