版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领
文档简介
上海交通大学附属胸科医院
张杰Mutations
ofSome
Driver
Genes
in
Never-smoking
Women
With
AdenocarcinomaKRAS1.92%PI3K1.92%P531.92%Unknow17.31%BRAF1.92%EML4-ALK8.65%EGFR66.35%T790M/
EGFR
Mut
=
5开展项目
EGFR突变检测:
EGFR
19-21外显子序列突变检测
EGFR拷贝数量改变检测
K-ras
12-13外显子序列突变检测
ALK-EML4融合基因检测免疫组化法FISH方法RT-PCR方法
B-raf突变检测
ROS1突变检测Exon
19
deletions
andL858Raccount
for
approximately
85%
ofEGFR
TKmutationsConfer
sensitivityorresistanceUncleareffect
onsensitivity
toEGFR
TKIsEGFRtranscripttoEGFR
TKIsL688PV689MP694XV700D18E709XExons
1–16I715SL718PS720XG719A/SG735SV738FV742ADeletionsL730FP733L1920T751IS752YExon
17E746KD761YD761NA763VN765AS768IT783AL792PL798FG810SD770_N771
insNPGT790MExons
18–24N826SL833VL858RH835LL838VT847I21H850NV851XL861XExons
25–28I853TA859TG863DA864TE866KRiely,
etal.ClinCancer
Res
2006;
Murray,
et
al.JThoracOncol2008EGFR突变检测流程标本采集及病理评估DNA抽提及质控EGFR突变检测ARMS测序法
其它方法检测报告上海胸科医院2163例肺癌EGFR检测
腺癌1420
例236
例43
例阳性率
60.1%
(854
/1420)阳性率
17%
(40
/236)阳性率
53.5%
(23
/43)阳性率
18.5%
(10/
54)阳性率
33.3%
(17
/51)阳性率
46.3%(
163
/352
)
鳞癌
腺鳞癌
大细胞癌54例
低分化癌(NOS)
51
例
其它类型352
例检测方法67.7%328/216315.2%84.8%48.6%1835/2163EGFR突变率60.2%53.5%33.3%17%18.5%腺癌鳞癌大细胞癌低分化癌腺鳞癌KRAS基因检测腺癌
10/122腺癌且EGFR阴性10/488.2%20.8%肺癌个体化检测质量控制
检测标本
检测方法及试剂
实验室要求及检测人员资质要求
检测报告内容及格式临床标本与研究标本的差异其他分析前、分析后肿瘤细胞标本类型标本处理含量处理新鲜组织、蜡块、穿刺
随意性大,无组织、脱落细胞等固定方式、试剂、标本离体时间各异实际临床标本不定严格要求要求统一,被
统一的保存以病理所确认
及运送条件研究标本统一要求尽量统一标本是获得高质量检测结果的重要前提
标本来源标本相关问题
标本异质性
手术切除标本
气管镜活检标本
经皮穿刺标本
标本类型
标本的收集和储存
淋巴结穿刺标本
胸水/心包
细胞学标本
血清DNA标本及循环细胞取样中存在的问题
肿瘤的位置
肿瘤生长的部位有时难以进行内科穿刺活检,需要依靠外科手术活检取材
细针穿刺时使用的器材尺寸可能影响细胞的获取量及DNA的质量
由于无法保证每次都能取得足够的标本,需要一些适用于小标本的检测方法标本的获取
肿瘤标本获取的主要途径支气管镜(活检:中央型)手术(切除/切取)穿刺(活检:周围型)
以临床医生认为最容易获取的方式
原发病灶
/
转移灶肿瘤组织制备蜡块
切片
HE染色
确认癌细胞
胸水等肺癌的活检标本通常仅含有少量肿瘤细胞经支气管肺活检CT引导穿刺肿瘤
<正常细胞的5%标本处理
:•
离体后处理:及时切开、固定(尽快)•
固定液:10%中性福尔马林(pH≈7.0)(不推荐使用任何其它溶液)•
固定液量:
≥10倍体积•
固定时间:6~48小时适宜的切片:•
HE片确认*,癌细胞数≥200个
(不推荐依经验盲取)•
常规切片(4~5μm厚,普通载玻片)•
连续切片8~10张•
刀片:一次性(不推荐交叉使用)如何获取优质的标本:标本类型
石蜡组织:尽可能送检一年内的石蜡标本
石蜡切片:含肿瘤细胞越多越好(50%以上);组织部位面积约6mmx6mm以上
包埋组织:组织块不小于0.5×0.5×0.5(cm)
新鲜组织:比石蜡等处理过的旧组织,DNA保存得更完整,对PCR实验更有利,但一定要经病理学确认
含有肿瘤组织50%以上;重量≥10mg(约米粒大小以上),经PBS或生理盐水冲洗干净
取癌组织的中心位置组织块(避开坏死区域),固定于10%中性福尔马林溶液中,尽快送病理科如何获取优质的标本:标本类型
尽可能取得大标本进行检测
临床常用的取样方法取得标本量通常较少
内镜活检、穿刺活检、细胞学标本(支气管刷检,细针穿刺)
小标本检测失败率
53–66%(内镜活检与穿刺活检),而切除活检标本的失败率仅24%
标本中肿瘤细胞的含量也十分重要
组织标本富集
细胞学标本富集
直接测序要求使用肿瘤细胞含量较高(50–70%)的标本EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.如何获取优质的标本:标本异质性
分子水平的肺癌细胞存在异质性
肿瘤内异质性
原发部位与转移部位的异质性
肿瘤异质性可能影响研究结果
如果可行,至少取得3个代表性部位的标本进行检测EberhardDA,etal.JClinOncol2008;26:983-984.分子检测与靶向治疗的关键步骤临床采集合适的组织标本123选择合适的检测方法根据结果制定治疗方案基因突变检测影响因素---方法学因素ARMS
&PNA-LNAclampPCR/HRMA/dHPLCNested
PCR/SequencingPyroSequencingPCR/SURVEYORPCR/SequencingME-PCR/
SequencingPCR/RFLPTaqManqPCR:Real-timeDetectionqPCR:Real-timeDetection12PCRPCRPCRPCRPCRPCRPCRRFLPPCROOOOOOSURVEYORcleavageHetero-duplex1%~10%Clean-upClean-upPCRRFLPOOPyro-sequencingRxnOOOCapillaryElectro-OOOElectro-phoresisSizingdHPLCSizingSequencing345Clean-upRxnphoresisOOOOOSequencingRxnConfirmationbysequencingConfirmationbysequencingConfirmationbysequencing~10%Clean-upClean-upOOOCapillarySequencingSequencing3-10%10%3-12%Clean-upRxnOO20~30%CapillarySequencing67Clean-upO20~30%O=产物转移/加入试剂/开管操作CapillarySequencing<1%ARMS
vs.DNA测序结果成功率可分析检出率共计不可分析突变
无突变ScorpionsARMS**42
400
51.2%
100%
82例24
30.5%
70.7%
82例直接测序***
25
33*
肺癌手术石蜡切片标本检测EGFR基因突变**IPASS方法学***INTEREST方法学中华病理学杂志
2008;37(5):294-9.ARMSvs.DNA测序测序法ARMS1%敏感度25%石蜡组织标本成功率低高商用试剂盒流程与速度数据分析要求试剂成本无复杂/慢高有简单/快低相对低高相对高仪器成本低1.DacicS.AdvAnatPathol2008;15(4):241-247.2.中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组.中华病理学杂志
2011;40(10):700-702.EGFR基因突变检测方法的选择优化检测途径,最大限度提高检测敏感性、降低假阳性和假阴性率以获得可靠的检测结果对每个患者来说都至关重要
DNA测序在部分地区仍然是EGFR检测的金标准
其他方法,比如ARMS可能比直接测序更敏感,目前已被广泛应用
新的EGFR基因检测方法层出不穷,其检验效能有待进一步考证NCCN指南建议NSCLC患者检测ALK30ALK阳性NSCLC总患者数约为HER2阳性乳腺癌患者的70%,CML患者的3倍多EGFR阳性肺癌(新发病数)208923例ALK阳性肺癌(新发病数)34820例其他驱动突变肿瘤的每年发病数乳腺癌
HER2阳性患者49,631例CML10,000例左右ALK阳性肿瘤患者34,820例中国肿瘤登记年报,2012临床&病理特征:ALK融合
vsEGFR突变特征EGFR腺癌
TTF1+非粘液型不吸烟东亚EML4/ALK腺癌TTF1+粘液型组织学亚型吸烟状态人种不吸烟所有人种52y发病年龄性别66y女性男>女与EGFR突变人群相比,ALK融合人群年龄更轻Signal
pattern
ofVysis
ALK
Break
ApartFISH
KitFISH诊断橘红色与绿色探针相互临近或粘合:ALK阴性橘红色与绿色探针相互分离或单个橘红色探针:ALK阳性荧光原位杂交技术(FISH)1.
FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。2.
采用“分离”分析,基因倒位和ALK重排后,红色和绿色探针分开3.
≥15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1野生型ALK重排36ALK
FISH检测正常分裂丢失IHC用于检测ALK表达
采用高灵敏度的检测系统后,有越来越多的数据支持使用IHC作为初步筛查
灵敏度和特异度都可达到很高水准。
与FISH相比,IHC是一种更常规的技术,成本更低,且工作强度也更低ALK
IHCFISH患者1:IHC显示ALK强表达,FISH显示重排患者2:IHC显示无ALK表达,FISH显示无重排Mino-Kenudson
et
al.,
ClinCancer
Res2010;16:1561–1571.38Ventana
IHC试剂设计ALK融合蛋白:OptiviewAmplification
KitOptiview
DABIHC
Detection•
无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋D5F3
rabbittmonoclonalantibody白•
部分ALK融合蛋白表达较低Ventana
IHC的原理:•
使用具有高度敏感性和特异性的一抗——D5F3•
全自动仪操作,充分保证特异性•
独有Optiview扩增技术,充分保证敏感性FISH阳性标本使用IHC检测全自动VentanaIHC:信号扩增常规IHC:无信号扩增ALK-positive
NSCLC
byVysis
FISHandVentanaALKIHCD5F3rabbit
mAb
Controlrabbit
mAbALK
(+)
病例40腺癌伴有粘液分泌Vetana公司ALK抗体结果高分化腺癌有ALK表达8.8%5.7%91.2%检测方法比较
FISH:判读的主观性较强,检测证据难以存留。
Realtime
PCR:小样本RNA提取质与量难以保证。
根据标本的类型合理选择“免疫组化+Realtime
PCR”或“免疫组化+
FISH”
。2013年NCCN指南建议NSCLC患者检测ROS1
基因融合IfROS1
mutationstatus
isknownand
positive,maytreat
with
crizotinib.基因融合检测方法
荧光原位杂交技术(FISH)
免疫组织化学(IHC)
实时逆转录-聚合酶链反应(实时RT-PCR)荧光原位杂交技术(FISH)采用“分离”探针分析,ROS1
基因融合后,红色和绿色探针分开野生型ROS1基因融合阳性
有5-11%出现假阳性信号分离1,2,3
信号分离微弱,结果难以判断3
主观性强,受人为因素影响大
工作强度大,费时1.
VarellaGarcia
etal.,IASLC
2011;
Abs
#MTE36.12.Camidge
et
al.,
ClinCancer
Res
2010;
16:5581-55903.
Sai-Hong
,DrugDesign,Development
and
Therapy
2011,5:471-485ROS1检测
ROS1
是胰岛素受体家族的一种受体酪氨酸激酶;
ROS1
基因融合发生频率与检测方法/检测群体相关;
ROS1
基因融合主要发生于年轻、非吸烟、腺癌患者;
ROS1
基因融合病人对crizotinib敏感;
ROS1
融合状态可通过实时RT-PCR方法实现检测。FFPE质量要求FFPE
样本30%tumorcells5-10μM厚度的切片RNA提取RNA质量影响因素
组织离体到固定包埋的时间越短越好.
使用10%的中性福尔马林溶液
控制合适的组织厚度、福尔马林用量和固定时间.
组织包埋前应完全脱水,且包埋时使用低熔点石蜡
建议4℃保存FFPE样品固定时间对RNA完整度的影响
固定时间越长,长片段核酸扩增效率越差PLoS
One.2007Dec
5;2(12):e1261固定过程中样品大小对RNA完整性的影响
固定组织样本越大,RNA完整性越差PLoS
One.2007Dec
5;2(12):e1261不同保存温度对FFPE样品RNA完整性的影响FFPE样品保存温度越高,RNA完整性越差PLoS
One.2007Dec
5;2(12):e1261RT-PCR检测关键要素小结
确保样本中有至少30%的肿瘤细胞
需要5片的5-10
uMFFPE样本,太薄或太厚均不合适
RNA比DNA更敏感,样本正确的固定、包埋和保存对于RNA的质量起着非常重要的影响。
高质量的FFPE样本RNA提取试剂盒
PCR扩增子片段大小PCRampliconlengthFragmentation
ofRNA分子靶向基因检测质量问题
实验室:
达标
人员资质标准化检测人员上岗培训、上岗证书报告签发人员资质、分子病理医师实验条件;检测方法:方法越是灵敏,抗污染的问题越是突出标本来源:不同的标本,应相对采用不同的检测方法分子病理实验室质量要求
二.
PCR实验室要达标,通过国家验证
检测结果要做室间比对
国际间的室间比对
(
EMQN,
ESP,
ETOP
andESMO)
分子病理实验室要通过ISO15189认可关于EGFR突变检测共识(中华病理学杂志
2011年10期)
关于EGFR检测时间
活检:1小时内送病理科
及时固定于4%中性甲醛中
小标本6-12h
大标本6-48h
病理报告3个工作日(包括免疫组化)
EGFR5-7个工作日
总共10个工作日,完成全部诊断和检测工作关于EGFR突变检测共识
DNA提取:P
温馨提示
- 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
- 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
- 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
- 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
- 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
- 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
- 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。
最新文档
- 二手房购买协议书七篇
- 关于土地征用协议书
- 舞蹈症病因介绍
- (立项备案申请模板)铝型材模板项目可行性研究报告参考范文
- (2024)年产300万吨水稳站项目可行性研究报告写作模板立项备案文件一
- 2024-2025学年人教版七年级英语上学期期末复习 专题07 语法填空 【期末必刷15篇】
- 2023年天津市红桥区高考语文一模试卷
- 云南省保山市智源初级中学2024-2025学年七年级上学期12月月考道德与法治试卷-A4
- 2023年布展装修项目筹资方案
- 2023年可调控辊型四辊液压轧机项目筹资方案
- 2025高考语文步步高大一轮复习讲义教材文言文点线面答案精析
- 《工程勘察设计收费标准》(2002年修订本)-工程设计收费标准2002修订版
- 2024-2030年中国眼部保健品行业市场发展趋势与前景展望战略分析报告
- 2024山东能源集团中级人才库选拔(高频重点提升专题训练)共500题附带答案详解
- T-CCIIA 0004-2024 精细化工产品分类
- 低年级革命文化类课文教学探析
- TPM知识竞赛题库含答案
- 中国成人失眠诊断与治疗指南(2023版)解读
- 解析德意志意识形态中的难解之谜生产关系概念与交往形式等术语的关系
- 皮肤疾病超声检查指南(2022版)
- 国开机考答案-工程力学(本)(闭卷)
评论
0/150
提交评论