凋膜止崩液对雌激素负荷去势大鼠

•:•敬请各位老师莅临指导！陕西中医学院凋膜止崩液对雌激素负荷去势大鼠P、PR、GnRHR的影响,、♦，实验目的(£>实验研究\3>实验结果3结论•研究不同剂量凋膜止崩液对雌激素负荷去势大鼠P、PR、GnRHR的影响，揭示药物在有效部位靶向干预条件下，HPOA（下丘脑-垂体-卵巢轴）调节通道靶端药物效应机制，探讨药物靶向治疗无排卵型功能失调性子宫出血（ADUB）的分子生物学机制，为药物的临床应用提供可靠的理论依据和实验依据。实验研究实验材料☆实验动物健康雌性SD大鼠，体重200g+20go购自西安交通大学医学院实验动物中心。☆主要药品及试剂凋膜止崩液制剂20ml,陕西中医学院药学系提供（组成成分：鸦胆子、莪术、延胡索）☆主要实验仪器和设备实验研究___实验方法A组:空白组（假手术组）B组:模型组（去势手术+体内雌激素诱导）」C组:小剂量组（模型+凋膜止崩液小剂量）,D组:大剂量组（模型+凋膜止崩液大剂量）B组：行去势手术，术后第三天起肌肉注射苯甲酸雌二醇0.15mg/100g体重，隔日一次，连续4周。于第5天双侧宫腔注射0.9%生理盐水0.3ml/侧。A组：开关腹手术，术后第三天起用高压灭菌花生油0.3ml/200g体重，隔日肌注一次，连续4周，观察大鼠性周期，于动情前期处死取样。C组：手术步骤及苯甲酸雌二醇给药同B组，于给药后第5天双侧宫腔注射凋膜止崩液小剂量。D组：手术步骤及苯甲酸雌二醇给药同B组，于给药后第5天双侧宫腔注射凋膜止崩液大剂量。实验研究实验方法•大鼠局部宫腔用药，去除子宫内膜增生过长的相关研究尚未有明确报道，各组大鼠宫腔的用药量则是根据临床人的常用量为0.05g,按各组宫腔内注药量9有效部位提取率及人与大鼠体表面积比，结合前期实验研究的数据，计算出的每100克体重大鼠的宫腔灌注量，确定的给药剂量分别为：•:・C组：0.0005mg/O.3ml/侧♦D组：0.001mg/0.3ml/侧—实验方法♦:，放射免疫法测定血清中孕激厂一一一^一一^素含量「观测指标一J•:•连续阴道涂片查大鼠性周期•:•子宫内膜PR、GnRHR免疫组织化学染色采用SPSS17.0统计软件处理，实验结理数据符合正态分布及方差齐性，以均数土标准差（X土S）表示,组间差异比较用单因素方差分析，以PC0.05为有统计学意义，以P<0.01为有显著性差异。实验研究L标准管加膜式电动吸引器吸取上清液Q烦寐动36。"心’1标准管、3ml-5ml3500r/min（NBS、A、B、C、D、E、F、G）+200卩I标准品加分离剂500|jlOng/ml.Ong/ml、0.lng/ml.0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/mk30ng/ml>100ng/m+标记物200（dl1+抗体200卩1（除NSB中加蒸4奪K）37°C电热恒温水箱30minUZ连细I道涂片查大鼠，關甄二＞,，•大鼠性周期分为四个时期，以动情前期的雌激素水平相对较高，促进子宫内膜的增生较好，利于受体指标的测定及分析子宫内膜的生理生物学机制。•用细棉签以0.9%生理盐水湿润后轻轻插入大鼠阴道内约0.5cm,慢慢转动一下取出，将带有阴道分泌物的棉签在载玻片的后1/3处均匀转动、涂片，在空气中干燥，放入95%酒精中固定，HE染色，然后在显微镜下观察阴道涂片的细胞学变化，以确定大鼠动情周期的不同阶段。1DAB显实验研究色二2复染ZX2尹片免疫组化染色强度评定参照Salvesen评分方法，显微镜下观察增生过长子宫内膜细胞胞核或胞浆甲出现的棕黄色或褐色颗粒为阳性细胞，细胞结构清晰，染色颗粒定位良好，颗粒染色明显高于背景。每张切片随机连续观察5个高倍镜视野，每个视野观察100个细旋中阳性细砲的个数，求平珀值，并由此计算出阳性细胞的表达率。____—53^MP^GnRHR免疫组纪碍染色一二实验结果血清中孕激素水平各组大鼠血清孕激素含量的比较组别空白组模型组小剂量组大剂量组动物数10101010P(ng/ml)12.25±6.69。20.90±16.7161.73±52.00，56.52±53.19bd注：与模型组比较,aP<0.01,bP<0.05,cP>0.05;与小剂量组比较,dP>0.05。实验结果血清中孕激素水平IIbd孕激素孕激素空白组对照组小剂量组大剂量蛆注：与模型组比较，aPvO.01,bPv0.05,cP>0.05;与小剂量组比较，dP>0.05o图1各组血清孕激素示意图实验结果血清中孕激素水平血清中孕激素水平：与空白组比较，模型组P值仅轻度增高，无统计学意义（P>0.05）;与模型组比较，小剂量组、大剂量组孕激素水平有不同程度的升高，小剂量组有显著性差异（P<0.01）,大剂量组有统计学意义（P<0.05）小剂量组与大剂量组之间无统计学意义（P>0.05）。'实验结果子宫内膜PR的表达各组大鼠孕激素受体阳性细胞的表达组别空白组模型组小剂量组大剂量组动物数10101010PR16.30±11.94a30.58±20.105.14±3.11b2.97±1.85bd注：与模型组比较，aP<0.05,bP<0.01,cP>0.05;与小剂量组比较,dP>0.05o实验结果子宫内膜PR的表达孕激素受体空白组模型组小剂量组大剂量组图2各组大鼠孕激素受体表达示意图注：与模型组比较，aP<0.05,bP<0.01,cP>0.05;与小剂量组比较，dP>0.05。A组：阳性细胞呈少量、散在分布B组:呈现较多含棕黄色颗粒的阳性细胞C组：少量白细胞浸润，可见阳性细胞D组：大量白细胞浸润，偶见阳性细胞(10x20)实验结果子宫内膜PR的表达：•子宫内膜PR的表达：孕激素受体（PR）阳性细胞核内呈现棕黄色颗粒，空白组大鼠子宫内膜可见PR阳性细胞呈少量散在分布；模型组大鼠子宫内膜PR阳性细胞密度有所增强，二者阳性表达率有统计学意义（P<0.05）;小剂量组及大剂量组PR阳性细胞明显降低，甚至无，与模型组比较有显著性差异（PV0.01）;小剂量组与大剂量组之间无统计学意义（P>0.05）。―/实验结果子宫内膜GnRHR的表达各组大鼠促性腺激素释放激素受体阳性细胞的表达组别空白组模型组小剂量组大剂量组动物数10101010GnRHR12.16±8.62c14.01±8.285.16±3.10b3.48±2.13bd注：与模型组比较，aP<0.05,bP<0.01,cP>0.05;与小剂量组比较,dP>0.05o实验结果子宫内膜GnRHR的表达空白组模型组小剂量组大剂量组图4各组大鼠GnRHR表达示意图注：与模型组比较，aP<0.05,GnRHRbP<0.01,cP>0.05;与小剂量组比较,dP>0.05。实验结果子宫内膜GnRHR的表达A组：阳性细胞呈少量、散在分布B组：阳性细胞质、细胞浆内呈现棕黄色颗粒C组：少量白细胞浸润，可见阳性细胞D组：大量白细胞浸润，偶见阳性细胞(10x20)实验结果子宫内膜GnRHR的表达•促性腺激素释放激素受体（GnRHR）阳性细胞质、细胞浆内呈现棕黄色颗粒。空白组大鼠子宫内膜可见GnRHR阳性细胞呈少量、散在分布，模型组大鼠子宫内膜GnRHR阳性细胞密度无明显增强，二者阳性表达率无统计学意义（P>0.05）,小剂量组及大剂量组阳性细胞明显降低，甚至无，与模型组比较有显著性差异（P<0.01）;小剂量组与大剂量组之间无统计学意义（P>0.05）。在进行正式实验之前，根据前期的动物实验和临床观察系列研究，有步骤地进行了周密的预实验，为正式试验奠定了良好的基础，预实验的结论如下：①模型：腺体发育及背靠背现象|&最佳珀药方法和用药剂量,子宫内膜去除厚度理想；'③大鼠无?明显毒性反应「④人与Q鼠的用药比例，为临床合理用药奠定知出；為从造膜奇局部用药，解剖学的相关研究趋于成熟，为分子生物学研笆打下基答实验结果讨论A结合人与大鼠的用药比例大鼠卵巢切除大鼠子宫内膜、阴道粘膜细胞与人一样，受排卵前后雌、孕激素水平的影响而发生周期性的变化人电子显微镜下显示：大鼠子宫内膜厚度增加，腺魏鬻毎齬备细月包病理切片苯甲酸雌二醇肌注多或暂持子膜诸RH生的，内界Gn发膜抗宫外，面内拮子或节方宫的的部调节子素致内互调对激导体相或素孕而机的出激之生是0A释雌缺增的HP在，而续O血响素化激持长功影激变刺膜过素巢性性内生因卵即续宫增讨论•功血的局部治疗以破坏和消融内膜甚至浅肌层为重要途径，现代多采用子宫内膜电切除术，冷冻、微波子宫内膜去除术和宫腔灌注顺柄、无水乙醇、止血消炎药等治法。但每种方法都不同程度的存在着一定的弊端：如术后并发症，且药物治疗的远期疗效作用机制尚不明确，无确定的较为理想的治疗方案，故本实验未设立阳性对照药物组，而是采用了组间相互对照的原则，用开关腹空白组、模型组和两个不同剂量组进行比较，更好的显示由空白组、模型组与药物组之间的差异。窿调ER、抑制雌激素介导的肿瘤基因、、转录，抑制癌细胞的生长、促进雌激素从细胞内排出，拮抗雌激素，对下丘脑■垂体.卵巢轴负反馈调节，抑制FSH和LH的分泌，抑制GnRH的分泌。在子宫内膜腺上皮内表达PR。丿（P、PR）采用天然安宫黄体酮及合成黄体酮拮抗雌激素，逆转子宫内膜增生过长和子宫内膜腺癌的治疗。实验结果讨论生理学机制〔孕激素子宫内膜增生过长临床研究I讨论箋顫旨标（GnRHR）•GnRH由下丘脑神经内分泌细胞合成，其刺激黄体生成素LH和促卵泡素FSH的合成与释放，调节卵巢和黄体的正常发育，维持正常生殖生理功能。（生理功能）•性激素可调节GnRH的分泌，GnRH可促进其效应细胞产生更多的GnRHR,GnRHR是介导GnRH功能必不可少的物质。看研究表明子宫内膜受到GnRH的直接和/或间接的作用，GnRH与其作用部位的受体结合产生效应，作用的大小与作用部位受体的水平有关。（效应机制）•GnRHR在生育年龄女性整个月经周期的子宫内膜中均有表达，无论是在增殖期还是黄体期的子宫内膜上。也有研究发现在单纯型增生子宫内膜、复杂型增生子宫内膜、非典型增生子宫内膜组织中均有不同程度的表达。（生理病理表达）讨论孕激素属于类固醇激素，传统理论认为人体类固醇激素在肾上腺皮质、性腺和胎盘组织中合成,这些类固醇激素分别调节人体各种生理功能及代谢过程。近年来的研究表明神经系统自身也可以合成并分泌类固醇激素，不需外周内分泌腺的帮助，实验中大鼠已经去势，所以孕激素只可能由肾上腺皮质或由神经苗体细胞通过代偿直接分泌实验结果讨论结合30-羟类固醇脱氢异构酶上腺皮月DL受体胆固醇n［转运蛋白胆固醇脂—游离胆固醇至邀素合成j損理＞细胞色素P450侧链裂解酶律经胶质细月线粒体/实验结果