亚细胞蛋白质组学

亚细胞蛋白质组学1第一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第一节概论

真核生物体是一个复杂系统。

蛋白质的亚细胞定位对蛋白质生物功能的发挥起到极关键的作用，蛋白质亚细胞定位信息强烈暗示着其生物学功能。

亚细胞蛋白组学已日益成为蛋白质组学研究的焦点之一。

——RabilloudT,KiefferS,ProcaccioVetal.Electrophoresis,1998,19:1006-14.

以人为例，基因组分析表明，人具有3万~5万个基因，经过剪切和翻译后修饰产生更多的蛋白质种类；受蛋白质等电点极限、疏水性、相对分子质量范围以及蛋白质丰度限制，很难由2-DE技术一步到位地获得生物体的全蛋白质组。2第二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、亚细胞蛋白质组学的内涵

亚细胞蛋白质组学(subcellularprote-omics)：针对细胞内不同区域结构功能单位的蛋白质组学研究。3第三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、亚细胞蛋白质组学的内涵细胞器(organelle)或细胞区域

如细胞膜(cellmembrane)、细胞浆(cytoplasm)、线粒体(mitochondria)、溶酶体(lysosome)、过氧化物酶体(peroxisome)、内质网(endoplasmicreticulum)、高尔基体(golgiosome)和细胞核(cellnucleus)等。4第四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五大分子结构体(macromolecularstructure)或多蛋白质复合体(multiproteincomplex)如核基质(nuclearmatrix)、剪接体(spliceosome)、纺锤体(spindlepole)、核孔结构(nuclearporecomplex)以及核糖体(ribosome)等。一、亚细胞蛋白质组学的内涵5第五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五富集低丰度蛋白质，完善全细胞蛋白质组提供蛋白质的亚细胞定位信息加深对亚细胞组分的结构功能理解加深对细胞生理分子机制的理解利于亚细胞蛋白质组的差异表达谱研究二、亚细胞蛋白质组学的意义6第六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、亚细胞蛋白质组学的技术基础（一）亚细胞组分的分离（二）蛋白质组学技术（三）蛋白质亚细胞定位实验技术（四）蛋白质亚细胞定位预测技术亚细胞组分的分离纯化蛋白质组学技术研究7第七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五（一）亚细胞组分的分离亚细胞分级细胞的破碎亚细胞组分的分步分离免疫共沉淀分离信号复合体亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分分离纯化效果评价8第八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五1、细胞的破碎：渗透压冲击、超声波震荡、机械力研磨或剪切（一）亚细胞组分的分离2、亚细胞组分的分步分离

差速离心

与密度梯度离心

联用

9第九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

差速离心(differentialcentrifugation)

是利用样品中各种组分的沉降系数不同而进行分离的方法，又称差分离心或差级离心。通常两个组分的沉降系数差在10倍以上时可以用此法分离。10第十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五优点：样品处理量较大，可用于大量样品的初级分离。缺点：分离复杂样品和要求分离纯度要求较高时，离心次数太多，操作繁杂。11第十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五差速离心形成的沉淀（肝脏）沉淀RCF(gav)×时间内容物P11000g×10min细胞核，重线粒体，大片细胞膜P23000g×10min重线粒体，细胞膜碎片P36000g×10min线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，完整高尔基体P410000g×10min线粒体，溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体P520000g×10min溶酶体，过氧化物酶体，高尔基体膜，大的高密度小泡（如粗面内质网）P6100000g×10min从内质网而来的所有小泡，细胞膜，高尔基体，核内体等例注：RCF即相对离心力。12第十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五细胞器的大小和沉降特性亚细胞成分大小/μmRCF/g时间/min细胞核4~12500~10005~10核膜*2000(30000)30(5)线粒体0.4~2.51000~1000010~15溶酶体0.4~0.86000~1500010~20过氧化物酶体0.4~0.86000~1500010~20粗面内质网小泡0.05~0.3530000~10000030~60光面内质网小泡0.05~0.350000~10000030~60胞膜

大片3~201000~300010~15

小泡0.05~2.050000~10000030~60核内体0.05~0.450000~10000030~60高尔基体(完整)1.0~2.010000~2000020~30高尔基体(小泡)0.05~0.550000~10000020~40肌质网0.1~1.010000~3500020叶绿体2~51000~200010植物线粒体1~35000~2000015*

核膜的制备物是否是完整的包膜，它的沉降速率取决于制备的方式。13第十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

密度梯度离心(isodensitycentrifugation)

又称为区带离心，是将样品溶液置于一个由梯度材料形成的密度梯度液体柱中，离心后被分离组分以区带层分布于梯度柱中。按照离心分离原理，梯度离心又可分为速率区带离心法(又称连续密度梯度离心法)和等密度离心法(又称不连续密度梯度离心法)。14第十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

速率区带离心法是根据样品中不同组分粒子所具有的不同体积尺寸大小和不同沉降系数进行分离。

等密度区带离心法是根据样品组分的密度差别进行分离纯化。15第十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五密度梯度离心介质

蔗糖梯度便宜，溶解度高，能够制备分离绝大多数成分所要求的密度范围的溶液，最常用；高浓度时黏性大，且渗透压高。

FicollNycodenzPercollMetrizoate16第十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五亚细胞成分在蔗糖和低渗透压介质中的密度亚细胞成分密度/（g·cm-3）蔗糖低渗透压介质*细胞核>1.301.21~1.24核膜1.18~1.22n.a.线粒体1.17~1.211.15~1.20Mitoplast线粒体质1.44n.a.溶酶体1.19~1.211.10~1.15过氧化物酶体1.18~1.231.19~1.22粗面内质网1.18~1.26n.a.光面内质网1.06~1.151.03~1.07细胞膜

大片1.14~1.191.12~1.15

小片1.07~1.161.05~1.12核内体1.06~1.161.05~1.10高尔基体（完整）1.05~1.121.03~1.08高尔基体（小泡）1.05~1.121.03~1.08肌质网1.04~1.08n.a.叶绿体1.18~1201.10~1.13植物线粒体1.16~1.19n.a.注：n.a.为未得到数据；*这些数据是在Nycodenz、Metrizoate或Percoll中的密度。17第十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五3、免疫共沉淀法(Co-IP)分离信号复合体

(Signalingcomplex)

（一）亚细胞组分的分离18第十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五（一）亚细胞组分的分离4、亲和层析法分离不同亲和特性的亚细胞组分

根据细胞或亚细胞组分中不同种类的翻译后修饰特性可望用来分离各类被修饰的蛋白质。19第十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五（一）亚细胞组分的分离5、分离纯化效果的评价

判断亚细胞分离纯化是否成功，可以用光学或电子显微镜监测，或者检测蛋白质浓度或合适的标志酶。

纯化过程中跟踪合适的标志酶的活性可以确定目的细胞器的产率和污染其他细胞器成分的程度。通过在纯化过程中确定蛋白质的浓度，计算每一步的比活性（活性与蛋白质的比率），可以用来估算富集程度或纯化倍数。20第二十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五哺乳动物细胞膜的主要酶分布特点膜成分酶细胞膜

顶端膜5’-核苷酸酶、亮氨酸氨肽酶、碱性磷酸酶

基底膜Na+/K+-ATP酶、激素控制的腺苷酸环化酶通用5’-核苷酸酶、Na+/K+-ATP酶线粒体琥珀酸脱氢酶溶酶体Β-半乳糖苷酶、酸性磷酸化酶、芳基硫酸酯酶过氧化物酶体过氧化氢酶、尿酸酶高尔基体半乳糖苷转移酶内质网NADPH(或NADH-)细胞色素c还原酶核膜核苷酸三磷酸酶线粒体外膜单胺氧化酶线粒体内膜细胞色素氧化酶21第二十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五（二）蛋白质组学技术传统2D-MS1D或LC+MS2D-LC-MS/MS蛋白质分离技术与蛋白质鉴定技术的结合22第二十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五（三）蛋白质亚细胞定位实验技术endoG-YFP

(apoptoticendonuclease)MitochondriaCo-localization

为了验证亚细胞蛋白质组学的研究结果，如新发现蛋白质的亚细胞定位及其在亚细胞结构中的可能功能，需要细胞或分子生物学的补充实验予以证实。WesternblotTAP(tandemaffinitypurification)电镜技术荧光显微镜技术23第二十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五（四）蛋白质亚细胞定位预测技术

亚细胞定位预测主要基于蛋白质氨基酸序列的三个方面的特性：氨基酸组成特点、分拣信号的识别以及氨基酸序列的进化保守性。

蛋白质在胞浆合成后，须在N端分拣信号(sortingsignal)

的指引下到达不同亚细胞部位发挥生物学功能。常用于蛋白质亚细胞预测的各种分拣信号包括：信号肽(signalpeptide,SP)、线粒体引导肽(mitochondrialtargetingpeptide,MTP)、叶绿体运输肽(chloroplasttransitpeptide,CTP)

和核定位信号(nuclearlocalizationsignals,NLS)。24第二十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五互联网上常用的亚细胞定位预测软件软件名称网址(URL)预测功能预测依据ChloropPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/Chlorop/

叶绿体蛋白质识别CTPMitoProthttp://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj/medgen/mitofilter

线粒体蛋白质识别MTPSignalPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP

分泌蛋白识别SPpredictNLS/predicNLS/

核蛋白质识别NLSPredotarhttp://www.inra.fr/Internet/Produits/Predotar

线粒体和叶绿体蛋白质识别MTP和CTPTMHMMhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHM-2.0

膜蛋白质识别跨膜螺旋和拓扑结构HMMTOPhttp://www.enzim.hu/hmmtop/

膜蛋白质识别跨膜螺旋和拓扑结构SobLoc/SubLoc

12种亚细胞定位氨基酸组成分析NNPSLhttp://predic.sanger.ac.uk/nnpsl

5种亚细胞定位氨基酸组成分析TargetPhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TaregtP/

4类亚细胞定位SignalP、ChloropP和MTP识别三者相结合PSORThttp://psort.nibb.ac.jp/

12种亚细胞定位氨基酸组成与分拣信号识别相结合

注：CTP叶绿体运输肽(chloroplasttransitpeptide);NLS核定位信号(nuclearlocalizationsignals);MTP线粒体引导肽(mitochondrialtargetingpeptide);SP信号肽(signalpeptide)。25第二十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

亚细胞定位预测的方法的建立包括四个步骤：（四）蛋白质亚细胞定位预测技术1.建立客观、有代表性的各种已知亚细胞定位的训练用蛋白质数据系列(trainingdataset)；2.从蛋白数据系列中抽提出各种特征信息参数；3.根据特征信息参数采用一些算法建立算法模型以计算比较可疑蛋白质某种亚细胞定位的可能性4.采用检验用蛋白质数据系列(testingdataset)结合不同评价方法对所建立算法模型的预测结果进行评价。26第二十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五四、亚细胞蛋白质组学研究进展1.细胞器的蛋白质组学研究2.大分子结构体和多蛋白复合体的蛋白质组学研究3.模式生物的亚细胞蛋白质组学研究4.将定量技术和差异分析引入亚细胞蛋白质组学27第二十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第二节细胞膜的蛋白质组学研究进展一、细胞膜的结构与功能

真核生物中，细胞质膜(plasmamembrane)与细胞内膜统称为生物膜

(biomembrane)。

与细胞起源、细胞分裂分化、细胞识别、免疫、物质运输、信息传递、代谢调控、能量转换、神经传导以及肿瘤的发生均有关。28第二十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、细胞膜的结构与功能蛋白质（包括酶）脂类糖类（糖脂和糖蛋白）50%40%10%29第二十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五二、膜蛋白质的特点

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大基本类型：外在膜蛋白

(extrinsicmembraneproteins)或外周膜蛋白

(peripheralmembraneproetins)内在膜蛋白

(intrinsicmembraneproteins)或整合膜蛋白

(integralmembraneproetins)水溶性，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以分离，结构不被破坏。双型性，以不同程度嵌入脂双层内不，疏水区域与脂双层中脂类分子的疏水尾部作用，亲水区域暴露在膜的一侧或两侧表面。不易分离，优质用去垢剂才可分离，但分离后易失去正常构型。>30第三十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、膜蛋白质的双向凝胶电泳技术研究

细胞质膜负责细胞内外环境物质和信息的交流，在受体介导的信号跨膜传导、物质的转运等方面发挥重要作用。

细胞质膜是广泛的药物设计靶标，细胞质膜蛋白占整个已知药物靶标的70％。所以，用蛋白质组学方法分析细胞质膜蛋白质倍受关注。31第三十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、膜蛋白质的双向凝胶电泳技术研究

膜蛋白的不易分离和疏水特性对传统的蛋白质组学技术尤其是双向凝胶电泳技术提出了严峻挑战。

各种新的破膜剂、表面活性剂、还原剂的使用

如：硫脲与尿素的联用；

β-硫代型两性离子表面活性剂如CHAPS；

TBP(tributylphosphine)代替常规还原剂二巯基乙醇DTT。

新的抽提方案出现如：膜蛋白组分的分级抽提、采用双向变性剂TritonX-144或进行Na2CO3预处理膜蛋白组分，分离内在膜蛋白以及采用有机溶剂抽提膜蛋白等。32第三十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五四、膜蛋白质的非双向电泳技术研究

单向SDS直接与质谱技术结合分离鉴定膜蛋白混合物，已成为一种趋势，可避免采用固化pH梯度进行等电聚焦过程造成的膜蛋白质的丢失。

用于直接分析大蛋白复合体(directanalysisoflargeproteincomplexes,DALPC)的多维色谱与串联质谱联用的2D-LC-MS/MS技术，避免了双向电泳技术分离中等电点极限、疏水性、相对分子质量范围等因素的限制。33第三十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第三节高尔基体蛋白质组学研究进展一、高尔基体的结构与功能

高尔基体(Golgibody)

又称高尔基器(Golgiappa-ratus)或高尔基复合体(Golgicomplex)，是真核细胞内的一种重要细胞器。

高尔基体是由大小不一、形态多变的囊泡体系组成，在不同的细胞中，甚至细胞生长的不同阶段都有很大的区别。有时不易辨认，而且更难分离与纯化，再加上一般动物细胞中数目较少，在含量丰富的肝细胞中也仅有50个左右的高尔基体。因此对高尔基体的结构与功能的研究，一直是细胞生物学家面临的挑战性难题之一。34第三十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、高尔基体的结构与功能

电子显微镜所观察到的高尔基体最富有特征的结构是由一些（常常4～8个）排列较为整齐的扁平膜囊（saccules）堆叠在一起，构成了高尔基体的主体结构，扁囊多呈弓形，也有的呈半球形或球形。膜囊周围又有大量的大小不等的囊泡结构。

高尔基体是一种有极性的细胞器，靠近细胞核的一面，扁囊弯曲成凸面又称形成面(formingface)或顺面(cisface)，面向细胞质膜的一面常呈凹面(concave)又称成熟面(matureface)或反面(transface)。

35第三十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、高尔基体的结构与功能

高尔基体是细胞内大分子运输的一个主要交通枢纽，主要参与了细胞的分泌活动，是糖类合成和蛋白质翻译后修饰的重要场所。蛋白质的加工、分类、包装与运送脂类向质膜和溶酶体膜等部位的运输糖类生物合成的主要场所36第三十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五二、高尔基体的蛋白质组学研究

据估计，高尔基体至少有1000种组成性蛋白质，而从哺乳动物各种组织中只鉴定出200余种高尔基体蛋白质。1997-2000年，Taylor等先后采用放线菌酮预处理的办法，结合差速离心、蔗糖密度梯度离心和去垢剂抽提，通过双向电泳和串联质谱的技术在高尔基体组分中分离鉴定93个蛋白质，建立了第一个哺乳动物高尔基体蛋白质组学数据库。1982年，Howell研究小组发现在生理状态下，大鼠肝组织高尔基体中约50%的蛋白质都属于一过性运输蛋白质。37第三十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、蛋白质组学研究发现新的高尔基体蛋白质2004年，Wu等采用MudPIT方法对高尔基体进一步分析，421种蛋白质在高尔基体组分中得到鉴定，其中41种蛋白质属于新蛋白质。通过对数据进行生物信息学分析，发现在这421种蛋白质中有15种有精氨酸甲基化修饰，这提示高尔基体可能执行一种新的翻译后修饰方式。2001年，Bell等结合差速离心和蔗糖密度梯度离心获得高度富集的高尔基体组分并利用TritonX-114抽提蛋白组分，采用单向SDS分离，通过基质辅助激光解吸离子化质谱技术检测肽质量指纹图谱、串联质谱技术产生肽序列标签和Edman降解法测定氨基酸序列等方法相结合，共鉴定出81种蛋白质，其中鉴定出34000Da新蛋白质GPP34并将其分布定位于高尔基体内。38第三十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五四、不同功能状态高尔基体的比较蛋白质组学研究2000年，Wu等对乳腺上皮细胞这两种功能状态的高尔基体进行了比较蛋白质组学研究，发现并鉴定出30种上调蛋白：乳腺上皮细胞在分娩前后由怀孕末期基础分泌状态到哺乳期最大分泌状态时，Golgibody所占细胞容积由1%-3%增大到5%-15%，高尔基体中小池总数增加2倍以上。6种膜内蛋白质（包括膜联蛋白和突触结合蛋白）6种调节蛋白质4种微管运动蛋白4种肌动蛋白调控蛋白其中：

这4类蛋白质的上调于观察到的高尔基体在最大分泌状态时分泌小泡增多及融合、外排活动增加相一致。39第三十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第四节核孔复合体蛋白质组学研究进展

核孔是细胞核与细胞质之间物质交换的通道，一方面核的蛋白都是在细胞质中合成的，通过核孔定向输入细胞核，另一方面细胞核中合成的各类RNA、核糖体亚单位需要通过核孔运到细胞质。40第四十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核孔复合体的结构和功能

核孔复合体(nuclearporecomplex,NPC)是一个直径为120nm的胞质环(cyto-plasmicring)

和核质环(nucl-eoplasmicring)所组成的滴漏(hourglass)样的结构。

该模型特点几乎为各种真核生物所共有，而且许多核孔蛋白(nucleoporins,nups)在不同物种间高度保守。41第四十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核孔复合体的结构和功能

核孔复合体是一种特殊的跨膜运输蛋白质复合体，构成了核质间双向运输的亲水性通道。抽提后的核孔复合体胞质面结构图抽提后的核孔复合体核质面结构图42第四十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核孔复合体的结构和功能被动扩散主动运输功能直径为9-10nm，有的可达12.5nm。允许离子、水溶性分子穿梭于核质之间，进行自由扩散。包括亲核蛋白质的核输入以及RNA及核糖体亚单位的核输出等。扩散速度与分子量成反比。小于5×103的可自由进入，大于60×103的球蛋白不能进入。(1)对颗粒大小的限制，一般可达10-20nm，表明核孔复合体的有效直径是可以调节的；(2)主动运输是信号识别和载体介导的过程，需要ATP；(3)具有双向性。43第四十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五金颗粒标记的核蛋白穿越核孔通过核孔复合体进行物质运输的功能示意图44第四十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核孔复合体的结构和功能

作为核质间运输的唯一位点，核孔复合体在细胞周期循环、基因表达调控以及癌症发生等方面都发挥着重要的作用。

核孔复合体构成推测包括100余种不同的多肽，1000多个蛋白质分子，统称为核孔蛋白(nucleoporin,Nup)。已在酵母中鉴定到30余种，在脊椎动物中鉴定到10余种。45第四十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五二、酵母核孔复合体蛋白质组学研究2000年Rout等将富集到的酵母核孔复合体组分蛋白质经羟基磷灰石柱和C4反相柱高效液相色谱分别分离收集得到了80和180个组分。组分经胶内胰酶酶解、DE-MALDI-TOFMS或MALDiontrapMS分析、搜索NR蛋白质数据库鉴定出174种基因产物。最终确定有40种基因产物与NPC相关，29种为核孔蛋白(nups)，其中7种为新确定的nups，11种为转运因子。Rout等根据所鉴定的NPC相关蛋白质的种类和定位信息，提出了酵母NPC的一种结构模型，并对NPC的物质交换机制进行了探讨，认为将NPC的核质交换可能由结合、交换、捕获和释放等过程完成。46第四十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、哺乳动物核孔复合体蛋白质组学研究2002年Cronshaw等将大鼠肝细胞核经DNase和RNase消化以及肝磷脂抽提除去染色质，经TritonX-100和SDS处理除去核膜及与核膜相关组分，最后采用两性离子变性剂选择性地溶解抽提出包埋于核纤层中的NPC的nups，并进一步经C4反相柱分离，通过搜索数据库，共鉴定了94个基因产物，分为23个nups、18个NPC相关蛋白质、42个非NPC蛋白质和11个功能未名蛋白质。免疫荧光共定位实验证明其中6个功能未明蛋白质定位于NPC。还发现了一类新型的具有WD重复序列的核孔蛋白。47第四十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五结构学比较表明，脊椎动物核孔复合体较酵母的大，其分子质量也远大于酵母。但对二者的蛋白质组学研究表明，它们都只由约30种nups组成，这主要是与多拷贝高分子质量的核孔蛋白形成核孔复合体的对称性结构有关。而且约2/3的nups在二者间保守，表明哺乳动物与酵母的核孔复合体虽然存在大小和组成上的差异，但在结构和功能上仍有进化的保守性。上述二者的研究分别发现了7种和6种新的核孔蛋白质，发现了一类新型的具有WD重复序列的核孔蛋白质，并对核孔复合体的分子质量、分子结构模型和核质交换功能的机制进行了深入的探讨。小结48第四十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第五节核仁蛋白质组学研究进展

核仁(nucleolus)

是真核细胞核内一动态组织结构，除具有核糖体亚基的生物生成功能外，已发现还具有其他多种生物功能。核仁的蛋白质组学研究将促进深入理解核仁的细胞周期性的动态变化以及具有的多种生物功能机制。49第四十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核仁的结构和功能

核仁是一动态结构，在真核细胞分裂间期核中结构最明显，在每个细胞周期中经历解聚与重建的过程。

电镜下核仁的超微结构包括3个特征性区域：纤维中心(fibrillarcenter,FC)

致密纤维组分(densefibrillarcomponent,DFC)

颗粒组分(granularcomponent,GC)rDNA转录局限在FC周边部分，促使rRNA转录物聚集于DFC进行修饰处理，而在GC中组装成核糖体亚单位。50第五十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核仁的结构和功能

核仁最主要的功能是核糖体亚基的生物生成，包括rRNA的合成、加工和核糖体亚单位的组装等过程。

其他功能还包括：如信号识别颗粒(signalrecognitionparticle,SRP)、剪接体中的小核蛋白体和端粒酶等的生成和成熟，以及一些mRNAs和tRNAs的转录后处理以及核输出，并通过扣押机制调控一些特殊调节蛋白质的的活性等。51第五十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、核仁的结构和功能

核仁的主要成分为蛋白质，为核仁干重的80%；RNA为核仁干重10%左右；DNA含量较RNA少；脂类的含量极少。

细胞化学研究法发现核仁中存在碱性磷酸酶、ATP酶等多种酶系。对核仁中蛋白质组成的了解将促进对核仁结构及多种功能的认识。52第五十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五二、核仁的蛋白质组学研究进展2002年Andersen等联合应用超声波和蔗糖密度梯度离心技术分离纯化出Hela细胞的核仁，组分蛋白质分别经Tris-甘氨酸、Tris-乙酸盐1DSDS和2DSDS获得最大分离，凝胶切点酶解后应用质谱分析，共鉴定271个基因产物，其中30.5%为新基因产物、22%为核苷酸或核酸结合蛋白质、14%为核糖体蛋白质、9%为RNA修饰酶或相关蛋白质、5%为含具有RNA依赖的ATP酶和螺旋酶活性的蛋白质、5%为分子伴侣蛋白质，另外还有3.5%的翻译因子。同时，Andersen等采用转录抑制性药物ActinomycinD处理Hela细胞，对比处理组和对照组鉴定出11种蛋白质的丰度在处理组的核仁中有增加。通过荧光定位观察，发现其中部分蛋白在对照组细胞中主要存在于核基质，但经ActinomycinD处理后，移位到了核仁中。53第五十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五第六节线粒体蛋白质组学研究

线粒体(Mitochondrion)

是细胞的动力工厂，哺乳动物呼吸所需要的80％-90％的ATP是由它供给的，而且线粒体也参与细胞凋亡，离子平衡的调节，碳水化合物和脂肪酸的代谢等多种细胞生理病理活动。

Science于1999年3月发表了“Mitochondrialmakeacomeback”专题系列论文，重申线粒体再度成为当前生命科学和分子医学中的热点和前沿。54第五十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、线粒体的结构和功能

线粒体的外形多种多样，如椭圆形、哑铃形、环形、圆柱形等，与细胞类型和所处的生理条件有关，最常见是呈线状或颗粒状。

线粒体的数目在不同类型细胞中差异很大，哺乳动物成熟的红细胞中没有线粒体，一般动物细胞中平均有数百个。

植物细胞中线粒体含量比动物细胞要少，可能与富含叶绿体有关。

线粒体的数目与细胞的生理功能及需求密切相关，需要能将较多的细胞，线粒体的数目也较多。55第五十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、线粒体的结构和功能

电镜下观察，线粒体有着同样的结构，是一个由内外两层单位膜构成的封闭的囊状结构，主要由外膜

(outermembrane)、内膜

(innermembrane)、膜间隙(intermem-branespace)及基质

(matrix)或内室

(innerchamber)组成。

外膜上有排列整齐的筒状圆柱体，其成分为孔蛋白(porin),相对分子量为1.0×104以下的小分子物质均可通过小孔进入膜间隙。内膜对物质的通透性很低，能严格地控制分子和离子通过，这种“不透性”(imperme-ability)在ATP的生成过程中起重要作用。内膜向线粒体内室褶叠形成嵴(cristae),其形状和数量与细胞种类及生理状况密切相关。基质为内膜所包围的嵴外空间，腔内充满可溶性蛋白质性质的胶状物质，呈均质状，具有一定的pH值和渗透压。56第五十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、线粒体的结构和功能

蛋白质占线粒体干重的65～70％，脂类占25～30％蛋白质在线粒体各组成部分中分布有很大差异。大鼠肝细胞线粒体蛋白质的67％在基质内，21％在内膜，6％在外膜，6％在膜间隙。

线粒体的化学组成主要是蛋白质，其次是脂类，另外还有许多辅酶、维生素、金属离子和线粒体DNA、RNA和核糖体等。57第五十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

线粒体中已被确认的酶有上百种，分布在各个结构组分中。如外膜中含有合成线粒体脂类的酶类，内膜中含有执行呼吸链氧化反应的酶系和ATP合成酶系；基质中有高浓度的多种酶的混合物，如参与三羧酸循环反应、丙酮酸与脂肪酸氧化的酶系和蛋白质与核酸合成酶类等。

线粒体的蛋白质可分为可溶性与不溶性两类。可溶性蛋白大多数是基质中的酶和膜的外周蛋白；不溶性蛋白是膜的镶嵌蛋白、结构蛋白和部分酶蛋白。

一、线粒体的结构和功能58第五十八页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、线粒体的结构和功能

线粒体不仅维持细胞正常生理功能，在细胞凋亡和死亡中也发挥了重要作用。

线粒体是细胞能量生成场所，通过氧化磷酸化为机体提供90%的ATP能源；

与细胞中氧自由基的生成、细胞程序性死亡、细胞的信号转导、细胞内多种离子的跨膜转运及电解质稳态平衡的调控包括线粒体对细胞中Ca2+的稳态调节等有关。59第五十九页，共七十五页，编辑于2023年，星期五一、线粒体的结构和功能

线粒体与疾病

线粒体在生物体的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。

线粒体与疾病、衰老和细胞凋亡有关，线粒体的异常会影响整个细胞的正常功能，从而导致病变。有人将这一类疾病称为“线粒体病”(MitochondrialDiseases，MD)。“线粒体病”的研究已与线粒体DNA(mtDNA)的损伤、缺失相联系。主要表现为呼吸链的电子传递酶系和氧化磷酸化酶系的异常。60第六十页，共七十五页，编辑于2023年，星期五二、线粒体的分离纯化基本步骤：制备组织或细胞匀浆进行差速离心如有必要，还可进行密度梯度离心而进一步纯化

组织细胞的特异性及所研究线粒体的实验用途据定了方法的细节，比如：匀浆器的选择、缓冲液的成分、许可混杂其他细胞器的程度等。61第六十一页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、线粒体的蛋白质组学研究

最近线粒体蛋白质组学研究比较多，已经成为亚细胞蛋白质组学研究的典范。估计线粒体含有至少1500种不同的蛋白质。2001年Kruft等对拟南芥线粒体进行了蛋白质组学研究，通过IEF/TricineSDS双向电泳得到650个蛋白质点，鉴定出其中的52个，进行了功能分类。同时，Millar等也发表了对拟南芥线粒体蛋白质组学研究论文，双向电泳显示了约100种高丰度蛋白质和250种低丰度蛋白质，并将样品按照膜关联程度进一步分机，得到全部蛋白质、可溶性蛋白质、膜蛋白质和内在膜蛋白质的2D图谱。62第六十二页，共七十五页，编辑于2023年，星期五三、线粒体的蛋白质组学研究

最大规模的运用2D分析线粒体蛋白质组的研究是针对大鼠肝脏线粒体进行的。2000年Lopez等使用高通量自动化设备结合亲和层析技术鉴定了数百种线粒体蛋白，并用亲和技术分别富集了钙结合蛋白质、糖蛋白和膜蛋白，获得了2D图谱。2002年Fountoulakis等采用pH3~10非线性、pH4~7线性、pH5.5~6.7线性3种IPG胶条进行第一相IEF电泳分离，SDS进行第二相分离，质谱检测到192种基因产物，其中42%的蛋白质点已被亚细胞定位于线粒体中，其中8种基因产物为首次检测且均由一个蛋白质点代表。63第六十三页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2003年Sickmann等利用多种蛋白质分离鉴定路线，鉴定到了750种酵母蛋白质，建立了目前最大的线粒体蛋白质表达谱。三、线粒体的蛋白质组学研究2003年Taylor等采用SDS结合串联质谱方法对人心肌线粒体进行分析，鉴定出615种蛋白质；随后，Gaucher等采用MudTIP技术拓展了人心肌线粒体蛋白质组的研究。上述蛋白质组数据为进一步分析线粒体的功能提供了丰富的数据资源。线粒体内膜在线粒体功能发挥中起重要作用，于是就有研究者专门研究线粒体内膜蛋白的组成。他们利用二维色谱和串联质谱分析内膜蛋白质组，总共鉴定了183个蛋白质，其中22个是未知的或以前没有发现与线粒体内膜有关。64第六十四页，共七十五页，编辑于2023年，星期五四、线粒体的三维分离及线粒体亚组分的蛋白质组学研究

线粒体的2D图谱大多是溶解整个线粒体乃至整个细胞所得，这使得2D图谱含有的点过多，反而不利于分析。这类图谱也难以提供单个多蛋白质复合体的蛋白质组成信息和功能信息。

背景65第六十五页，共七十五页，编辑于2023年，星期五四、线粒体的三维分离及线粒体亚组分的蛋白质组学研究

三维分离技术2001年Hanson等将蔗糖密度梯度离心与双向凝胶电泳技术结合，形成线粒体蛋白质的三维分离，其中蔗糖密度梯度离心可按大小分离线粒体中的蛋白质复合物。该法在线粒体的应用有助于解决等电点聚焦过程中蛋白质的分辨问题以及疏水蛋白质的溶解问题等，并可以提供线粒体多蛋白质复合体的结构功能信息。66第六十六页，共七十五页，编辑于2023年，星期五2002年Werhahn等也发展了一种3D电泳，首先用Blue-nativePAGE

分离线粒体多蛋白质复合体，再电洗脱至完全解离考马斯亮蓝染料，沉淀后再以IEF/SDS分离多蛋白质复合体，形成Blue-native/IEF/SDS三维电泳。

三维分离技术对线粒体组分再次细分，进一步富集了低丰度蛋白质，提高了蛋白质组图谱的分辨率；并使分离鉴定线粒体中多蛋白质复合体的蛋白质组成成为可能，促进了对所有线粒体蛋白质组成及其功能的研究。四、线粒体的三维分离及线粒体亚组分的蛋白质组学研究67第六十七页，共七十五页，编辑于2023年，星期五

亚组分蛋白质组学研究1998年Jansch等以Blue-nativePAGE/TricineSDS分别分离了马铃薯和拟南芥线粒体外膜移位酶(TOM)复合物，分别得到了7种和6