实验质粒DNA的提取

实验七

质粒DNA的提取

(碱法)实验目的实验原理实验仪器、材料与试剂实验步骤实验结果及讨论

实验目的了解碱法提取质粒的原理；掌握碱法提取质粒的方法。实验原理

质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。结构的三大要素：

多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）独立的复制单位种类：

质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA之间交联形成不溶性结构，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器（二）材料含重组质粒的大肠杆菌。（三）试剂1.LB液体培养基（1L）胰蛋白胨10g

酵母提取物5g

NaCl10g

加去离子水至800ml搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。2.

SolutionⅠ

50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/L

EDTA(pH8.0)高压灭菌后，4℃保存备用。3.

SolutionⅡ(现用现配制)

0.2mol/LNaOH1%SDS4.

SolutionⅢ（100ml）5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml

配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸（pH4.8）。5.

氨苄青霉素（Amp）

用无菌水配制成100mg/ml溶液，置-20℃冰箱保存备用。6.

胰RNA酶

将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。7.氯仿，乙醇，70%乙醇。8.TE缓冲液10mMTris.HCl(pH7.4)1mMEDTA(pH8.0)实验步骤

1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基（含Amp0.1mg/ml）中，37℃振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5mlEppendorf管中，12,000rpm离心2min，去掉上清液。将EP管口朝下，用滤纸吸干水分。3.沉淀悬于100μLSolutionI中,涡旋使充分悬浮，盖子打开，室温放5分钟。4.加入200μLSolutionII，混匀（注意动作轻），冰浴5分钟。5.加入1μLRNase和150μLSolutionIII，上下颠倒5-10次，冰浴10分钟。6.12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新EP管中，注意所取体积。7.加入2倍体积无水冰乙醇混匀（注意动作轻），-20℃沉淀10min。8.12,000rpm离心3min，弃上清，加入1ml70%乙醇振荡漂洗一次，再10000rpm离心2min，去上清。9.沉淀于-20℃保存备用。Bi清os销pi狮n质粒DN棋A小量亩提取熟试剂慰盒（实际泻用）操作窜过程1.将1～1.疗5m兴l过夜斥培养偏的细舒菌菌监液加拢入1.灰5m古l离心久管中述。2.于10，00周0r速pm离心30秒，耳并弃埋去上敲清液蛇。如有灶需要晋，可薄多次炎重复痰步骤1、2，以立收集得更多谜细菌御菌体钓。但扛勿过柄量，晒以免杜影响仰提取梳质粒竞的质刚量。3.加25丽0μ朽lRe陕su挤sp浊en笛si雹onBu摆ff摇er，重悬骆细菌扛体沉宁淀。重悬丸后应分该没蚊有细充菌团玻块。4.加25课0μ辽l细胞Ly盒si魔sBu增ff臭er，轻柔迁颠倒4～6次。不要易剧烈父振动广，以慎防止顺基因沾组DN傻A被剪扰切。抗注意杨不要傅让反姻应持用续超姨过5分钟山。5.加35聪0μ掀l爽Ne潜ut捷ra共li姨za错ti伍on谅B曾uf假fe妇r，立即由轻柔圾颠倒纳离心馅管4～6次。溶液钱应该论出现沿絮状扩物，匠但不浙会出丘现局子部沉滤淀。6.于13协,0板00洲rp歼m离心10分钟秩。如离陪心机轮转速固不够绑可延漏长离些心时彼间，责直至匪形成静紧密那的白笔色沉李淀。7.将步展骤6离心因后得次到的犯上清悼液转灾移到Sp后in永c煮ol陕um抱n内。斧于6,差00来0r宣pm离心1分钟耍，并钱弃去膏接液挣管内柄液体寻。8.向Sp竟in圆c跌ol队um狸n内加65座0μ粉l肉Wa昼sh吐B施uf撕fe馒r，于12，00颂0g离心30～60秒，呢并弃端去接退液管同内液秤体。9.重复多第8步一蒸次。10符.再次滩于12，00傅0r唉pm离心1分钟低，然毕后将Sp闻in程c愤ol役um是n转移机到无拥菌的1.促5m面l离心握管中送。如殿不进殊行该奴步离灶心，柜则无需法保疑证离未心柱夜内残圈液被瞎彻底肃清除耍。11舰.向Sp向in剩c闯ol舅um赵n内加20过μl链E固lu串ti苍on据B贡uf铃fe饥r、去离宰子水感或TE溶液罩，并托于室纽奉温静局置1分钟咬。可根撞据实雄验的督实际霜需要行决定弱洗脱添液用水量。12寒.于12，00厌0rp拼m离心1分钟闯，1.粮5m倡l离心肺管内耗溶液阳中含袭有质但粒DN谣A。13掉.提取愧的质乔粒DN脑A可直班接用移于各根类下旁游分岔子生姻物学附实验劫，如物果不疾立即