免疫组化教程

word文档精品文档分享第一章免疫细胞化学根本概念及开展简史一．免疫细胞化学的根本概念免疫细胞化学〔immunocytochemistry〔或抗体〕的定位和定量的技术。应用免疫细胞化学技术可以在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在。从而为生物医学研究生命大分子，特别是那些对细胞化学方法来说尚无作用物或作用物特异性不强的酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的细胞化学手段。二．免疫细胞化学的开展简史1941年，等创立了荧光抗体法1959年，Singer创立了铁蛋白法1966年，Nakane等创立了免疫酶技术1971年，Faulk和Taylor创立了免疫胶体金法1976年，Bayer等提出了亲合组织化学法第二章免疫细胞化学相关的组织学和细胞学技术一．取材〔一〕组织标本的取材1.活检钳的刃口锋利，以免组织受挤压。2.取所需组织：主要病变区、病灶与正常组织交界区。必要时取远word文档精品文档分享离病变区的正常组织作为对照。3.为充分保存组织的抗原性,取材要快，尽量保持组织新鲜。〔二〕细胞标本的取材．印片法应用：活检标本、手术切除的标本。方法：新鲜标本以最大面剖开暴露病区，载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻片上，立即浸入固定液中－10分钟，取出自然枯燥，低温保存。优点：简便省时，细胞抗原保存较好。缺点：细胞分布不均重叠，影响标记效果。．穿刺吸取涂片法应用：实质器官的病变区。方法：①穿刺液较少时直接涂片，力求均匀。②穿刺液较多时，穿刺液滴入1－2毫升HanksRPMI1640液〕内，轻搅，500rpm离心－10分钟，弃上清，制成细胞悬液〔2x106细胞/ml,吸一滴于载玻片上，轻涂，干后固定。优点：细胞均匀。缺点：细胞易变形。．体液沉淀涂片法①细胞数多，取一滴直接涂片。②细胞数少，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10分word文档精品文档分享钟，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。．培养细胞①贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中。②悬浮生长的细胞：可用离心涂片法制成涂片。．离心涂片机法5~6，1000r/min，2min，50~100l。细胞悬液210考前须知：①防止脱片,②为节省试剂及便于镜下观察和计数，将细胞集中到直径5为宜。0.6-1.0cm圆圈内，细胞总数以10③粘液丰富的标本如胃液、痰液等未经特殊处理，不宜作免疫组化。二．固定〔一〕免疫组化的固定法选择最正确固定的标准最好的保存细胞和组织的形态构造。最大限度的保存抗原的免疫活性。固定有：〔〕物理固定：血膜空气快速枯燥，冻结枯燥。〔〕化学固定：固定方法1.浸润法〔immersionmethod〕4－24小时。word文档精品文档分享2.灌流法(irrigationmethod)麻醉动物，经动物左心室主动脉插管，生理盐水冲洗，注入固定液，组织在30分钟内取材。〔二〕重要的固定液．％中性缓冲福尔马林双功能交联剂。使组织间相互交联，保存抗原于原位。特点是对组织穿透性强，收缩性小，易使组织硬化而浸蜡困难。固定时间不宜过长。．4%多聚甲醛磷酸缓冲液适应性较广泛的固定液，固定时间不宜过长。．Bouin,s液对组织固定力强且较均匀。比单独醛类固定更适合免疫组化染色，4C。．Zamboni,s液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织的穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。6~18小时。．丙酮用于冰冻切片及细胞涂片的固定。固定较好，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好，染色效果稍差。4C，5－10分钟，枯燥后低温保存。．％乙醇word文档精品文档分享用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。固定效果差，可和其他试剂混合使用，染色较好。．AAF液：95-100%酒精85ml,冰醋酸5ml,浓甲醛〕〔三〕固定剂的选择各种抗原的最正确固定剂的选择见表。鉴于10%中性甲醛是国际最通用的固定剂，虽然它对保存Ig抗原方面较差，假设采用适宜的蛋白酶消化处理，进一步暴露抗原，结合使用敏感的免疫组化方法，如PAPABC固定时间可适当缩短至16-24小时。免疫球蛋白类抗原可选用含汞类的固定液，(如Zenker固定液)，或蛋白沉淀性固定液(如Bouin固定液，甲醛醋酸酒精固定液等)。扁桃体、淋巴结和骨髓还可用甲缩醛(formal-Saline)加2-10%醋酸，石蜡切片，能有效地保存Ig。肿瘤胚胎抗原(如甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA)对多种固定均稳定。一般可用中性福尔马林固定，石蜡包埋切片〕激素类中的多肽类激素宜选用Bouin。组织之中酶和一些组织特殊抗原(如肌球蛋白、凝血蛋白和第VIII凝血因子等)可用10%中性甲醛。待测抗原与固定液的关系抗原适用固定液word文档精品文档分享细胞外表抗原100%丙酮，95%乙醇，10%福尔马林，Bouin液免疫球蛋白Zenker固定液,10%福尔马林，95%乙醇，100%丙酮，酶，蛋白类10%福尔马林，Bouin液，95%乙醇，100%丙酮肽类激素Bouin液，10%福尔马林，固定液固醇类10%福尔马林，Bouin液补体95%乙醇，100%丙酮，10%福尔马林，Bouin液肿瘤胚胎抗原10%福尔马林，〔四〕考前须知免疫组化固定方法的原那么是：在保持细胞形态完好和所测抗原的前提下，应采用浓度最低的固定液和最短的固定时间。为此，固定组织时应该：．组织新鲜，尽早、尽快固定。．组织块尽量小(<220.4cm)。．固定液体积大于组织体积20倍以上。．固定后充分水洗，减少固定液造成的人为假象．针对抗原、染色法选择最正确固定方法。三．包埋和切片法固定的和未经固定的组织、细胞以及各种涂片和切片方法均可用于免疫组化，但其效果不同。〔一〕冰冻切片word文档精品文档分享优点：是能较好地保持抗原活性(尤其是外表抗原)和酶。冰冻切片简便快速，省去固定、包埋和切片处理等一系列繁琐步骤。不利于常规检查和长期保存标本，不如石蜡切片清晰。常用致冷切片和恒冷箱切片机(Cryostat)，以后者最正确，可制成4~6μm的薄片。组织切片可直接贴附于玻璃载片，或贴附于涂有明胶或histostik(商品粘附剂)的玻璃片上，以减少组织片脱落。为防止冷冻过程中冰晶形成，破坏组织构造和保持抗原，取材后立即将标本浸入深低温预冷的(干冰容器内，－70度)正已烷液内骤冷30-60秒，取出后再冰冻切片。切片最好尽快进展组化染色亦可吹干储存于片盒内，外包塑料袋，置于－20度低温冰箱，一个月内使用。置室温枯燥105-10分(未固定者)，即可进入染色程序。〔冰冻切片OCT包埋，置液氮液面上－20秒，低温保存。〕〔二〕石蜡切片一般厚约μm，切片于37度烘烤过夜，可置4度保存。切片前，固定的组织块需经酒精逐级脱水，二甲苯透明，再浸蜡包埋。各步骤时间均不宜过长(1-2小时)，以免组织变脆。〔石蜡切片①脱水、透明在4C进展。②浸蜡、包埋时石蜡温度低于600C〔三〕振动切片可把新鲜组织〔不固定不冷冻，或低浓度固定液稍稍固定〕切成word文档精品文档分享20~100m厚，漂浮免疫组化染色，检出阳性部位，后固定，常规电镜样品制备。适于免疫电镜细胞化学观察。〔四〕塑料包埋切片优点是组织块可同时用于光镜切片、半薄切片〔0.5~1.5m〕和电镜超薄切片。目前常用包埋塑料有两大类：甲基丙烯酸盐类和环氧树脂类。前者能较好地保存抗原，染色前不必脱去包埋材料，但切片易皱折。〔五〕超薄切片载玻片及盖玻片的处理和切片的附贴载玻片及盖玻片的处理①载玻片：清洗液〔酸〕浸泡－24小时，水洗，％酒精浸泡2小时后擦干或烤干。②盖玻片：清洗液浸泡2小时，或盐酸酒精浸泡后水洗，95％酒精浸泡，擦干。切片的附贴免疫组化染色过程较长，并需用含外表活性剂的缓冲液屡次浸泡切片。有的石蜡切片染色前要用蛋白酶消化。新鲜组织如用灌注法或浸润法固定后再作冰冻切片会失去粘附性。以上这些因素常常造成染色过程中切片的脱落。要防止这一问题的发生，常规的蛋白甘油附贴法已不符合要求。免疫组化染色中可选用的附贴剂。word文档精品文档分享(1)甘油—明胶：1%明胶100ml混匀，涂布载破片上，切片附贴后置多聚甲醛蒸气(80度)甘油12ml中1小时麝香草酚数滴(2)甲醛—明胶：1%明胶5ml涂布载片上，切片附贴后置37度温箱中1小时或过夜2%甲醛5ml(3)铬明矾---明胶：1%明胶与0.1%铬明矾(硫酸铬钾)等量混合后即可涂片。60C晾干。(4)多聚赖氨酸：Poly-L-Lysine0.5%多聚赖氨酸(MW>300，000)水溶液，涂布载片后，晾干或45C烤干，一周内应用。此溶液需冷冻贮藏。〔〕：3-AminopropyltriethoxysilaneAPES/丙酮〔1/50〕涂片晾干。〔〕APES和Poly-L-lysine〔PLL〕联合应用适于特别容易脱片的情况。第三章免疫细胞化学染色免疫细胞化学的类型根据标记物的性质，可将免疫组化染色法分为以下几种：(1)免疫荧光法(Immunofluorescencetechnique)(2)免疫酶法(Immunoperoxidasetechnique)(3)亲合组织化学法〔affinityhistochemistry〕(4)免疫金银法(Immunogoldtechnique)(5)其它：放射免疫法。此外，尚有根据染色及抗体滴加步骤，分类为直接法，间接法，桥法等。word文档精品文档分享一．免疫细胞化学染色方法及原理〔一〕免疫荧光技术(Immunofluorescencetechnique)1.免疫荧光直接法原理：优点：简单、省时、特异性强。缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。2.免疫荧光间接法原理：word文档精品文档分享优点：一种标记抗体可用于多种一抗〔只要一抗是同种动物产10倍左右。缺点：非特异性着色时机较多；染色时间长。3.双重免疫荧光标记法标本保存及封片介质①及时照相，可－0C暗处保存。②缓冲甘油液〔PH8.5〕0.5mmol/lPH8.5碳酸盐缓冲液19份混匀即用。荧光显微镜标本制作要求①载玻片光洁均匀，厚度，在0.8-1.2mm间，无明显自发荧光。有时需石英玻璃载玻片。②盖玻片光洁，厚度0.17mm左右。③切片不宜太厚。④暗视野荧光显微镜和油镜观察时，使用无荧光镜油，或上述甘油及液体石蜡。〔二〕免疫酶标技术(Immunoperoxidasetechnique)1.酶标抗体法通过共价键将酶结合在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进展细胞或组织外表或内部某种抗原成分定位观word文档精品文档分享察。HRP〔POD〕ALP直接法优点：简单、省时、特异性强。缺点：一种标记抗体只能检测一种抗原；敏感性差。间接法优点：与免疫荧光技术相比，此法终产物可在普通光镜下观察，切片可长久保存，反复观察。word文档精品文档分享2.非标记抗体酶法(1)酶桥法word文档精品文档分享优点：提高了敏感性。(2)过氧化物酶—抗过氧化物酶法〔peroxidaseanti-peroxidasemethod,PAP法〕1970年，Sternbergerword文档精品文档分享优点：敏感，适合于石蜡切片中微量抗原的检测。缺点：步骤多，费时，不适合临床常规检验。〔三〕亲合组织化学〔affinityhistochemistry〕word文档精品文档分享1.抗生物素(亲合素)—生物素—过氧化物酶复合物技术(Avidin-Biotin.-PeroxidaseComplextechniqueABC法)根本原理：．链酶亲合素－生物素－过氧化物酶复合物技术〔StreptAvidin-Biotin-PeroxidaseComplex，SABC〕根本原理：链酶亲合素是一种从链酶菌StreptomycesAvidinii培养物中提取的蛋白质，有四个生物素结合位点，亲和力高。是一种接近于更完美的生物素结合蛋白。生物素是一种水溶性维生素〔维生素H可以标记抗体和酶而不影响其活性。链酶亲合素同一定浓度的生物素化酶混合后，形成链酶亲合素－生物素－酶复合物。这种复合物至少存在一个尚未被生物素占据的亲和素结合位这种复合物即是SABC。word文档精品文档分享市售的试剂盒中SABC的A液和B液合二为一。SABC具有下述特点：．高敏感性。．低背景。．简便快速。．结果稳定。试剂盒分型浓缩型－过氧化物酶即用型－过氧化物酶：SABC浓缩型SABC－碱性磷酸酶(容易克制组织细胞中内源性酶的干扰，尤其是血液、骨髓、胃肠等富含过氧化物酶的组织，应用SABC－AP效果较好。)即用型－碱性磷酸酶SABC免疫组化双重染色试剂盒：(同时采用SABC－POD和－AP试剂盒进展免疫组化双重染色。)．葡萄球菌蛋白A技术〔StaphylococalProteinA,SP〕．凝集素〔组织化学〕技术凝集素(lectin)无脊椎动物和高等动word文档精品文档分享物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能凝集红细胞而得名。种类很多，常用的为植物凝集素，如：花生凝集素(Peanutagglutinin)PNAD-半乳糖刀豆素A〔Concanavalinensifomisagglutinin〕ConAD-葡萄糖特点：1〕能识别糖蛋白和糖肽，特别是细胞膜中复杂的碳水化合物构造〔碳水化合物抗原决定簇〕2〕具有多价结合的能力，能与荧光素、生物素、酶、胶体金及铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜、电镜水平显示其结合部位。一般认为，细胞膜上特定的糖基可用以区别细胞的类型及反映细胞在分化、成熟和细胞恶变中的变化。凝集素本身不是来源或参与免疫反响的产物，放此讲授，是由于凝集素具有某些亲合特性，能被免疫细胞化学技术方法所应用。word文档精品文档分享(四)免疫金银法(Immunogoldtechnique)二．免疫组化染色的重要环节．选择最正确的固定方法和制片方法．免疫组织化学中的对照实验由于影响免疫组化的因素甚多，染色中必须有阳性和阴性对照。①阳性对照片可选用其它组织标本并行固定、包埋、染色，并且经该抗体证实为中等阳性反响。②阴性对照片仍用上述一样程序，证实其免疫反响为阴性。待检标本上滴加PBS以及同种非免疫动物血清以代替第一抗体，用以检查抗体的特异性。假设仅滴加第一抗体的标本阳性，说明特异性高。免疫组化对照试验及判断标本号试验组阳性对照阴性对照替代抗体对照结论word文档精品文档分享1++－－受检标本含抗原2－+－－受检标本不含抗原3－－－－操作错误4++++非特异性染色5++－+非特异性反响6+－－－阳性对照差注：①第一批抗血清做一次对照实验即可。②必须用连续切片普通染色组进展对照。3.选择抗体的最正确稀释度最正确稀释度可提高染色的阳性率，获得染色的良好的对比。抗体浓度过高。反而会减弱抗原抗体的结合，甚至出现假阴性结果。抗体稀释的原那么是：①抗体的工作滴度(稀释后的应用浓度)高有助于减少污染蛋白的非特异着色，节省试剂。②选择所测抗原着色最强、背景着色最弱的滴度。③根据抗体和待染标本等具体情况，确定最正确工作滴度。④稀释液中常用0.01MPBS，但不宜放过久。欲放置抗体长久，可用Tris缓冲液稀释，或专用抗体稀释液。直接测定法：其它条件稳定，用于测定一抗最正确稀释度。选择抗体的最正确浓度一抗稀释度特异性染色强度非特异性染色背景强度word文档精品文档分享1:50＋＋＋＋＋＋1:100＋＋＋＋1:200＋＋－阴性对照－－在1:100与1:200间如上找出最正确稀释度。棋盘〔方阵〕测定法：欲测知二种以上抗体的免疫反响浓度，可测试比拟9X标本的阳性反响和背景着色。从下表可知，应采用1:20的第二抗体，并进一步在1:50-1:100之间寻得第一抗体的最正确工作稀释度。抗体的最正确滴度测试表第二抗体第一抗体稀释度1:501:1001:2001:20++++(++)++(－)+〔－〕1:40++〔－〕+〔－〕+〔－〕1:80+〔－〕+〔－〕+〔－〕注()内为背景着色假设应用三种以上抗体的染色法，如PAP法，ABC法，可按上表求得第二、第三抗体的最正确配伍滴度。之后可按商品说明选择第一抗体滴度，或按优选法求得高稀释度，逐步缩小优选X围，选中最正确滴度。稀释中，一般常微量加样品。最常用者为10μl、20μl、50μl、μl、和μl。抗体稀释后应充分混匀。．抗体的孵育时间word文档精品文档分享标本染色比照度愈大。使用高滴度抗体，可将切片置于4度冰箱内过夜(约18小时，以增强特异性着色而减少非特异染色，提高比照。为节省时间，加强反响亦可于室温下孵育20分钟，37度下孵育5-10分钟。假设标本中抗原很强，可适当延长孵育时间。孵育应在湿盒中进展。．其它注意滴加抗体时应适量。以抗体充分覆盖组织片为准，不可过多或过少。PBS洗涤抗体时应充分，且应防止使用同一PBS容器导致穿插反响。最终标本显色时，应用光镜控制和观察最正确显色反响和时—15着色为度。免疫细胞化学染色的考前须知①反响的pH值应以接近体液环境为宜，即组织片与各种标记抗体液应处于同一酸碱度〔pH7.0-7.2〕②为防止非特异沉着和穿插反响，各标记抗体液要在染色前经离心去沉淀③要特别注意载玻片是否处于水平位置〔滴染时〕，确保染色液覆盖整个切面。④染色反响要在保湿容器内进展，以防止染色液的蒸发干涸。⑤染色的抗原抗体反响要在37度或室温下进展。但对耐热能力差的抗原，要在4度低温下延长反响的时间。word文档精品文档分享四．免疫组化有关技术〔一〕抗体的保存C保存一年。稀释后C保存－3天、7天后抗体的保存4效价显著降低。〔二〕增强特异性染色的方法．蛋白酶消化法①0.1％胰蛋白酶0C水浴。消化5－30分钟。最常用。用前37②．4％胃蛋白酶37C消化5－30分钟。．抗原修复高温高压组织抗原修复①适用X围：大量常规福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复，效果优于微波法和直接煮沸法。②仪器设备：普通家用压力锅。③缓冲液：0.01M柠檬酸缓冲液，PH6.0。④方法：切片水化。缓冲液置于压力锅内加热至沸腾，放入切片，继续加热至喷汽〔扣阀至喷汽以－6－2分钟后，压力锅离开热源、1分钟后，自来水淋压力锅至室温，开盖，取出切片，蒸馏水冲洗3分钟x2次,PBS冲洗3分钟x2次。word文档精品文档分享⑤考前须知：用过的缓冲液弃去。加热时间不宜太长，否那么背景加深。组织抗原微波修复②仪器设备：家用微波炉，进口微波炉置“DEFROST〞档。③方法：去除内源性酶的切片置入盛有已煮沸缓冲液的耐热容0C，持续8－10分钟。取出容器至器中，继续加热至98－100室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS冲洗3分钟x2次。④考前须知：不可将切片从缓冲液中取出冷却。组织抗原直接煮沸修复②方法：切片水化。置入盛有已煮沸缓冲液的烧杯中继续加热10分钟。参加蒸馏水补充水分损失。烧杯离开热源，置流水槽内冷却至室温。蒸水冲洗3分钟x2次,PBS冲洗3分钟x2次。注：一般，对于不太熟悉的一抗染色石蜡切片时，应比拟一下抗原修复、胰酶消化和不做预处理的染色效果。如果石蜡切片无法作出满意的结果，那么应考虑用冰冻切片。．适宜的抗体稀释度抗体效价越高，工作液稀释度越高。抗体稀释度越大，孵word文档精品文档分享育时间越长。只有高稀释度时才能防止非特异性背景产生。尽量使用单克隆抗体〔MAB．孵育时间37C，30－60分钟。40C过夜〔约18小时〕或室温。．去污剂0.01-0.1%皂素，或0.04-0.2%TritonX-100处理切片，去除脂类，促进抗体进入细胞中。但是浓度过高会破坏细胞抗原和细胞膜构造。．显色增敏剂过氧化物酶底物中参加氯化镍、0.1N异吡唑、氯化铵、硫酸镍铵等可增强显色敏感度。〔三〕非特异染色和内源性过氧化物酶的消除法在免疫细胞化学染色中，常在非抗原部位出现阳性反响〔非抗原抗体反响出现的阳性反响〕，称为非特异性染色，致背景着色过深。非特异性染色，背风光过深其可能原因有：．粘片剂使用不当。．固定(如可因液中残存的游离醛基所引起)．切片或涂片太厚。．脱蜡不彻底。．未用酶消化处理切片或进展抗原修复。word文档精品文档分享．内源性酶未阻断。．标记抗体、I抗的不纯；抗体浓度过高，抗体的稀释度不够，反响后冲洗不充分。．血清封闭不够或血清溶血。．洗涤不彻底。10．底物呈色时间过久。11造成。去除非特异染色的方法：．血清封闭加一抗前，用与二抗同种动物非免疫血清封闭组织上带电荷基团，去除其与一抗的非特异性结合。必要时参加2－％牛血清白蛋白。也可用除制备一抗以外其他动物非免疫血清。室温或37度，30分钟。．缓冲液洗涤用缓冲液参加0.9%NaCL成为高盐溶液，充分洗涤切片。．尽可能高地稀释一抗。在组织中的红细胞、粒细胞含有较多的内源性过氧化物酶，word文档精品文档分享其它细胞和组织中也有少量。为此，实验中设法消除或抑制内源性过氧化物酶。去除内源性过氧化物酶的常用方法：3％HO2蒸馏水或PBS，或％H2O2甲醇，室温30min处理切片。去除内源性生物素的常用方法：生物素是一种辅酶，是在脱羧基酶、羧基转换酶等催化的代谢环节中所产生的羧基的中间载体，它存在于某些组织和细胞内，在应用ABC法，LSAB法，SP法SABC法染色时会与抗生物素结合而产生非特异性染色。和肝、肾、脑等组织的石蜡切片，在应用上述染色方法前应预先以0.01%的抗生物素和0.01%的生物素溶液分别作用20min除内源性抗生物素结合活性，每次作用后用PBS洗5min3次。内源性生物素封闭试剂：AvidinBiotinBlockingReagent(ABB)(市售)〔四〕显色时间的控制①着色太深可减少反响时间。②过氧化物酶显色时，HO2浓度较大使显色反响过快而致背景加深，过量H2O2又抑制酶的活性，故HO2浓度要适中。五。免疫细胞化学染色结果判定阳性细胞①阳性细胞染色分布类型：word文档精品文档分享胞浆细胞核细胞膜word文档精品文档分享②阳性细胞分布呈现灶性弥漫性。③阳性细胞染色强度不一。假设细胞间染色强度一样，常常提示为非特异性反响。④阳性反响定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布。而非特异性反响常常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。word文档精品文档分享⑤切片边缘、刀痕、皱折处或坏死挤压的细胞区、胶原结缔组但不能用于判断阳性。染色失败的原因假阴性①固定方法不对，抗原在石蜡切片中遭到破坏，尤其是不标准的石蜡标本。②未加一抗，或一抗与试剂盒中二抗不配对，或抗体失效，或抗体的浓度过低。③抗体孵育时间太短。④染色过程中切片枯燥，或未严格按照步骤操作如抗原修复和消化等预处理不当。⑤酶底物中HO2量少或失效。⑥复染或脱水剂使用不当。假阳性①粘片剂太厚。②局部多克隆抗体特异