医学专题-CD147在胃癌细胞SGC7901增殖

RNA干扰抑制CD147表达对人胃癌细胞(xìbāo)SGC7901增殖、侵袭和顺铂敏感性的影响王书奎MD,PhD南京医科大学附属(fùshǔ)南京第一医院第一页，共四十九页。编辑课件报告(bàogào)内容研究背景(bèijǐng)研究目标实验方法与结果实验结论第二页，共四十九页。编辑课件一、研究(yánjiū)背景第三页，共四十九页。编辑课件胃癌(wèiái)概况

胃癌最常见的恶性肿瘤之一，恶性肿瘤致死占第二位。其恶性程度较高，转移扩散严重，多数患者(huànzhě)就诊时已属中晚期，因而死亡率较高。第四页，共四十九页。编辑课件MMP简介(jiǎnjiè)

肿瘤的侵袭(qīnxí)和转移是一个复杂的过程，其中细胞外基质和基底膜的降解是肿瘤转移过程中的重要步骤。这与细胞外基质金属蛋白酶（extracellularmatrixmetalloproteinase，MMP）的参与密不可分。第五页，共四十九页。编辑课件

MMP是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已发现26种。MMP的主要功能是降解细胞外基质。肿瘤(zhǒngliú)细胞利用MMP的基质降解能力迁移到其他部位。在肿瘤与间质交界处，MMP往往高表达。第六页，共四十九页。编辑课件

20世纪80年代，Biswas实验室从人肺癌细胞株LX-1的细胞膜上分离得到(dédào)了一种58kDa的糖蛋白，具有刺激成纤维细胞合成MMP-1的功能，将其命名为肿瘤胶原酶刺激因子（tumorcollagenasestimulatingfactor，TCSF）。第七页，共四十九页。编辑课件

进一步研究表明TCSF不仅能刺激MMP-1的产生，还能刺激MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-11等的产生，因此将其重命名为细胞外基质金属酶诱导因子（extracellularmatrixmetalloproteinaseinducer，EMMPRIN)。第六届人类白细胞分化抗原协作组会议(huìyì)将EMMPRIN命名为CD147。第八页，共四十九页。编辑课件CD147的结构(jiégòu)

CD147属单次跨膜糖蛋白，胞外段中的4个半胱氨酸残基形成2个二硫键，构成(gòuchéng)2个典型的半球形Ig结构域。

第九页，共四十九页。编辑课件

细胞内的CD147存在低糖基化（lowglycosylatedCD147，LG）和高糖基化（highglycosylatedCD147，HG）形式，分子量分别(fēnbié)是32~44kDa、45~65kDa。只有HG形式能刺激MMP的产生。第十页，共四十九页。编辑课件CD147的功能(gōngnéng)

CD147是一种广泛表达于细胞表面，在体内分布(fēnbù)广泛，参与精子发生、胚胎发育、肿瘤的侵袭和转移、炎症反应、病毒感染等多种生理和病理过程，是一个多功能的分子。第十一页，共四十九页。编辑课件

免疫组化实验证实CD147在多种恶性肿瘤(èxìngzhǒngliú)中高表达，包括膀胱癌、皮肤癌、肺癌、乳腺癌、淋巴癌和胰腺癌等。并且肿瘤的恶性程度越高，CD147的表达水平也越高。第十二页，共四十九页。编辑课件CD147在肿瘤发生发展(fāzhǎn)中的作用

1.促进肿瘤(zhǒngliú)的侵袭和转移

CD147就是通过刺激成纤维细胞及肿瘤细胞本身产生多种MMP来降解基底膜和细胞外基质，从而促进肿瘤的浸润和转移的。第十三页，共四十九页。编辑课件

2.诱导肿瘤血管(xuèguǎn)生成

血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowth

factor，VEGF）是很多情况下血管生成过程的主要调节因子，包括肿瘤形成过程。CD147可以诱导VEGF的表达。第十四页，共四十九页。编辑课件

3.促进肿瘤细胞多药耐药

在多种多药耐药的肿瘤细胞中都观察到CD147的高表达。CD147可激活(jīhuó)PI3K/AKT细胞存活信号通路。在大多数恶性肿瘤细胞中此通路均被激活。第十五页，共四十九页。编辑课件胃癌(wèiái)中CD147的表达

日本Toyama大学的ZhengHC等研究表明：在正常胃黏膜发展为增生性或化生性胃黏膜，最后(zuìhòu)发展为胃癌的过程中，CD147的表达量是逐渐增加的，并且CD147的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移以及MMP-2、MMP-9和VEGF的表达呈正相关。第十六页，共四十九页。编辑课件胃癌组织(zǔzhī)中CD147的表达CD147在胃癌组织(zǔzhī)中高表达第十七页，共四十九页。编辑课件二.研究(yánjiū)目标第十八页，共四十九页。编辑课件

本实验旨在运用RNA干扰技术抑制胃癌细胞株SGC7901中CD147基因的表达，研究该基因沉默后对肿瘤细胞生长、侵袭能力(nénglì)及化疗药物敏感性的影响，探讨CD147在胃癌中的作用。第十九页，共四十九页。编辑课件三、研究(yánjiū)方法及结果第二十页，共四十九页。编辑课件CD147shRNA真核表达载体的构建与鉴定↓转染SGC7901细胞，筛选稳定表达干扰载体的SGC7901细胞株↓MTT法检测SGC7901细胞增殖水平的变化↓明胶酶谱法检测SGC7901细胞MMP-2、MMP-9分泌(fēnmì)的变化↓SGC7901细胞体外侵袭力测定↓MTT检测SGC7901细胞顺铂敏感性的变化技术(jìshù)路线技术路线第二十一页，共四十九页。编辑课件

胃癌细胞株SGC7901源自一位56岁女性胃腺癌患者的淋巴结转移瘤。研究表明(biǎomíng)其侵袭能力强，恶性程度高。我们前期研究表明(biǎomíng)，该细胞表面CD147是高表达的。第二十二页，共四十九页。编辑课件shRNA（shorthairpinRNA）表达载体(zàitǐ)的构建pSilencer3.1-H1neo第二十三页，共四十九页。编辑课件shRNA模板(múbǎn)的设计示意图第二十四页，共四十九页。编辑课件干扰(gānrǎo)靶序列的选择

参考陈翔等的报道，选取CD147mRNA370-390和808-828作为靶序列，相应的shRNA分别命名为shRNA1和shRNA2。另外，设计一个阴性(yīnxìng)对照shRNA-control。第二十五页，共四十九页。编辑课件RNAi靶序列(xùliè)在CD147mRNA上的位置

1AGCGGTTGGAGGTTGTAGGACCGGCGAGGAATAGGAATCATGGCGGCTGC51GCTGTTCGTGCTGCTGGGATTCGCGCTGCTGGGCACCCACGGAGCCTCCG101GGGCTGCCGGCACAGTCTTCACTACCGTAGAAGACCTTGGCTCCAAGATA151CTCCTCACCTGCTCCTTGAATGACAGCGCCACAGAGGTCACAGGGCACCG201CTGGCTGAAGGGGGGCGTGGTGCTGAAGGAGGACGCGCTGCCCGGCCAGA251AAACGGAGTTCAAGGTGGACTCCGACGACCAGTGGGGAGAGTACTCCTGC301GTCTTCCTCCCCGAGCCCATGGGCACGGCCAACATCCAGCTCCACGGGCC351TCCCAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCGTCAGAACACATCAACGAGGGGGAGA401CGGCCATGCTGGTCTGCAAGTCAGAGTCCGTGCCACCTGTCACTGACTGG451GCCTGGTACAAGATCACTGACTCTGAGGACAAGGCCCTCATGAACGGCTC501CGAGAGCAGGTTCTTCGTGAGTTCCTCGCAGGGCCGGTCAGAGCTACACA551TTGAGAACCTGAACATGGAGGCCGACCCCGGCCAGTACCGGTGCAACGGC601ACCAGCTCCAAGGGCTCCGACCAGGCCATCATCACGCTCCGCGTGCGCAG651CCACCTGGCCGCCCTCTGGCCCCTCCTGGGCATCGTGGCTGAGGTGCTGG701TGCTGGTCACCATCATCTTCATCTACGAGAAGCGCCGGAAGCCCGAGGAC751GTCCTGGATGATGACGACGCCGGCTCTGCACCCCTGAAGAGCAGCGGGCA801GCACCAGAATGACAAAGGCAAGAACGTCCGCCAGAGGAACTCTTCCTGAG851GCAGGTGGCCCGAGGACGCTCCCTGCTCCACGTCTGCGCCGCCGCCGGAG901TCCACTCCCAGTGCTTGCAAGATTCCAAGTTCTCACCTCTTAAAGAAAAC951CCACCCCGTAGATTCCCATCAT第二十六页，共四十九页。编辑课件设计(shèjì)好的shRNA插入序列shRNA15'-GATCCGTCGTCAGAACACATCAACTTCAAGAGAGTTGATGTGTTCTGACGACTTTTTTGGAAA-3’5'-AGCTTTTCCAAAAAAGTCGTCAGAACACATCAACTCTCTTGAAGTTGATGTGTTCTGACGACG-3'shRNA2

5'GATCCGTGACAAAGGCAAGAACGTCTTCAAGAGAGACGTTCTTGCCTTTGTCATTTTTTGGAAA-3’5'AGCTTTTCCAAAAAATGACAAAGGCAAGAACGTCTCTCTTGAAGACGTTCTTGCCTTTGTCACG-3’shRNA-control5‘GATCCACTACCGTTGTTATAGGTGTTCAAGAGACACCTATAACAACGGTAGTTTTTTTGGAAA-3'5'AGCTTTTCCAAAAAAACTACCGTTGTTATAGGTGTCTCTTGAACACCTATAACAACGGTAGTG-3’第二十七页，共四十九页。编辑课件2、CD147shRNA表达(biǎodá)载体的构建：

将合成的三对片段分别用水浴中加热后退火备用(bèiyòng)，与经BamHI和HindIII双酶切的pSilencer3.1-neo质粒连接，构建成CD147shRNA表达载体，重组质粒分别命名为pSilencer-shRNA1，pSilencer-shRNA2和pSilencer-shRNA-control。第二十八页，共四十九页。编辑课件重组质粒测序鉴定(jiàndìng)结果DNA测序表明，3个重组质粒构建(ɡòujiàn)正确。pSilencer/shRNA1测序图（红线为插入片段）第二十九页，共四十九页。编辑课件转染及筛选(shāixuǎn)

脂质体转染48h后用含0.4μg/ml的G418的完全(wánquán)培养基筛选2周，然后改为半量维持。将抗G418的阳性细胞克隆用有限稀释法分离出来并逐步扩增以待进一步分析。筛选出的细胞克隆分别命名为SGC7901/shRNA1，SGC7901/shRNA2和SGC7901/shRNA-control。第三十页，共四十九页。编辑课件Real-timePCR检测(jiǎncè)CD147mRNA表达水平

与SGC7901相比，SGC7901/shRNA1和SGC7901/shRNA2细胞中CD147mRNA相对表达(biǎodá)量分别下降至72.4%和17.3%

。第三十一页，共四十九页。编辑课件1234HGLGCD147β-actinLane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-controlLane3:SGC7901/shRNA1Lane4:SGC7901/shRNA2HG代表(dàibiǎo)高糖基化形式的CD147，LG代表低糖基化形式的CD147。Westernblot结果与Real-timePCR结果相符。第三十二页，共四十九页。编辑课件接种细胞

培养细胞

加入MTT呈色

终止培养

比色

结果计算

抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)／对照组A值×100%

24h、48h、72h时间(shíjiān)点MTT细胞增殖(zēngzhí)实验第三十三页，共四十九页。编辑课件

与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比，培养24h、48h、72h后SGC7901/shRNA2细胞增殖(zēngzhí)能力均显著降低.而阴性对照组SGC7901/shRNA-control增殖能力无显著改变。第三十四页，共四十九页。编辑课件明胶酶谱法检测(jiǎncè)细胞上清中MMP-2和MMP-9的活性

明胶酶包括72kDa的明胶酶A（基质金属蛋白酶-2，MMP-2）和92kDa的明胶酶B(基质金属蛋白酶-9，MMP-9)。其作用底物(dǐwù)为基底膜中的Ⅳ型胶原和变性的间质胶原（明胶），其活性与肿瘤细胞侵袭和转移能力密切相关。第三十五页，共四十九页。编辑课件

明胶酶谱法是一种测定明胶酶活性的常用方法。收集细胞培养上清液，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法可将这两种明胶酶按分子量大小分开，显示两条负染条带，根据条带的面积(miànjī)和亮度可判定明胶酶的活性。第三十六页，共四十九页。编辑课件明胶(mínɡjiāo)酶谱结果MMP-2MMP-9

123Lane1:SGC7901.Lane2:SGC7901/shRNA-control.Lane3:SGC7901/shRNA2**BSGC7901/shRNA2细胞(xìbāo)上清液中MMP-2和MMP-9的活性明显降低第三十七页，共四十九页。编辑课件Transwell原理(yuánlǐ)

Matrigel是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质(jīzhì)成分，含有层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等。将Matrigel铺在Transwell侵袭小室的多孔滤膜上，能形成与天然基底膜极为相似的基底膜结构。第三十八页，共四十九页。编辑课件Transwell结果(jiēguǒ)穿过Transfer侵袭(qīnxí)小室的染成紫色的细胞（×400）SGC7901SGC7901/shRNA-controlSGC7901/shRNA2第三十九页，共四十九页。编辑课件SGC7901/shRNA2细胞(xìbāo)体外侵袭能力显著降低B*第四十页，共四十九页。编辑课件顺铂敏感性实验(shíyàn)

抗肿瘤药物(yàowù)顺铂的使用浓度以血浆峰浓度（Peak

PlasmaConcentration，PPC)为标准。参照Sondak等的报道，顺铂的PPC为3.0μg/ml。本实验中使用的顺铂浓度为：0.01PPC，0.1PPC，10PPC。细胞生长抑制率（%）=[1-OD(cisplatin＋）/OD(cisplatin－)]×100%第四十一页，共四十九页。编辑课件

与SGC7901和SGC7901/shRNA-control相比(xiānɡbǐ)，顺铂对SGC7901/shRNA2的抑制率显著增加***第