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文档简介

实验四从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段

一、实验目的学习经琼脂糖凝胶电泳分离后回收并纯化DNA片段的方法二、实验原理将DNA样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的DNA片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的柱子上；然后用高盐缓冲液洗涤除去残余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用TE缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的DNA洗脱下来。回收纯化后的DNA可直接用于DNA的连接反应、标记反应、测序反应或DNA的微量注射等研究。

三、实验材料

水浴锅、离心机、移液器PCR扩增的Rv1791基因AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0（Taraka）试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需30分钟便可完成。本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完整性好，可直接用于连接反应、PCR扩增、DNA测序等各种分子生物学实验。四、实验步骤（1）实验三中的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。（2）在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率。切胶时不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。（3）切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤6的胶块融化时间，提高DNA的回收率。（4）称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg=1μl进行计算。（5）向胶块中加入3倍凝胶体积的胶块融化液DR-IBuffer。（6）均匀混合后75℃加热融化胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约6～10min）。（7）向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer量的1/2体积量的DR-IIBuffer，均匀混合。当分离小于400bp的DNA片段时，应在此溶液中再加入终浓度为20%的异丙醇。（8）离心柱放入收集管中，将步骤7的溶液转移至离心柱中，12,000rpm，1min，弃滤液。如将滤液再加入离心柱中离心一次，可以提高DNA的回收率。（9）将500μl的RinseA加入离心柱中，12,000rpm，30s，弃滤液。（10）将700μl的RinseB加入离心柱中，12,000rpm，30s，弃滤液。（11）重复操作步骤10，将离心柱放入收集管中，12,000rpm，1min。（12）将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中央处加入25μl的灭菌蒸馏水或ElutionBuffer，室温静置1min。注）把灭菌蒸馏水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。（13）12,000rpm，1min，洗脱DNA。五

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