用于基因克隆的载体

关于用于基因克隆的载体第1页，课件共113页，创作于2023年2月第二章分子克隆单元操作2.2

2.3

2.1

用于基因克隆的载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4

转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5

第2页，课件共113页，创作于2023年2月基因工程基本流程第3页，课件共113页，创作于2023年2月2.1用于基因克隆的载体质粒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒与噬菌粒人工染色体载体载体的基本概念第4页，课件共113页，创作于2023年2月一、载体的基本概念载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。载体的主要功能：运载：高效运载外源基因至受体细胞内维持：自主复制或整合至宿主基因组，以达传代目的扩增：使外源基因拷贝数增加（克隆载体）表达：为目的基因表达提供顺式元件（表达载体）第5页，课件共113页，创作于2023年2月2、载体应具备的条件可转移性：具有针对受体细胞的“亲缘性”或“亲和性”

可筛选性：具有合适的筛选标记

具有一定的装载能力：在插入外源基因后仍能有效转化宿主基因文库构建需要非常大的容量方便外源基因克隆：具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点

(或多克隆位点)可传代性：具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点

第6页，课件共113页，创作于2023年2月第7页，课件共113页，创作于2023年2月3、载体类型克隆载体（cloningvector）主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。表达载体（expressionvector)除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。1）按功能分主要有：第8页，课件共113页，创作于2023年2月3、载体类型自主复制型载体含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代。

穿梭载体装有针对两种不同受体的复制起点，便于基因克隆整合型载体不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。2）按传代特性分：第9页，课件共113页，创作于2023年2月早期发现的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒载体大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌-牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌-植物细胞穿梭载体。第10页，课件共113页，创作于2023年2月第11页，课件共113页，创作于2023年2月3、载体类型质粒（Plasmid)噬菌体（bacteriophage)/病毒(virus)考斯质粒（cosmid）噬菌粒（phagemid）人工染色体（YAC，BAC）3）按来源分：第12页，课件共113页，创作于2023年2月二、质粒(plasmid)质粒的生物学特性质粒载体的特点与类型几个重要的质粒载体质粒的制备与鉴定天然质粒质粒载体的稳定性问题第13页，课件共113页，创作于2023年2月（一）质粒的生物学特性质粒：是生物细胞内固有的、能独立于宿主染色体而自主复制、并能稳定遗传的一类DNA分子。*质粒常见于原核细菌和真菌中*绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA（covalentlyclosedcircularDNA)*质粒DNA的分子量范围：1-200kb大肠杆菌的质粒主要有F质粒（F因子）、R质粒（抗药性因子）和Col质粒（大肠杆菌素因子）第14页，课件共113页，创作于2023年2月1、质粒的自主复制性质粒是独立的复制子（replicon）：含复制起始位点（origin,ori)和控制复制频率的调控基因

能利用宿主细胞的DNA复制系统进行自主复制(ori)为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低,质粒必须控制自身的复制。在一定的生长条件下、在一定的宿主菌中,某一质粒的拷贝数通常是一定的。第15页，课件共113页，创作于2023年2月DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子（replicon）。一个复制子只含一个复制起点。细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的，而真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。第16页，课件共113页，创作于2023年2月质粒的复制调控：调控区紧邻ori，方便构建调控区编码RNAI（反义）和Rop蛋白，抑制复制引物RNAII与模板结合oriE.coliColE1

plasmid复制方向rop（+）RopRNAII（引物）RNAI3’5’5’3’63个氨基酸,提高RNAI的抑制缺失会如何？第17页，课件共113页，创作于2023年2月调控区编码抑制蛋白Cop，控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合PcopcopP/OrepreporiCopRep起始因子抑制蛋白质如何通过质粒改造提高质粒的拷贝数？第18页，课件共113页，创作于2023年2月根据质粒复制调控的严密程度，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒：1-5拷贝，如pSC101松弛型复制控制的质粒：30-50拷贝，如ColE1氯霉素扩增：在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。第19页，课件共113页，创作于2023年2月2、质粒的不相容性质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中的现象。不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容第20页，课件共113页，创作于2023年2月质粒的不相容性的分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。第21页，课件共113页，创作于2023年2月第22页，课件共113页，创作于2023年2月3、质粒的可转移性革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、部分Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定第23页，课件共113页，创作于2023年2月第24页，课件共113页，创作于2023年2月4、携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得宿主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性

抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成

细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义第25页，课件共113页，创作于2023年2月天然质粒的改造野生型质粒的缺点：

分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想改造策略：去掉复制和维持非必须序列；失活复制负调控序列；引入多克隆位点；引入理想的筛选标记基因pSC1018.8kb拷贝数5四环素抗性标记基因TcrColE16.5kb拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒氨苄青霉素抗性标记基因Apr野生质粒第26页，课件共113页，创作于2023年2月选择性标记：供重组子筛选用的遗传标记基因

多克隆位点（MCS）一段短的DNA序列，含有多种单一限制性核酸内切酶的酶切位点，是外源基因插入的位点。（二）质粒载体的特点与类型质粒载体关键元件：复制起点、选择性标记、多克隆位点复制起点：供自主复制用的由复制起始位点和调控基因组成的短序列第27页，课件共113页，创作于2023年2月质粒载体的特点：分子量小，便于操作易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架用途广泛缺点：装载量小（小于10kb），不能用来克隆大片段第28页，课件共113页，创作于2023年2月（二）质粒载体的类型人工构建的质粒载体根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒突变拷贝数控制基因拷贝数1000-3000扩增基因低拷贝质粒来自pSC101拷贝数小于10

表达某些毒性基因温敏质粒在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒含有测序通用引物互补序列整合质粒装有促进整合的基因，便于外源基因的整合穿梭质粒

装有针对两种不同受体的复制子，便于基因克隆表达质粒

装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒

装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选第29页，课件共113页，创作于2023年2月（三）重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制1、pBR322：

氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆

用自己所学的知识分析该质粒有何优缺点？第30页，课件共113页，创作于2023年2月pBR322质粒载体的优点：

1、具有较小的分子量；它的分子量为4363bp。克隆载体的分子量大小不要超过10kb。

2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。pBR322DNA分子中总共有24种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中9个限制酶切位点插入外源片断可以导致tetr

基因的失活；另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累1000~3000个拷贝。

第31页，课件共113页，创作于2023年2月第32页，课件共113页，创作于2023年2月抗药性标志的选择pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板第33页，课件共113页，创作于2023年2月

pBR322质粒载体的改良为了更加实用，人们对pBR322质粒进行了改良，得到许多pBR322质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。第34页，课件共113页，创作于2023年2月

PUC质粒：人们在pBR322的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。

第35页，课件共113页，创作于2023年2月2、pUC18/19：最优秀的常规克隆载体

拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序，T载体的母载体

装有多克隆位点（MCS）含AP和正选择颜色标记lacZ’第36页，课件共113页，创作于2023年2月

一种典型的pUC系列的质粒载体，包括以下四个部分：

1、来自pBR322质粒的复制起点（ori）；

2、氨苄青霉素抗性基因（ampr

）,但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的识别位点。

3、大肠杆菌β-半乳糖基因（lacZ）的启动子及编码α-肽链的DNA序列，此结构称之为lacZ’基因；

4、位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位点（MCS）区段。但它并不破坏该基因的功能。第37页，课件共113页，创作于2023年2月pUC18/19：正选择标记lacZ’的显色原理（α互补）pUC18/19PlaclacZ’MCSb-半乳糖苷酶的a-肽段ab5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷X-gal第38页，课件共113页，创作于2023年2月第39页，课件共113页，创作于2023年2月pUC质粒载体的优点第一，具有较小的分子量和更高的拷贝数;

仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体；具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定。第三，具有多克隆位点MCS区段．方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。第40页，课件共113页，创作于2023年2月3、T载体：克隆PCR产物用多克隆位点中某处线性化，加装碱基T，以便和PCR产物的A互补。pMD18-T？？？？第41页，课件共113页，创作于2023年2月

第42页，课件共113页，创作于2023年2月MCS第43页，课件共113页，创作于2023年2月T-vector两条链的3’端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个AT-A克隆第44页，课件共113页，创作于2023年2月第45页，课件共113页，创作于2023年2月4、pGEM：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达

注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6E.coliBL21（DE3）等第46页，课件共113页，创作于2023年2月第一次课所授重点内容的回顾第47页，课件共113页，创作于2023年2月第二章分子克隆单元操作2.2

2.3

2.1

用于基因克隆的载体DNA的体外重组（切与接）目的基因的克隆2.4

转化与扩增（转与增）转化子的筛选与重组子的鉴定（检）2.5

第48页，课件共113页，创作于2023年2月2.1用于基因克隆的载体质粒载体噬菌体或病毒载体考斯质粒与噬菌粒人工染色体载体载体的基本概念第49页，课件共113页，创作于2023年2月一、载体的基本概念载体（Vector）：是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。2、载体应具备的条件1、载体的主要功能3、载体的类型（重点）

1）按功能分；2）按传代特性分；3）按来源分穿梭载体有什么作用？？？？第50页，课件共113页，创作于2023年2月二、质粒(plasmid)质粒的生物学特性（几个基本概念）严紧型/松弛型；不相容性；氯霉素扩增质粒载体的特点与类型（关键元件、特点）重要的质粒载体（pBR322；pUC18/19；T载体）第51页，课件共113页，创作于2023年2月选择性标记：供转化子/重组子筛选用的遗传标记基因

多克隆位点（MCS）供外源基因插入的、由单一切点内切酶识别位点组成的序列质粒载体关键元件：复制位点、选择性标记、多克隆位点复制位点：供自主复制用的由复制起始位点和调控基因组成的短序列第52页，课件共113页，创作于2023年2月重要的大肠杆菌质粒载体松弛型复制1、pBR322：

氯霉素可扩增拷贝数50-100/cell用于基因克隆

第53页，课件共113页，创作于2023年2月2、pUC18/19：最优秀的常规克隆载体

拷贝数2000-3000/cell用于基因克隆和测序，T载体的母载体

装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’第54页，课件共113页，创作于2023年2月本次课内容

第55页，课件共113页，创作于2023年2月（四）质粒DNA的制备与鉴定实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法

质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱裂解法

质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法

质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间第56页，课件共113页，创作于2023年2月氯化铯密度梯度离心法：

对质粒的构象要求较高时采用用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs第57页，课件共113页，创作于2023年2月第58页，课件共113页，创作于2023年2月碱裂解法：

最常用用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁

加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物

加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA用无DNase的RNase去除残余的RNA

cccDNAL-DNAocDNA第59页，课件共113页，创作于2023年2月构型：l-DNAoc-DNAccc-DNA第60页，课件共113页，创作于2023年2月沸水浴法：

用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁沸水浴40秒钟离心，用无菌牙签挑去沉淀物乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA第61页，课件共113页，创作于2023年2月影响质粒DNA产量的因素（1）寄主菌株的遗传背景

一般建议使用endA基因发生突变的大肠杆菌寄主菌株，例如DH5α、JM109以及XL1-Blue等。EndA基因突变的结果，使大肠杆菌寄主细胞失去了合成具有功能活性的核酸内切酶I的能力，从而增进了所含有的质粒DNA分子的稳定性。所以从这类寄主细胞中制备的质粒DNA不仅在质量上有所改进，同时在产量上也得到了提高。（2）质粒的拷贝数及分子大小

质粒分子拷贝数的多寡和质粒分子大小是决定其DNA产量的重要因素之一。第62页，课件共113页，创作于2023年2月（五）质粒载体的不稳定性问题一、质粒载体不稳定性的类型分离的不稳定性：在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，有的细胞没有获得质粒DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体结构的不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。

一般而言，形成无质粒细胞的频率相当低，因此在一般情况下通过随机分配质粒亦能够得到稳定的遗传。第63页，课件共113页，创作于2023年2月二、影响质粒载体稳定性的主要因素

新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应

拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应

（五）质粒载体的稳定性问题不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，简称差度低差度-稳定高差度-不稳定质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体，它同样是造成质粒载体不稳定性的原因之一。重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖，

第64页，课件共113页，创作于2023年2月二、噬菌体或病毒DNA噬菌体：细菌的病毒，常开发为克隆载体病毒：动、植物的病毒，常开发为表达载体共同特点：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第65页，课件共113页，创作于2023年2月噬菌体基本知识一．噬菌体的结构及其核酸类型根据噬菌体颗粒的结构，可归纳为三种不同的基本类型：无尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型和线状体型。大多数噬菌体，都是属于第二种结构类型噬菌体的核酸，最常见的是双链线性DNA。除此之外，还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌体。有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。例如，T4噬菌体DNA中就没有C碱基。

二、噬菌斑：噬菌体细胞,导致寄主细胞溶解死亡.因而在琼脂培养基表面形成的空斑.

第66页，课件共113页，创作于2023年2月一般溶原性噬菌体的噬菌斑中央残存着已溶原化的细胞，故成为混浊噬菌斑。相反，烈性噬菌体则形成透明噬菌斑。第67页，课件共113页，创作于2023年2月噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。在溶菌周期噬菌体将其感染的寄主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，能产生出大量的子代噬菌体颗粒。我们将只具有溶菌生长周期的噬菌体叫做烈性噬菌体。

溶源生长周期，是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。具有这种溶源周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。现已知道，只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。

噬菌体基本知识第68页，课件共113页，创作于2023年2月（一）大肠杆菌的l噬菌体DNA1、l噬菌体的生物学特性：l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成

l-DNA是线性双链DNA分子，全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因lDNA两端各带有一个12bp的粘性末端，称为cos位点。噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状第69页，课件共113页，创作于2023年2月l噬菌体的基因组结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOSCos位点（12bp）头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA第70页，课件共113页，创作于2023年2月l噬菌体的两种途径第71页，课件共113页，创作于2023年2月l噬菌体的裂解途径——生活史E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解lamB受体：麦芽糖转运蛋白第72页，课件共113页，创作于2023年2月l噬菌体的裂解途径——l噬菌体的体内包装包装范围为原DNA的75-105%：36-51

kb体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51

kbDA串连多聚体先行θ复制，再经环滚式复制形成串联重复第73页，课件共113页，创作于2023年2月第74页，课件共113页，创作于2023年2月滚环方式（rollingcircle）D.S.DNA→

Nick→

leadingStrand→Elongation→

rolling第75页，课件共113页，创作于2023年2月l噬菌体的溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态

DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第76页，课件共113页，创作于2023年2月2、l-DNA载体的构建：1）缩短长度：按有效包装范围确定野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体第77页，课件共113页，创作于2023年2月插入型l-DNA载体：载量为0-14KB体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）改造后的长度正好为包装的下限，因而本身也能被包装，叫插入型载体第78页，课件共113页，创作于2023年2月插入型载体：

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等载体，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。LacZ基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。

第79页，课件共113页，创作于2023年2月第80页，课件共113页，创作于2023年2月取代型l-DNA载体：载量为10-25kb体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（51–26）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb（36–26）长度为40kb，在非必需区域有酶切位点，距离为14kb第81页，课件共113页，创作于2023年2月第82页，课件共113页，创作于2023年2月思考用取代型载体克隆外源DNA可能需要经过哪些步骤？第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的

DNA区段。第二，将上述所得的λ

DNA臂同外源DNA片段连接。第三，对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组

噬菌体。

第83页，课件共113页，创作于2023年2月2）删除重复的酶切位点，引入多克隆位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点可以怎么删除或引入？？除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点第84页，课件共113页，创作于2023年2月3）加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第85页，课件共113页，创作于2023年2月加装选择标记：imm434imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活，l-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑透明斑浑浊斑第86页，课件共113页，创作于2023年2月加装选择标记：lacZlacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑第87页，课件共113页，创作于2023年2月4）构建琥珀密码子的突变体（环保的需要）

琥珀型突变（sup)：由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。将野生型l-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种l-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株第88页，课件共113页，创作于2023年2月无义突变使UUG变为UAGLeu-tRNA阅读UAG密码子AUGUUGUAAAUGUAGUAAAUGUAGUAAAUGUUGUAAAACAUC

AAG

释放因子

抑制突变

LeuLeuLeu图14－17带有突变反密码子的tRNA可抑制无义突变第89页，课件共113页，创作于2023年2月3、l-DNA及其重组分子的分离纯化：将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期

加入l噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37℃培养1小时

用新鲜培养基稀释，继续培养4-12小时。这时噬菌体颗粒

密度已达1013-1014/L，大肠杆菌细胞已完全裂解

超速离心，沉淀噬菌体苯酚抽提，释放l-DNA

乙醇或异丙醇沉淀l-DNA

第90页，课件共113页，创作于2023年2月4、l-DNA重组分子的体外包装：l-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的第91页，课件共113页，创作于2023年2月5、l-DNA作为载体的优点：l-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌

l-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量重组l-DNA分子的筛选较为方便

重组l-DNA分子的提取较为简便

l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达

外源基因第92页，课件共113页，创作于2023年2月（二）大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA1、M13噬菌体的生物学特性：M13噬菌体的外型呈丝状M13

噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成

致使比其他区域的宿主生长慢,形成混浊噬菌斑M13DNA上至少有10个基因2700个外壳蛋白分子M13

噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长第93页，课件共113页，创作于2023年2月M13噬菌体载体

M13是一种含单链（+）DNA（ssDNA）的丝状大肠杆菌噬菌体，其基因组大小为6.4kb。这类载体主要用来获得大量的单链ＤＮＡ片段，这种单链ＤＮＡ片段在遗传学研究中主要用来测定ＤＮＡ序列（sanger双脱氧法）、基因的定点突变研究、异源双链DNA的分析等。第94页，课件共113页，创作于2023年2月 大小：6.4kb

结构：10个区基因间隔区（IS区）

含复制起始位点及可插入外源DNA的位点第95页，课件共113页，创作于2023年2月M13噬菌体的感染周期+DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA-DNAIIV第96页，课件共113页，创作于2023年2月2、M13DNA载体的构建与改造IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII野生型M13RF-DNAIIIVIIIVIIXVVIIIXVIIIM13mp系列载体lacZ‘polylinkerMCS插入多克隆位点和标记基因第97页，课件共113页，创作于2023年2月3、M13DNA载体的特点：使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外这在DNA定向突变中非常有用M13重组分子筛选简便被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb第98页，课件共113页，创作于2023年2月（三）病毒载体与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病

毒基因组DNA。动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性的病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒双链DNA病毒单链RNA病毒双链RNA病毒RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。第99页，课件共113页，创作于2023年2月动物病毒载体

(1)具有能在动物细胞中复制的复制起始位点(2)具有在动物细胞中能表达的选择标记(3)具有大肠杆菌质粒载体的复制起始位点、选择标记和多克隆位点目前常用的基因转移载体有：(1)猴空泡病毒(Simianvirus40简称SV40)；(2)腺病毒(Adenovirus)；(3)乳头状病毒(Papillomavirus)；(4)逆转录病毒(Retrovirus);(5)牛痘(Vaccinia)病毒;(6)牛疣病毒(Bovinepapillomavirus)等。第100页，课件共113页，创作于2023年2月考斯质粒（cosmid）考斯质粒载体的构建：考斯质粒是一类人工构建的含有1978年Collins和Hohn发明构建pHC796400bpTcrlfragmentcosoriAprPstIBamHISalIl-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体cossite-carryingplasmid1.8kb的l-DNA片段+pBR322片段装载范围为31-45kb三、考斯质粒与噬菌粒第101页，课件共113页，创作于2023年2月考斯质粒载体的特点：能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞

装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易不能体内包装，不裂解受体细胞第102页，课件共113页，创作于2023年2月噬菌粒（phagemidorphasmid）噬菌粒载体的特点：噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制起始位点以及质粒复制起始位点、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞

装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb）能像质粒那样在受体细胞中自主复制重组操作简便，筛选容易通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA第103页，课件共113页