东南大学生化王大勇第7章

Whydoyouneedtopurifytheprotein?SequenceanalysisStructuralstudiesRaiseantibodiesIdentifysitesofmodificationFunctionalstudies目前一页\总数六十九页\编于十八点Section1:Propertiesofprotein目前二页\总数六十九页\编于十八点蛋白质的酸碱性质对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷和负电荷恰好相等，也即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点。目前三页\总数六十九页\编于十八点蛋白质的酸碱性质目前四页\总数六十九页\编于十八点目前五页\总数六十九页\编于十八点Section2:SizeandshapeMethodsformeasuringproteinMW目前六页\总数六十九页\编于十八点蛋白质分子的大小和形状蛋白质分子量很大，相对分子量变化范围在6000-1000000或更大一些。测定蛋白质分子量的方法：1.根据蛋白质化学组成测定最低相对分子量2.渗透压法测定相对分子量3.蛋白质的扩散和扩散系数4.沉降分析法测定蛋白质相对分子量5.凝胶过滤法测定相对分子量6.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子量目前七页\总数六十九页\编于十八点bygelfiltration目前八页\总数六十九页\编于十八点目前九页\总数六十九页\编于十八点Electrophoresis/电泳目前十页\总数六十九页\编于十八点SDS—PAGE目前十一页\总数六十九页\编于十八点Electrophoreticmobilitydependson:ChargesMassorsizeshape目前十二页\总数六十九页\编于十八点SDS，有效变性剂，带负电荷巯基乙醇，打开二硫键蛋白质亚基在电场中的行为只与分子大小有关。目前十三页\总数六十九页\编于十八点Section3:ColloidpropertyandprecipitationProteinsolutionisahydrophiliccolloid(1-100nm);1)Whyareproteincolloidsstable?①hydrationmantle/水化膜②charges③Brownmovement目前十四页\总数六十九页\编于十八点1.蛋白质的胶体性质

分散相质点在胶体系统中保持稳定，需要具备3个条件：第一，分散相的质点大小在1～100nm范围内，动力学上稳定，在介质中作布朗运动；第二，分散相的质点带有同种净电荷，互相排斥，不易聚集成大颗而沉淀；第三，分散相的质点能与溶剂形成溶剂化层目前十五页\总数六十九页\编于十八点蛋白质的胶体性质蛋白质的分子大小属于胶体质点范围。蛋白质溶液是一种亲水胶体，蛋白质分子表面的亲水基团，如一NH2，-COOH,-OH以及–CO-NH-等，在水溶液中能与水分子起水化作用，使蛋白质分子表面形成一个水化层。蛋白质分子表面上的可解离基团，在适当的pH条下．都带有相同的净电荷，与其周围的反离子构成稳定的双电层。蛋白质溶液由于具有水化层——双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相当稳定的。蛋白质溶液也和一般的胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜。目前十六页\总数六十九页\编于十八点2.蛋白质的沉淀

如果条件发生改变，破坏了蛋白质溶液的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关。

盐析法

有机溶剂沉淀法

重金属盐沉淀法

生物碱试剂和某些酸类沉淀法

加热变性沉淀法

目前十七页\总数六十九页\编于十八点盐析法向蛋白质溶液中加入大量的中性盐（硫酸胺、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。一般不引起蛋白质变性;当除去盐后，复可溶解。目前十八页\总数六十九页\编于十八点有机溶剂沉淀法向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂（甲醇、乙醇或丙酮等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。有机溶剂沉淀法，如果控制在低温下操作并且尽量缩短处理的时间则可使变性速度减慢。目前十九页\总数六十九页\编于十八点重金属盐沉淀法当溶液pH大于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救就是因为它能和重金属离子形成不溶性盐，然后再服用催吐剂排出体外。目前二十页\总数六十九页\编于十八点生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如骤酸即2，4，6-三硝基酚、钨酸和碘化钾等。某些酸类指的是三氯醋酸，磺基水杨酸和硝酸等。当溶液pH小于等电点时，蛋白质颗粒带正电荷，容易与生物碱试剂和酸类的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。这类沉淀反应经常被临床检验部门用来除去体液中干扰测定的蛋白质。目前二十一页\总数六十九页\编于十八点加热变性沉淀法几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性是蛋白质天然结构解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。我国很早就创造了将大豆蛋白质的浓溶液加热并点入少量盐卤（含MgCl2)的制豆腐的方法，这是成功的应用加热变性沉淀蛋白质的一个例子。目前二十二页\总数六十九页\编于十八点Section4:GeneralprinciplesaboutproteinpurificationComplicatedandspecific“Blackart”目前二十三页\总数六十九页\编于十八点SELECTSOURCEOFMATERIALConcentration:

choosetissue,

organismwithhighproduction/concentrationof

targetproteinDevelopmentalstage:Doeslevelofproteinchangewithdevelopment?Subcellularlocalization

Useofexpressionsystem目前二十四页\总数六十九页\编于十八点ProteinpurificationPretreatment/预处理Roughfractionation/粗分级Finefractionation/细分级目前二十五页\总数六十九页\编于十八点

1.前处理

2.粗分级分离

3.细分级分离

目前二十六页\总数六十九页\编于十八点1.前处理植物组织和细胞：由于具有由纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用与石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌：整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波震荡，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）等。组织和细胞破碎以后，选择适当的缓冲液把所要的蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开，收集该细胞组分作为下步纯化的材料。目前二十七页\总数六十九页\编于十八点2.粗分级分离当蛋白质提取液（有时还杂有核酸、多糖之类）获得后，需要将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大．既能除去大量杂质（包括脱盐），又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法（如聚乙二醇浓缩法）进行浓缩。目前二十八页\总数六十九页\编于十八点3.细分级分离

结晶：蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。目前二十九页\总数六十九页\编于十八点电泳

前处理粗分离细分离生物组织

无细胞提取液破碎、差速离心、溶解膜蛋白等选择性沉淀法亲和层析离子交换层析精制后的蛋白质可结晶纯化凝胶过滤疏水层析吸附层析分段盐析、有机溶剂分级沉淀、凝胶层析目前三十页\总数六十九页\编于十八点Section5:MethodsforProteinPurificationTakeadvantageofthefollowingpropertiesofdifferentprotein.★molecularweight/MW★solubility★chargedifference★selectiveadsorption★ligandspecificity（亲和层析）★hydrophobicproperty目前三十一页\总数六十九页\编于十八点①dialysis/透析&ultrafiltration/超滤法Removesmallmoleculesorions②densitygradientcentrifugation密度梯度离心③gelfiltration/凝胶过滤法1、Accordingtosizeandshape目前三十二页\总数六十九页\编于十八点semi-permeablemembrane.Poresofmembraneareofacertainsize.Proteinstaysin;smallmoleculespassthrough.1)Dialysis／透析目前三十三页\总数六十九页\编于十八点半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器透析：是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：

玻璃纸（赛璐玢纸，cellophanepaper）

火绵纸（赛璐玎纸,celloidinpaper）

其他改型纤维素材料目前三十四页\总数六十九页\编于十八点2）超过滤（ultrafiltration）利用压力、抽滤（A）或离心力（B）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，可选择性的截留相对分子量不同的蛋白质。滤膜抽气滤膜离心AB目前三十五页\总数六十九页\编于十八点Sedimentvelocitydependsonweight,densityandshapeofaparticle.SucrosegradientPolysucrosegradient3)Densitygradientcentrifugation密度梯度离心目前三十六页\总数六十九页\编于十八点生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有蔗糖、氯化铯等。滴加样品离心管蔗糖密度梯度蔗糖浓度目前三十七页\总数六十九页\编于十八点4)GelFiltration／凝胶过滤层析ColumnmadeofporusbeadsSeparatesintermsofsizeBigproteinselutefirst目前三十八页\总数六十九页\编于十八点凝胶过滤

原理：它是60年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。目前三十九页\总数六十九页\编于十八点2.IntermsofsolubilityIsoelectricprecipitationSaltinginandsaltingoutOrganicsolventprecipitation目前四十页\总数六十九页\编于十八点1.等电沉淀和pH控制蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调至蛋白质混合物中某种成分的等电点pH时，这种蛋白质的大部分或全部将沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中这样沉淀出来的蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。目前四十一页\总数六十九页\编于十八点2.蛋白质的盐溶和盐析低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶(saltingin)。盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高。目前四十二页\总数六十九页\编于十八点3.有机溶剂分级分离（1）有机溶剂可以使蛋白质沉淀，主要有乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。（2）有机溶剂可以破坏水化膜。（3）有分级分离现象。（4）要求对有机溶剂低温预冷。目前四十三页\总数六十九页\编于十八点4.温度对蛋白质溶解度的影响在一定温度范围内，约0-40℃之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加，但也有例外，例如人的血红蛋白从0到25℃，溶解度随温度上升而降低。在40-50℃以上开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。目前四十四页\总数六十九页\编于十八点IsoelectricprecipitationProteinhaslowestsolubilityatpI.目前四十五页\总数六十九页\编于十八点Saltingin/SaltingoutSaltingINlowconcentrationsofsaltusuallyincreasesthesolubilityofchargedmacromolecules.SaltingOUThighconcentrationsofaddedsaltlowersthesolubilityofandtheycomeoutofsolution.EffectofK2SO4onthesolubilityofHb-CO目前四十六页\总数六十九页\编于十八点1)Electrophoresis电泳Chargedproteinsmovetowardtheoppositeelectrode.3.Basedonchargedifference目前四十七页\总数六十九页\编于十八点电泳电泳分离蛋白质；是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gelelectrophoresis）。凝胶可以是淀粉凝胶（starchgel）、琼脂糖凝胶（agarosegel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）。一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。目前四十八页\总数六十九页\编于十八点电泳技术分类垂直板电泳毛细管电泳水平板电泳电泳支持物滤纸凝胶薄膜圆盘电泳目前四十九页\总数六十九页\编于十八点聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯胺凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板，凝胶是由相连的二部分组成（小的部分是浓缩胶，大的部分是分离胶），这二部分凝胶的浓度（孔径大小）、缓冲液组分和离子强度,pH以及电场强度都是不同的，即不连续的。这样,电泳时样品首先在不连续的两相间积聚浓缩而成很薄的起始区带（厚度约为0.1mm），然后再进行电泳分离。目前五十页\总数六十九页\编于十八点PAGE&SDSPAGE

polyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝胶电泳目前五十一页\总数六十九页\编于十八点等电聚焦（isoelectricfocusing）原理:

在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其pK和pI值各自相异却又相近），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的pH区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：

高效率分离纯化蛋白质测定蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线性梯度目前五十二页\总数六十九页\编于十八点AssaypIofproteinbyIEF目前五十三页\总数六十九页\编于十八点2-dimensionalelectronphoresis目前五十四页\总数六十九页\编于十八点IEF,pISDS,MW目前五十五页\总数六十九页\编于十八点毛细管电泳

毛细管电泳：是在毛细管（2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳被认为是90年代最有影响的分离手段之一。已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。目前五十六页\总数六十九页\编于十八点2)

Ion-exchangechromatography

SeparatesproteinsonthebasisofchargeTwokinds:Anion/阴离子-exchangeCation/阳离子-exchange目前五十七页\总数六十九页\编于十八点离子交换层析

（ion-changechromatography）

原理基质疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用制备纯化生物物质定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度目前五十八页\总数六十九页\编于十八点常用的阳离子交换剂

离子交换剂可电离基团可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）磺丙基目前五十九页\总数六十九页\编于十八点常用的阴离子交换剂

AE-纤维素（弱减型）氨基乙基离子交换剂可电离基团可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）对氨基苯甲酸DEAE-纤维素二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex二乙基氨基乙基DEAE-纤维素（强减型）二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）二乙基（2-羟丙基）-氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）目前六十页\总数六十九页\编于十八点4.利用选择性吸附的纯化方法某些称为吸附剂的固体物质具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在自己的表面，吸附力的强弱因被吸物质的性质而异。吸附层析就是利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的的。典型的吸附剂有硅胶、氧化铝和活性炭等。目前六十一页\总数六十九页\编于十八点5.利用配体特异性亲和力的纯化方法亲和层析：利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力建立起来的一种有效的纯化方法。亲和层析经常只需要经过一步的处理即可将某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并且纯度相当高。亲和层析最先用于酶的纯化并从中得到发展，但现在已广泛地用于核苷酸、核酸、免疫球蛋白、膜受体、细胞器甚至完整的细胞的纯化。目前六十二页\总数六十九页\编于十八点亲和层析（affiuitychromatography）

应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a.理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到