H亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备鉴定及其模拟表位的筛选

（优选）H亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备鉴定及其模拟表位的筛选目前一页\总数二十三页\编于十三点文献综述禽流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)神经氨酸酶(neuraminidase,NA)高致病性禽流感H5和H7危害

禽流感目前二页\总数二十三页\编于十三点禽流感血凝素HA功能HA表位[文献综述]目前三页\总数二十三页\编于十三点丝状噬菌体具有一条单链环状DNA基因组外源基因整合到噬菌体基因组中外源蛋白与噬菌体衣壳蛋白融合表达,展示在噬菌体表面噬菌体展示原理[文献综述]目前四页\总数二十三页\编于十三点研究目的与意义针对当前禽流感病毒的流行趋势，有必要研制良好特异的单克隆抗体，以加强我国Ｈ５亚型高致病性禽流感病原学的监测工作。HA是刺激机体产生中和抗体主要抗原，利用中和性的单抗和分子生物学手段分析流感病毒的中和表位，可以为表位疫苗的研制奠定基础。目前五页\总数二十三页\编于十三点制备抗H5亚型禽流感病毒HA的单克隆抗体单抗纯化单抗鉴定噬菌体淘筛测序鉴定阳性噬菌体抗血清制备技术路线HI试验中和试验模拟肽功能确定目前六页\总数二十三页\编于十三点单克隆抗体的制备流程[技术路线]目前七页\总数二十三页\编于十三点将抗体固相化，再加入噬菌体肽库与其结合。通过洗脱，即可收集到带有目的多肽的重组噬菌体。将这些噬菌体侵染大肠杆菌而得到进一步扩增。经过3～4轮的筛选可获得与抗体结合紧密的噬菌体克隆

噬菌体展示技术“淘筛”过程

[技术路线]目前八页\总数二十三页\编于十三点

结果与分析目前九页\总数二十三页\编于十三点杂交瘤细胞的制备免疫原：DW毒株

(Ａ/Chicken/Hubei/327/2004)

筛选方法：HI试验

融合２次，共获得13株单抗

目前十页\总数二十三页\编于十三点杂交瘤细胞染色体计数及相应单克隆抗体亚类杂交瘤细胞株Hybridoma染色体数目Thenumberofchromosomes单抗亚类Antibodyisotypes1D1186（84-87）IgG2a1H887（86-88）IgG12B790（88-93）IgG2a2C985（83-86）IgG2a2H488（85-90）IgG2a4C986（85-88）IgG11C482（80-85）IgG2a1D484（81-89）IgG2a1E1292（84-96）IgG12E1185（83-90）IgG14C1286（81-88）IgG2a4G293（88-97）IgG15E1284（83-87）IgG1脾细胞40－SP2/062-68－杂交瘤细胞染色体数目均高于两亲本细胞染色体数目

目前十一页\总数二十三页\编于十三点单克隆抗体HI效价单抗1D111H82B72C92H44C9细胞上清HI效价212121212422腹水HI效价2727272821229单抗1C41D41E122E114C124G25E12细胞上清HI效价27242425252525腹水HI效价218210213216214214216

腹水HI效价要比上清高6～11个滴度

目前十二页\总数二十三页\编于十三点HI试验分析单抗的特异性

抗体

病毒

单抗（Mcab）

1D111H82B72C92H44C91C41D41E122E114C124G25E12AIV-H5+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

AIV-H9-

-

-

-

-

-

-------AIV-H7-

-

-

-

-

-

-------NDV-

-

-

-

-

-

-------IBV-

-

-

-

-

-

-------注：+表示HI试验阳性，―表示HI试验阴性

目前十三页\总数二十三页\编于十三点AIVH5中和效价（Neutralizationtiter）1H81D112B72C92H44C9A/CK/Hubei/327/20041:731:7241:2048>1:163841:14451:2048A/Goose/ZF/ZFE/20041:109>1:40961:1624>1:163841:40961:5236A/CK/XF/XFJ/20041:271:6311:100>1:163841:1781:128A/Duck/XF/XFY/20041:256>1:4096>1:4096>1:163841:81921:6457第1批6株单抗对4株禽流感病毒的中和效价

微量中和试验１目前十四页\总数二十三页\编于十三点中和效价:高低微量中和试验２第2批单抗对病毒A/CK/Hubei/327/2004的中和效价单抗McAbs1C41D41E122E114C124G25E12中和效价Neutralizationtiter>1:327681:47321:22387>1:327681:10000>1:32768>1:327681C42E124G25E121E124C121D41C42E12,5E124G24C121E121D4HI效价:高低目前十五页\总数二十三页\编于十三点M：

proteinmarker1：

Mcab1C4单抗1C4提纯后SDS（12％）电泳图提纯后的抗体可见有两条带，一条重链带50Kd左右，一条轻链带27Kd左右目前十六页\总数二十三页\编于十三点轮数Round加入物Input洗脱物Output产出率Vield第一轮firstround1.32×10111.46×1021.11×10－9第二轮secondround1.2×10111.17×1039.75×10－9第三轮thirdround1.95×1011

6.4×1053.28×10－6第四轮fourthround1.98×1011

6.3×1073.18×10－4

四轮亲和筛选对噬菌体的富集

以纯化单抗1C4为筛选配基，进行了四轮淘筛，随着淘筛次数增加，产出率都在提高

目前十七页\总数二十三页\编于十三点噬菌体结合活性分析大部分噬菌体克隆都与单抗1C4有反应，而与BSA反应很弱，其中有6个克隆（#1，#7，#8，#10，#11，#14）反应的A差值较大（>0.6）,因此将这6个噬菌体克隆测序。目前十八页\总数二十三页\编于十三点噬菌体DNA测序及同源性比较6个序列高度一致，翻译成肽序列为DHTLYTPYHTHP．用ClustaW软件比较12肽和HA的同源性：没有发现完全一致的序列，但在306－312处有相似序列PXHXXHP。提示这一段区域可能与抗体识别位点相关。

目前十九页\总数二十三页\编于十三点

竞争抑制实验结果竞争抑制试验

取其中阳性噬菌体扩增液上清与不同浓度的H5亚型禽流感病毒等体积混合，加入到单抗1C4包被的酶标板中，其余操作步骤同ELISA

抑制率＝（未抑制Ａ630-抑制Ａ630）/未抑制Ａ630×100％。率制抑病毒稀释倍数

%目前二十页\总数二十三页\编于十三点小鼠免疫试验结果组别HI抗体效价（log2）中和效价阳性噬菌体01：16阳性噬菌体+佐剂01：20原始肽库扩增液0阴性空白（PBS）0阴性HI试验表明未能产生HI抗体中和试验表明有较低的中和抗体产生，且使用佐剂并不能显著提高抗体产生水平目前二十一页\总数二十三页\编于十三点

小结共获得13株特异性的针对HA的单克隆抗体，其中有5株单抗的HI效价大于214，最高可达218。这些单抗具有良好的亚型特异性，为流感诊断方