原理及操作流程详解

原理及操作流程详解演示文稿目前一页\总数三十七页\编于二十三点优选原理及操作流程目前二页\总数三十七页\编于二十三点Westernblot

原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。目前三页\总数三十七页\编于二十三点

在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。Westernblot

原理目前四页\总数三十七页\编于二十三点WesternBlot操作流程蛋白样品的制备（蛋白抽提、定量）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS凝胶制备、上样）转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色目前五页\总数三十七页\编于二十三点水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白样品的制备目前六页\总数三十七页\编于二十三点蛋白样品的定量(Bradford法

)原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。制作标准曲线（插入表格）检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95l0.15mol/LNaClNaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是：BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA

Protein

Assay

Kit)Bradford法蛋白定量试剂盒（Bradford

Protein

Assay

Kit)

。二、蛋白定量目前七页\总数三十七页\编于二十三点BCA蛋白浓度测定试剂盒BCA

法与传统方法相比，更简单、更稳定、更灵敏度。

BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很好，其不受大部分样本中其他成分的影响，对于5%以内的SDS、Triton

X-100、Tween

20、Tween

80具有很好的兼容性。BCA法测定蛋白浓度易受螯合剂、高浓度的还原剂影响。在BCA法测定蛋白浓度前，应尽量使EDTA浓度≤m10M;

DTT浓度≤1mM，2-ME≤0.01%。

BCA法在50～1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系，

其最小检出量为25μg/ml。目前八页\总数三十七页\编于二十三点

20-30ug

细胞/组织裂解物

100ng

纯化蛋白根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量上样量一致：每孔上样量保持一致上样前用loadingbuffer加热变性样本三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳目前九页\总数三十七页\编于二十三点蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动Anode-内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触Cathode+带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑的比较快.蛋白根据分子量大小分开标本加入到上样孔中目前十页\总数三十七页\编于二十三点-滤纸凝胶膜滤纸+目前十一页\总数三十七页\编于二十三点目前十二页\总数三十七页\编于二十三点四、WesternBlot

转膜

分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF或NC膜）PVDF膜：价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。目前十三页\总数三十七页\编于二十三点WesternBlot的具体步骤转膜

转膜准备目前十四页\总数三十七页\编于二十三点制作“三明治”“黑胶白膜”WesternBlot的具体步骤转膜

目前十五页\总数三十七页\编于二十三点WesternBlot的具体步骤转膜

转膜条件：推荐：100V，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。目前十六页\总数三十七页\编于二十三点WesternBlot的具体步骤转膜后检测：（立春红染色）

为检测转膜是否成功，可用相关染料对膜进行染色。1x立春红5min染色前染色后目前十七页\总数三十七页\编于二十三点五、封闭脱脂奶粉（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）BSAWesternBlot

膜封闭液（生物试剂公司提供）不能用于磷酸化蛋白！目前十八页\总数三十七页\编于二十三点六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与滤膜温育，室温小时或4℃过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温一小时或4℃过夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。目前十九页\总数三十七页\编于二十三点七、二抗与底物反应显色ECL化学发光显色

比较常用，结果容易控制，但是被催化是灵敏度差一点DAB显色

比较灵敏，是HRP最敏感的底物目前二十页\总数三十七页\编于二十三点WesternBlot

需要的主要试剂目前二十一页\总数三十七页\编于二十三点主要试剂1. 1.0mol/LTris•HCl（pH6.8）Tris(MW121.14)12.114g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至6.8），室温下保存。2. 1.5mol/LTris•HCl（pH8.8）Tris(MW121.14)18.671g蒸馏水100ml溶解后，（用浓盐酸调pH至8.8），室温下保存。3. 10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml如溶解困难，可在50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。目前二十二页\总数三十七页\编于二十三点4. 10％过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g蒸馏水1ml（现用现配，可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1.5mlEP管中，一次性多装几管，使用时加入蒸馏水水即可，溶解后，4℃保存，保存时间为1周）5． 四甲基乙二胺原液（TEMED）：4℃保存。6． 30%丙稀酰胺：4℃保存。7．5X电泳液缓冲液Tris（MW121.14）15.1g甘氨酸（MW75.07）94gSDS5.00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释5倍，通常取160ml配制成800ml即可。8．10X转膜缓冲液甘氨酸（MW75.07）151.1gTris（MW121.14）30.3g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸馏水，最加160ml甲醇，配制成800ml即可。（先加甲醇易产生沉淀）目前二十三页\总数三十七页\编于二十三点目前二十四页\总数三十七页\编于二十三点9． 10XTBS缓冲液Tris（MW121.14）24.2gNaCl80.0g蒸馏水至1000ml（浓盐酸调pH至7.6），溶解后室温保存。10．1XTBST缓冲液10XTBS缓冲液100ml蒸馏水900mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠，应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块，即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11．封闭液/抗体稀释液（5%脱脂牛奶)：

1XTBST缓冲液95-100ml脱脂奶粉5g溶解后4℃保存，可于一周内使用。目前二十五页\总数三十七页\编于二十三点WB需要试剂－膜常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜目前二十六页\总数三十七页\编于二十三点目前二十七页\总数三十七页\编于二十三点主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。WB需要试剂－蛋白质Marker目前二十八页\总数三十七页\编于二十三点WB需要试剂－一抗选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.选择合适的一抗：目前二十九页\总数三十七页\编于二十三点杂交需要试剂－二抗二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。二抗的使用：根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时。

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal.目前三十页\总数三十七页\编于二十三点杂交需要试剂－底物显色底物：操作简单，灵敏度低