血液标本采集和血涂片制备

关于血液标本采集和血涂片制备第1页，课件共49页，创作于2023年2月第一章血液标本采集

和血涂片制备重点：血标本采集方法和血涂片制备技术难点：各种抗凝剂的优缺点和使用选择第2页，课件共49页，创作于2023年2月

第一节血液标本采集和抗凝剂选择血标本：全血：血细胞+血浆;临床血液学检查，血细胞计数、分类和形态学检查血浆：全血除去血细胞；血浆病理性和生理性化学成分的测定，内分泌激素、凝血因子（钙除外）、血栓和止血检查血清：离体后血液自然凝固后析出的液体成分（除纤维蛋白原等凝血因子）；临床化学和临床免疫学检查第3页，课件共49页，创作于2023年2月

一、采血方法

静脉采血法部位：主要是肘静脉。还可以在：手背、内踝、股静脉，幼儿可采用颈外静脉采血采血器材：一次性注射器采血步骤和注意事项：止血带压迫时间不能过长；注射器和容器必须干燥第4页，课件共49页，创作于2023年2月采血步骤选择适宜静脉，在臂扎上压脉带，于穿刺处皮肤做环形消毒让病人握拳，使静脉显露。左手拇指固定穿刺部位下端，右手持注射器，使针筒刻度向上，先以约30o角度沿静脉正面进针，穿过皮肤刺人静脉腔。见回血后，右手固定注射器，用左手缓缓抽出注射器针栓，至所需血量后，解除压脉带，放松拳头，以消毒棉签压住穿刺孔，拔出针头第5页，课件共49页，创作于2023年2月第6页，课件共49页，创作于2023年2月部位：中指或无名指尖内侧、耳垂；半岁以下拇指或足部，特殊人员视情况而定所用器材：采血针、吸管采血步骤及注意事项：避免交叉应严格实行一人一针制；穿刺的深度的适当，切忌用力挤压，以免混入组织液，影响检验结果。皮肤采血法（毛细血管采血法）第7页，课件共49页，创作于2023年2月部位：主要是肘静脉。采血器材：真空采血装置，头套式、头皮静脉式两种真空采血法（负压采血法）第8页，课件共49页，创作于2023年2月采血步骤及注意事项：利用真空贮血管中的负压原理，自动定量的将血液引入贮血管内；瓶塞穿刺针外具有止血护套，使用时请勿将其取下；采集血样后，针对有输液要求的病患者，医务人员可将软座与输液器相接进行输液，减少病人的静脉穿刺次数；一次性使用，用后销毁。

既有利于标本的收集运送和保存，又便于防止血液交叉感染，已开始在国内推广使用。第9页，课件共49页，创作于2023年2月第10页，课件共49页，创作于2023年2月方法学评价

静脉采血皮肤采血真空采血缺点不同抗凝剂的使用，限制了重复实验；价格高改变血液性质，影易于溶血、凝血响有形成分的形态;和可混入组织液环境污染优点标本代表性大，无价廉、快速、操作减少溶血，操组织液影响，适于简便，标本可直接作规范，防止临床研究，可重复测定交叉感染，保实验和追加其他实护环境验第11页，课件共49页，创作于2023年2月

质量控制患者：活动情况、精神状态、药物、年龄、性别标本采集等采血：操作规范溶血：采集、转移、保管、分离血标本处理：立即送检实验结果分析：药物、饮食的影响；密切结合临床第12页，课件共49页，创作于2023年2月

二、抗凝剂选择抗凝：用物理或化学方法除去或抑制血液中的某些凝血因子的活性，以阻止血液凝固

抗凝剂：能够阻止血液凝固的物质，称抗凝剂第13页，课件共49页，创作于2023年2月

乙二胺四乙酸（EDTA）盐抗凝原理：螯合钙离子使用方法：15g/L浓度EDTA和血液1：10适用范围：对血细胞形态、血小板计数影响小；影响血小板聚集和白细胞吞噬功能；不适合做凝血象检验及血小板功能试验

第14页，课件共49页，创作于2023年2月

草酸盐（sodiumoxalate）

草酸钠、草酸钾、草酸铵原理：草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固使用方法：草酸钠0.1mol/L和血液1：9适用范围：凝血象检查第15页，课件共49页，创作于2023年2月

肝素（heparin）

原理：低浓度时抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之间的作用，加强抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成,还能抑制凝血酶的自我催化及抑制因子Ⅹ的作用；高浓度时阻断凝血酶和纤维蛋白的反应适用方法：

1g/L浓度的肝素钠与血液1：10优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温适用范围：红细胞检验（红细胞计数、血红蛋白测定、红细胞比积）和多种生化分析第16页，课件共49页，创作于2023年2月

枸橼酸盐（枸橼酸三钠）

原理：螯合钙离子使用方法：配成109mmol/L的浓度和血液1：9106mmol/L的浓度和血液1：4适用范围：止血学检验、血沉、输血保养液（毒性小）第17页，课件共49页，创作于2023年2月

物理方法抗凝脱纤维蛋白：将血液注入有玻璃珠的器皿中，转动，纤维蛋白缠绕凝固于玻璃球，从而防止血成凝块。适

用于免疫学检验和红斑性狼疮细胞检查。第18页，课件共49页，创作于2023年2月

血液的贮存

1.血液标本检验前的预处理分离血清或血浆预温血浆或血清分离细胞

第19页，课件共49页，创作于2023年2月冷藏保存:血浆在4℃保存24h后，某些凝血因子活性减少95%。供血细胞分析仪使用的EDTA-k2抗凝全血应保存于室温，但不宜超过8h，如果在4℃保存可使血小板计数结果减低。

冷冻保存:要长时间保存血液中有活性的成分如凝血因子、酶类等，可采取分离血清或血浆后快速深低温冷冻的方式，冷冻的标本一般应避免反复冻融。

根据检验项目要求有些血液标本要求避光、隔绝空气等

2.血液标本的保存第20页，课件共49页，创作于2023年2月3.血液标本检验后的处理

血源性污染是医源性污染的主要来源之一，检验后的血液标本处理不当，其危害极大。对于检验完毕的血液标本首先要进行高压灭菌，然后再进行无害化处理。带有血液的检验器材要用消毒液浸泡。采血用的注射器要进行毁形、消毒并进行无害化处理。第21页，课件共49页，创作于2023年2月第二节血液涂片制备和细胞染色

血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，特别是对于各种血液病的诊断具有重要的价值，近年来血细胞分析仪的广泛应用，血涂片的观察也可作为判断仪器结果的简易方法。

血涂片的用途：血细胞形态学检验、网织红、异常寄生虫检验。

第22页，课件共49页，创作于2023年2月

一、血液涂片制备将推玻片向1的方向稍抽回，当血液充满推玻片的宽度后，以一定均匀的速度向2的方向滑动。第23页，课件共49页，创作于2023年2月图1-3血涂片制备示意图（上：侧面观，下：正面观）

第24页，课件共49页，创作于2023年2月[血涂片质量评价]均匀、厚薄、头体尾、边缘、两侧注意：血滴大，速度快、角度大----血膜厚一张良好血涂片的标准是：厚薄适宜、头体尾分明、细胞分布均匀、边缘整齐、两侧及两头留有空隙。第25页，课件共49页，创作于2023年2月第26页，课件共49页，创作于2023年2月第27页，课件共49页，创作于2023年2月

二、血液细胞染色

染料：生物学染色剂，将生物组织细胞和病原体染色，在显微镜下观察结构。发色基团和助色基团使生物学染色剂产生颜色和被染组织亲合。第28页，课件共49页，创作于2023年2月碱性染料：为阳离子染料，能接受质子，染细胞核的染料。如亚甲蓝、天青。酸性染料：为阴离子染料，能释放质子。主要有荧烷-氧杂蒽染料和偶氮染料两类，能结合细胞的碱性成分并染色，如血红蛋白、嗜酸性颗粒成分等。复合染料：同时具有阴、阳离子型的染料如瑞氏染料第29页，课件共49页，创作于2023年2月

细胞染色原理：

一般以它们的物理现象和/或化学现象为依据物理作用：毛细管现象、渗透、吸收、吸附作用等化学作用：a.染料的化学成分：助色基团的存在，碱性染料在溶媒中为阳离子型，易与组织和细胞内带负电荷的酸性物质结合；而酸性染料在溶媒中为阴离子型，与带正电荷的碱性物质结合。第30页，课件共49页，创作于2023年2月b.蛋白质的化学性质：蛋白质中的氨基酸含有不同数量的氨基（-NH2）和羧基（-COOH），同时还有其它活性基团。在游离状态时，-NH2获得一个H+变成带正电的-NH3+，而-COOH失去一个H+变成带负电的-COO-。分别与不同染料结合。

c.周围环境的酸碱度：如环境pH＜pI（pI为等电点），则蛋白质带正电，结合酸性染料；反之，pH＞pI，则结合碱性染料。第31页，课件共49页，创作于2023年2月

细胞染色法的类型

普通染色法：经物理和/或化学作用的吸附、结合荧光染色法：荧光染料，荧光显微镜细胞活体染色法：活体染料如灿烂甲酚蓝等细胞化学染色法：用化学反应显示细胞内某种成分细胞免疫化学染色法（应用单克隆抗体技术、酶标记技术）

第32页，课件共49页，创作于2023年2月

瑞氏染色法[瑞氏染料]

由酸性染料伊红（eosin,E-）和碱性染料亚甲蓝(methyleneblue,M+)组成有复合染料。亚甲蓝为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。市售美蓝中部分已被氧化为天青。伊红通常为钠盐。将伊红和美蓝溶解在甲醇中，即瑞氏染料。第33页，课件共49页，创作于2023年2月

[染色原理]

细胞的染色既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用，各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。因此，用本染料液染色后，在同一血片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。

M+CL+Na+E→ME+NaCL

美蓝伊红伊红化美蓝（瑞氏染料）

第34页，课件共49页，创作于2023年2月

图1-4瑞氏染色原理示意图

第35页，课件共49页，创作于2023年2月[PH对细胞染色有影响]

细胞各种成分均为蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制瑞氏染液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。第36页，课件共49页，创作于2023年2月[试剂]

Wright染液：瑞氏染粉0.1g,甲醇60.0ml甲醇：有强大的脱水力，可将细胞固定为一定形态，并使蛋白质沉淀为颗粒状、网状等结构，增加细胞与染料接触表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。磷酸盐缓冲液（PBS，pH6.4-6.8）：磷酸二氢钾（无水）0.3g，磷酸氢二钠（无水）0.2g,蒸馏水加到1000ml。配好后用磷酸盐溶液校正pH，塞紧瓶口备用。第37页，课件共49页，创作于2023年2月[染色方法]1.用蜡笔在血膜两头划线，平放于染色架上。2.加瑞氏染液覆盖血膜，固定1min。3.滴加等量或稍多的缓冲液，混匀，染色5-10分钟。4.用清水冲洗，待干后镜检。第38页，课件共49页，创作于2023年2月【质量控制】血膜要干透后才能染色，否则染色时易脱落.染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有关，一般染液淡、染色时间长些效果好。染液不能过少，以防蒸发沉淀。冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲，防止染料沉着。冲洗时间也不能长。染色过淡，可复染。染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用甲醇脱色.第39页，课件共49页，创作于2023年2月第40页，课件共49页，创作于2023年2月【染色结果评价】

正常情况：血膜外观呈淡琥珀色。在显微镜下红细胞染成粉红色，在厚薄均匀处略有碟状感。白细胞胞质中的颗粒能显示出各种细胞的特有色彩，细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。染色环境偏酸：则红细胞和嗜酸性颗粒偏红，白细胞核呈浅蓝色或不着色，染色过酸pH<3.5时，则呈现一片红色，白细胞中除嗜酸性颗粒外均不着色。染色环境偏碱：则所有细胞呈灰蓝色，微偏碱者红细胞暗红、白细胞颗粒深暗。嗜酸性颗粒可染成暗褐色甚至黑紫色或蓝色。中性颗粒也偏粗染成紫黑色，血膜过厚的地方呈绿色。第41页，课件共49页，创作于2023年2月姬姆萨染色法[原理]

吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。但本法对细胞核和寄生虫着色较好，结构显示更不清晰，而胞质和中性颗粒则着色较差。为兼顾二者之长，可用复合染色法。即以稀释吉姆萨液代替缓冲液，按瑞特染色法染10min。或先用瑞特染色法染色后，再用稀释吉姆萨复染。第42页，课件共49页，创作于2023年2月吉姆萨染料1.0g甘油66.0ml甲醇（AR）66.0ml[染色方法]1.甲醇固定干燥血膜3-5min2.将血膜在染