DNA重组技术与基因工程

PPT制作：XX、XX资料收集：XX、XX讲解：XX、XXDNA重组技术与基因工程目前一页\总数三十六页\编于十二点一、基因和基因工程基因（gene）:DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质最小功能单位。基因工程（geneome）:重组DNA技术是指分离纯化或人工合成的基因（目的基因）与载体在体外进行拼接重组，然后转入宿主细胞（细菌或其他细胞）内，筛选出携带有重组DNA的活宿主细胞，再使之繁殖和扩增，直至表达出目的基因所编码的多肽。由于这一过程类似于一个连续和复杂的工程，所以又称为基因工程。DNA重组体外引入受体细胞（宿主细胞），进行无性繁殖和扩增的过程称为基因克隆技术。目前二页\总数三十六页\编于十二点基因工程技术的诞生

基因工程技术的诞生不仅依赖于基因分子生物学理论的发展，同时也有赖于一些重要的分子生物学研究方法的建立。最重要的技术准备是限制性酶的分离纯化、DNA连接酶的分离、大肠杆菌转化技术的突破。到1970年，这三大技术都已经建立，“万事齐备，只欠东风”了。到了1972～1973年，两位科学助产士Berg和Cohen将基因工程接到了人间。目前三页\总数三十六页\编于十二点一、基因工程的发展史目前四页\总数三十六页\编于十二点

第一个重组体的构建

1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生。目前五页\总数三十六页\编于十二点第一个有功能重组体的构建◆虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能。◆1973年，S.N.Cohen等在美国PNAS上发表了题为“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）

的论文，宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达,从而完善了Berg开创的基因重组技术。目前六页\总数三十六页\编于十二点BoyerandCohen目前七页\总数三十六页\编于十二点◆质粒

pSC101的获得●In1972,CohenconstructedanewplasmidbeginningwithDNAisolatedfromE.coli.CohennamedtheplasmidpSC101(“SC"forStanleyCohen).Thenewplasmidhadthreeimportantfeatures:ithadonlyasinglerecognitionsitewhereEcoRIwouldcutthemolecule,thusidentifyingthespotwheretheplasmidwouldopen;(2)ithadasequenceofnucleotidescalledanoriginofreplication,whichisneededtoinitiateDNAreplication;suchasequencestimulatesplasmidstomultiplyinahostorganism;(3)itcontainedageneforresistancetotheantibiotictetracycline;thus,bacteriahavingtheplasmidcouldresisttheeffectsoftetracycline,whereasbacterialackingtheplasmidwouldbekilledbythetetracycline.Cohen在重组DNA技术中杰出贡献目前八页\总数三十六页\编于十二点◆质粒

pSC101对大肠杆菌的转化技术突破●AnotherkeycharacteristicofCohen'splasmidwastheeaseofinsertingittoahostcell.Cohenfoundthathecouldinsertplasmidstofreshbacteriabysuspendingthelatterincoldcalciumchloride,thenrapidlyheatingthebacteriato42oC.Sotreated,thebacterialwallandplasmamembraneopentopermittheplasmidstopassthroughandintothecytoplasm.Cohen在重组DNA技术中杰出贡献目前九页\总数三十六页\编于十二点◆Cohen与Boyer合作创建重组DNA分子●Tosomehistorians,thedisciplineofDNAtechnologycameintobeingoverpastramisandwichesatalocaldelicatesseninWaikikiBeach.Theyearwas1972.●IthappenedthatHerbertBoyerwasatascientificconferenceinHawaiispeakingabouttheEcoRlrestrictionenzyme.StanleyCohenwasintheaudience.●Afterthepresentation,CoheninvitedBoyertolunchtoexploretheirpossiblecollaborationonaseriesofexperiments.●ThetworesearcherssatandconsideredtheexperimentsthatwouldsendDNAtechnologyintoanewera.Cohen在重组DNA技术中杰出贡献目前十页\总数三十六页\编于十二点BoyerandCohen的策略目前十一页\总数三十六页\编于十二点从生物体中分离或通过化学合成制备目的基因。目的基因与合适载体进行体外连接，构建重组DNA。将重组DNA导入受体生物细胞以获得转化体。筛选出含有重组DNA的活宿主细胞。对重组DNA的活宿主细胞进一步分析以及操作，使目的基因在受体生物细胞中高效表达。

（一）基因工程的基本过程目前十二页\总数三十六页\编于十二点步骤1、构建DNA重组体人工合成法、逆转录法、应用限制性内切酶从染色体DNA中切割分离（1）目的基因的制备目前十三页\总数三十六页\编于十二点（2）克隆载体的制备1、相对分子质量较小2、能进行复制，具有高拷贝数3、具有较少的限制性内切酶位点4、外源DNA插入以后载体本身的复制功能不受影响5、具有某种明显的标志常用克隆载体：质粒、噬菌体、病毒理想的载体目前十四页\总数三十六页\编于十二点同一限制酶切位点连接由同一限制酶切割的不同DNA片段具有相同末端，当这样的两个DNA片段一起退火时，黏性末端单链间进行碱基配对，然后在T4DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。黏性末端连接（3）DNA重组体的制备目前十五页\总数三十六页\编于十二点具有平末端的酶切载体只能与平末端目的基因连接。在一定反应条件下，可用T4DNA连接酶将平齐末端的DNA片段有效地连接起来。钝性末端连接法目前十六页\总数三十六页\编于十二点人工接头：人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点，应用相应的内切酶切割，可以分别得到互补的黏性末端。人工接头连接目前十七页\总数三十六页\编于十二点步骤2、将重组DNA引入宿主细胞筛选转化（transformation）：将重组质粒导入受体细胞，使受体菌遗传性状发生改变的方法。转染（transfection）:将携带外源基因的病毒感染受体细胞的方法。根据受体生物，一般可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法和动物细胞转化法。目前十八页\总数三十六页\编于十二点（一）利用表型特征进行筛选表型：指机体遗传组成同环境相互作用所产生的外观或其他特征。利用载体提供的表型特征进行筛选（1）抗药性标记基因插入失活筛选法；（2）β－半乳糖苷酶显色反应筛选法。

利用噬菌斑的形成进行筛选（1）以λ噬菌体载体与外源DNA构建的重组体筛选主要依赖于重组体的大小及形成噬菌斑的能力；（2）重组体DNA只有在为野生型λ噬菌体DNA的75%～105%的长度时，才能在培养平板上形成清晰的噬菌斑，而载体DNA自身不会包装成活的噬菌体颗粒。目前十九页\总数三十六页\编于十二点电泳检测法根据DNA分子质量的大小，以凝胶电泳检测重组体。

R-环检测法

R-环：指RNA通过取代与其序列一致的DNA单链而与另一单链DNA杂交，被取代的DNA单链与RNA-DNA杂交双链所形成的环状结构。

R-环结构一旦形成就十分稳定。应用R-环检测法可鉴定出双链DNA中存在的与特定RNA分子同源的区域（可在电子显微镜下观察）。

（二）物理筛选鉴定法目前二十页\总数三十六页\编于十二点步骤3、含重组DNA的活宿主细胞的繁殖扩增表达插入外源DNA质粒载体加入重组质粒质粒DNA转入宿主细胞宿主细胞DNA在含有抗生素培养基中培养产生大量重组DNA拷贝抗生素基因目前二十一页\总数三十六页\编于十二点基因工程的技术组合目前二十二页\总数三十六页\编于十二点基因工程的特点◆基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。◆基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作，象一项工程那样，进行按图施工的操作，基因工程的对象是基因，而基因要安居才能乐业，也就是说基因需要在宿主细胞中工作，这样，基因工程同一般的土建工程的根本差别在于，它需要在体外操作，然后送到细胞中去进行表现。◆这实际上是进行无性繁殖，即克隆，所以基因工程通常又称为基因克隆。目前二十三页\总数三十六页\编于十二点基因工程的基础与应用（一）

改良微生物菌种

最早成功应用的基因工程菌(采用基因工程改造的微生物)是面包酵母菌。此外，食品生产中所应用的食品添加剂或加工助剂，如氨基酸、有机酸、维生素、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、食用色素，食用香精及调味料等啤酒生产中要使用啤酒酵母，但由于普通啤酒酵母菌种中不含α-淀粉酶，所以需要利用大麦芽产生的α-淀粉酶使谷物淀粉液化成糊精，生产过程比较复杂。

改造食品

目前二十四页\总数三十六页\编于十二点（二）改良动物食品性状

为了提高乳牛的产奶量，可将采用基因工程技术生产的牛生长激素(BST)注射到母牛体内，既可达到提高母牛产奶量的目的，又不影响奶的质量。同样，为了提高猪的瘦肉含量或降低猪脂肪含量，可将采用基因重组技术生产的猪生长激素，注射至猪体内，便可使猪瘦肉型化，有利于改善肉食品质。目前二十五页\总数三十六页\编于十二点（1）改造油料作物最易用基因工程方法进行改造的油料作物是油菜，迄今为止，在世界范围内种植的良种油菜有31％是转基因品种。

农业应用

目前二十六页\总数三十六页\编于十二点

（2）提高油脂中抗氧化剂的含量。

已成功地从拟南芥中克隆甲基转移酶基因并转导到了大豆中，甲基转移酶是γ—生育酚形成生育酚的关键酶。转这种酶基因的大豆能在不降低总生育酚的前提下，使α—生育酚的含量提高80％以上。

目前二十七页\总数三十六页\编于十二点（3）改良植物食品的蛋白质品质

如秘鲁“国际马铃薯培育中心”培育出一种蛋白质含量与肉类相当的薯类；转移扁豆蛋白基因可获得具有较高贮存蛋白质的转基因向日葵。我国在此方面也培育出了一批作物新品种，有的已经在生产上推广应用。如山东农业大学将小牛胸腺DNA导入小麦系814527，在第二代出现了蛋白质含量高达16.51％的小麦变异株；中国农业科学院作物研究所将大米草DNA引入水稻品种早丰，出现了籽粒蛋白质含量高达12.74％的受体变异类型。

目前二十八页\总数三十六页\编于十二点生产基因工程药品如胰岛素、干扰素、乙肝疫苗等。我国生产的部分