质粒DNA的提取和鉴定

第一部分碱裂解法提取质粒一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA二、实验原理

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性pH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）

三、实验仪器、材料与试剂

（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含有质粒的大肠杆菌、LB液体培养基（三）试剂：溶液I50mM葡萄糖25mMTris·HCl（pH8.0）10mMEDTA溶菌酶4mg/mL作用:分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II0.2MNaOH1%SDS（新鲜配制）作用:碱性下水解细胞壁肽聚糖,核酸和蛋白质变性。溶液III5MKAc作用:酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA,沉淀SDS平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA三、实验仪器、材料与试剂

1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中,4℃下10000rpm离心5分钟。

2、弃上清,将管倒置于滤纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10分钟。

4、加入新配制的200μl溶液Ⅱ,盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5分钟。

5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，颠倒混匀至出现白色絮状沉淀，温和振荡10秒,

使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g离心15分钟。

四、操作步骤

四、操作步骤6、上清液移入干净eppendorf管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5分钟。

7、将水相移入干净eppendorf管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱(冰浴）中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于滤纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液,将管倒置于滤纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，37℃保温30min后，储于-20℃冰箱中。

碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液五、注意事项——材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）五、注意事项——细胞裂解菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。五、注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法五、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解菌体老化碱裂解不充分菌体中无质粒溶液使用不当请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养可减少菌体用量或增加溶液的用量不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。六、质粒DNA提取常见问题问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？

原因对策混有蛋白混有RNA混有基因组DNA不要使用过多菌体。重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质加入RNaseA室温放置一段时间加入溶液II和III后防止剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。六、质粒DNA提取常见问题问题二：质粒纯度不高，如何解决？

原因对策1.简要堤叙述炉溶液Ⅰ、溶预液Ⅱ和溶坦液Ⅲ的作颤用，稀以及挨实验克中匆分别单加入父上述漆溶液妙后，盖反应痛体系躲出现价的现巨象及膝其成兄因。2.染色否体DN并A与质握粒DN剖A分离记的主避要依吧据是基什么疲？七、修问题哥与讨弱论第二轧部分质粒DN铁A含量名测定10拾uL质粒DN岭A切+蒸馏疾水至3m好L混匀敏后，辩测定26饭0n扭m和28潜0n泼m的光攻吸收松值。纯的DN妥A伞A26疤0与A28判0之比漫应在1.撕80DN抛A盼(μg/m料l)＝A26阅0×稀释朝倍数×5执0第三傻部分PC鸣R根据Ge俭ne庸Ba夜nk，用醒软件Pr郊em徐ie惯r5.突0设计获引物芒，引热物序芝列如遇下：上游逐引物千：GA验AT色TC稀CA蜻AC徐CA倾CT堤AA章GT罚CC龟TG然AT贯TT稳C，Tm已=5糕5℃；下游果引物海：AC海GC波GT疯GA酸TA站GA旺AC剑TC碗AC山AA锡CA智CC横AT歇C，Tm随=5彻5℃；上游煮引物莫带有Ec懒oRⅠ酶切础位点垃，下线游引熔物带逝有Ml怜uⅠ酶切勾位点虎。PC途R反应肥体系智：重组袋单菌辩落固一牙茂签+斗1u课l锋H2O10演×b场uf楼fe童r2u裳ldN避TP0.天4u撤l上游鼻引物0.合8u辟l下游颂引物0.势8u来lTa辰q酶0.哑3u窝lH2O14运.7蜻ulPC慰R条件债如下好：95渴℃竭5m促in94塌℃如30探s57蜓℃劳30窜s星3桂0个循珠环72算℃事90施s72猎℃热10图mi择n进行1.横0%Ag狗ar赛os辫e电泳辛，检薄测扩老增结授果。第四幸部分个琼洗脂糖工凝胶染电泳相关铲知识电泳粉：泳奴动速网度决奥定于钞？琼脂储糖凝可胶天然孕琼脂粉（Ag沈ar）是一直种多惜聚糖秧，主疲要由葱琼脂按糖（Ag据ar灰os反e，约占80％）志及琼樱脂胶主（Ag渐ar着op诞ec罚ti馋n）组成泳。琼估脂糖科是由铺半乳伴糖及敏其衍匙生物栏构成逐的中造性物投质，手不带貌电荷历。而块琼脂启胶是私一种突含硫辨酸根牢和羧抄基的阔强酸象性多僵糖，婶由于矮这些著基团厦带有毛电荷记，在答电场站作用渠下能鸣产生兄较强钥的电邮渗现积象，壳加之司硫酸唇根可追与某沈些蛋译白质败作用孤而影轨响电受泳速病度及咏分离约效果昨。琼惩脂糖蛇透明饲无紫莫外吸炸收，因此期，目直前多北用琼界脂糖确为电厅泳支胶持物章进行貌平板税电泳纤。核酸盟分子僻大小魔与琼亚脂糖糖浓度贱的关绢系琼脂糖浓度

0.30.60.70.91.21.52.0线状DNA大小/kb

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