2023学年完整公开课版薄层扫描法

中药制剂分析技术薄层色谱扫描法ShandongCollegeofTraditionalChineseMedicine

1.定义薄层扫描法是供试品经薄层分离后,用一束波长、强度一定的紫外线或可见光对薄层板进行扫描，通过测定薄层板上的斑点对光的吸收强度或斑点经激发后所产生的荧光强度,将扫描得到的图谱及积分数据进行定量的方法。

2.特点设备简单、操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高、显色剂选择范围广、适用于多组分及微量组分定量等。薄层扫描法

一、仪器工作原理（一）薄层色谱扫描法的基本原理薄层色谱扫描法的测定原理是用长宽可以调整的一束波长、强度固定的光，对薄层板上的斑点进行扫描，通过测量斑点或被斑点反射的光束的强度变化，求出待测组分含量。薄层扫描法可分为吸收薄层扫描法和薄层荧光扫描法。薄层扫描法

1.吸收薄层扫描测定法

是用可见-紫外光的单色光对薄层板上色谱斑点进行扫描，根据扫描获得的吸光度随展开距离变化的图谱及积分数据进行定量的方法。根据测光的方式不同，吸收扫描测定法又分为透射法和反射法两种。

透射法是测定光透过供试品斑点后的吸收情况进行的定量方法透射法扫描

L-光源MC-单色器P-薄层板S-斑点PD-检测器薄层扫描法反射法是测定供试品斑点对光的反射情况进行的定量方法。L-光源MC-单色器P-薄层板S-斑点PD-检测器反射法扫描

薄层扫描法吸光度与物质的浓度及液层厚度间不呈线性关系的解决方法选择曲线中的直线部分进行定量分析采用Kubelka-Munk方程利用非线性方程定量薄层扫描法

2.薄层荧光扫描法

是通过仪器对供试品吸收可见-紫外光后发射的荧光强度扫描得到的吸收光谱及积分数据，求出供试品含量的方法。荧光反射法扫描L-光源MC-单色器P-薄层板S-斑点PD-检测器薄层扫描法当样品量很少时，斑点中组分的浓度与荧光强度呈线性关系，可按公式计算：F=2.3K/IoECL或F=KC式F=2.3K/IoECL中：F为荧光强度；Io为入射光强度；C为浓度；E为吸收系数；K为常数（与荧光效率有关）；L为薄层厚度。式F=KC中：C为浓度；

K为2.3K/IoEL之积。在薄层荧光扫描法中，常用斑点荧光强度的积分值（色谱峰面积）代替公式中的F，斑点中组份的含量代替公式中的C进行计算。薄层扫描法（二）薄层扫描仪的构造薄层扫描仪主要由主机（光源、单色器、供试品室、薄层板台架、检测器）及工作站组成。

1.光源包括紫外光源氘灯（200nm～370nm）；可见光源钨灯（370nm～700nm）；荧光光源氙灯或汞灯（200nm～700nm），其中汞灯为线光源，可提供特征辐射光谱。薄层扫描法

2.单色光器单色光器可以将光源发出的连续光分解为单色光。其主要由入射狭缝、出射狭缝、色散元件、平行光装置（准直镜）等部分构成。薄层扫描仪多采用光栅为色散元件。

3.薄层板台包括薄层板台架及驱动装置。

4.检测器检测器是用来检测和放大由供试品斑点透射、反射或发出荧光强度的装置。

5.工作站具有设定仪器参数、控制仪器工作条件和信号采集、处理计算和打印输出等功能的装置。薄层扫描法（三）仪器性能的检定

1.波长准确度的检查一是利用汞灯的特征光谱线对仪器的波长进行准确度检查。二用氘灯以反射方式对硅胶G的薄层板上的10mg/ml的磷酸氯喹水溶液斑点做光谱扫描，如在257±10nm和343±10nm有最大吸收峰，则准确度符合要求。

2.重复性测定系指同一薄层板上、同一供试品溶液相同浓度的数个斑点，扫描结果的相对标准偏差。以峰面积的积分值计算相对标准偏差。锯齿扫描的相对标准偏差应≤1.5%，线性扫描的相对标准偏差应≤2.0%.薄层扫描法（四）薄层扫描仪的工作流程

1.吸收薄层扫描法的薄层扫描仪工作原理

以CS-9301PC型双波长扫描仪为例。薄层扫描仪的光学系统结构示意图薄层扫描法2.薄层荧光扫描法的薄层扫描仪工作流程

以岛津CS-9000型双飞点扫描仪为例。

CS-9000型仪器的光学系统薄层扫描法二、含量测定（一）概述

1.原理

薄层扫描法含量测定有外标法和内标法两种方法，中国药典仅采用外标法。2.类型

根据对照品标准曲线性质的不同，外标法又分为外标一点法和外标两点法。薄层扫描法测定方式

供试品选择检测方法

含量计算薄层扫描法含量测定操作步骤溶液的制备薄层板点样展开扫描扫描波长对照品系统适用性试验

扫描方式薄层扫描法（二）操作步骤和方法

1.测试溶液的制备2.薄层色谱操作外表一点法和外标二点法的点样操作。（1）外标一点法（2）外标两点法外标两点法点样方法薄层扫描法

3.展开

4.系统适用性试验

（1）灵敏度的检测（2）分离度（3）重复性

5.上机扫描（1）检测方法选择（2）测定方式选择:反射法和透射法（3）扫描波长选择：

①单波长扫描法；②双波长扫描法;③薄层荧光扫描波长的选择单波长、单光束扫描仪光路图单波长、双光束扫描仪光路图

薄层扫描法（4）扫描方式的选择：①直式扫描（线性扫描)；②锯齿扫描（飞点扫描）；③圆形扫描；④倾斜扫描。扫描时，应自下而上扫描，不可横向扫描。扫描光束（点）的形状和大小，可通过调整狭缝的高度和宽度实现。线性扫描图

薄层扫描法锯齿扫描

薄层扫描法6.含量计算

（1）外标一点法：标准曲线通过原点。计算公式：C=F1·A

（2）外标两点法(随行标准法)：标准曲线不通过原点。计算公式：C=F1·A+F2

由C1=F1·A1+F2C2=F1·A2+F2得7.结果判断将测定结果与2010年版《中国药典》中的各品种项下标准进行对比，符合标准即为合格。8.注意事项

薄层扫描法三、案例（一）灵宝护心丹的含量测定供试品溶液的制备对照品溶液的制备薄层扫描含量计算本品每1g含牛黄以胆酸（C24H40O5）计，不得少于2.5mg。灵宝护心丹的胆酸含量测定采用的是何种方法？供试品溶液是如何制备的？课堂互动薄层扫描法（二）计算举例用薄层吸收扫描法测定黄连中小檗碱含量，由方法学考察证明工作曲线过原点。现进行如下实验，在同一薄层板上，分别取浓度为2.00μg/μl对照品溶液和供试品溶液（取生药黄连0.3000g，提取后定容为10.00ml）点样，点样体积为2μl，由薄层扫描仪测得峰面积为AR=58541.80，AX=78308.3，计算黄连中