EB病毒检测技术进展及临床应用

概述Epstein-Barr病毒（EBV）疱疹病毒科，γ亚科，嗜淋巴细胞病毒属，1964年由Epstein、Barr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现。EBV是是传染性单核细胞增多症的病原体，也是一种重要的肿瘤相关病毒，与鼻咽癌、淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关，被列为致癌性病毒之一。目前一页\总数四十九页\编于十二点概述传播途径：EBV感染主要通过唾液接触传播，也可通过血液传播；人感染EBV后建立终身潜伏感染，人群感染率超过90%。1-6岁儿童、14-20岁青少年及年轻成年人高度易感，发展中国家EBV感染多发生在儿童早期。目前二页\总数四十九页\编于十二点病原学疱疹病毒科，γ疱疹病毒亚科，淋巴隐病毒属，人疱疹病毒4型球形双链DNA病毒，基因组平均大小约为172kb目前三页\总数四十九页\编于十二点目前四页\总数四十九页\编于十二点目前五页\总数四十九页\编于十二点EBV致病机制原发EBV感染时，EBV先是在口咽部上皮细胞内增殖，然后感染附近的B淋巴细胞，受到感染的B淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染。EBV原发感染后，大多数无临床症状，尤其是6岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病，但在儿童期、青春期和青年期，约50%的原发性感染均表现为IM。目前六页\总数四十九页\编于十二点EBV在人体B细胞建立潜伏感染，EBV只表达潜伏抗原（包括EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNA-LP、LMP-1、LMP-2及EBER），受感染者将成为终身带毒者。在机体免疫功能下降和某些因素触发下，潜伏的EBV可以被再激活，引起病毒复制及临床疾病。EBV致病机制目前七页\总数四十九页\编于十二点EBV常见相关疾病传染性单核细胞增多症

（Infectiousmononucleosis,IM)慢性活动性EB病毒感染

（ChronicactiveEBVinfection，CAEBV）EB病毒相关性嗜血细胞综合征

（EBV-associatedhemophagocyticsyndrome,EBVAHS)Burkitts淋巴瘤何奇金淋巴瘤目前八页\总数四十九页\编于十二点EBV感染的抗原表达EBV溶解性感染期，可表达：早期抗原（EA）：EA/R和EA/D（具DNA多聚酶活性）；

EA出现表明EBV活跃增殖，EA抗体出现在感染早期；衣壳蛋白（VCA）晚期表达的结构蛋白VCA-IgM出现在急性感染早期，VCA-IgG出现在急性感染期并持续存在膜抗原（MA）：细胞表面包膜糖蛋白（MAgp350/220,gp85)，是EBV的中和性抗原抗MA-IgM可用于早期诊断目前九页\总数四十九页\编于十二点EBV潜伏感染期，选择性表达早期抗原以及：

核抗原（EBNA-1,-2,-LP,-3A,-3B,-3C）：为DNA结合蛋白，在感染的B细胞核内；EBNA-1与感染有关，EBNA-2与细胞转化和永生化有关；EBNA抗体出现在感染晚期。

潜伏膜蛋白（LMP-1,-2A,-2B）：在感染B细胞表面，与细胞恶化有关，

未翻译的转录物BARF0和EBER

EBNA-3、EBNA-2、LMP-1是EBV-CTLCD8+的主要目标EBV感染的抗原表达目前十页\总数四十九页\编于十二点原发性EBV感染过程中首先产生针对衣壳抗原（capsidantigen,VCA）IgG和IgM，在急性感染的晚期，抗早期抗原（earlyantigen,EA）抗体出现在恢复期晚期，抗核抗原（nuclearantigen,NA）抗体产生，抗VCA-IgG和抗NA-IgG可持续终身目前十一页\总数四十九页\编于十二点EBV感染的血清学诊断目前十二页\总数四十九页\编于十二点传统检测策略的问题5%新近EBV感染不出现CA-IgM抗体在罕见的病例中抗CA-IgM会持续存在约20-30%的新近感染不出现EA-IgG抗体抗EBNA-IgG抗体可能呈现阴性，由于：-慢性活动性EBV感染-细胞免疫被抑制目前十三页\总数四十九页\编于十二点EBV感染的血清学诊断抗VCA-IgM和IgG可以同时出现，通常IgG出现较IgM晚，但偶尔较IgM出现早1~2周，抗VCA-IgM几周后检测不到抗EA-IgG在发病后3-4周后升高，3~4月后检测不到抗EBNA-1-IgG在发病后3~4周被检测到，持续终身，部分慢性EBV感染者检测不到抗VCA-IgG和抗EBNA-1-IgG终生持续阳性目前十四页\总数四十九页\编于十二点EBV常见相关疾病目前十五页\总数四十九页\编于十二点传染性单核细胞增多症(IM)

infectiousmononucleosis特指由EBV感染引起的发热、咽炎和淋巴结肿大的综合征1889年被首次描述为“glandularfever”1920年正式定义为IM1932年发现嗜异性凝集实验1968年实验室工作人员感染EBV，出现IM临床症状和嗜异性凝集抗体，明确EBV是IM的病原目前十六页\总数四十九页\编于十二点IM临床表现

25-30%的青少年和<30岁的成年人原发感染EBV后表现IM儿童时期EBV感染多为亚临床型或不典型症状临床症状：发热、淋巴结肿大、扁桃体炎（灰白色渗出）、咽炎、肝脾肿大、眼睑水肿和皮疹、上腭粘膜出血点皮疹经常发生于使用氨苄西林、阿莫西林和一些β内酰胺类抗生素1周后，发生率90%并发症：粒细胞减少、血小板减少、脾破裂、扁桃体肥大致气道阻塞、暴发性肝炎、溶血性贫血、再生障碍性贫血、中枢神经系统疾病目前十七页\总数四十九页\编于十二点目前十八页\总数四十九页\编于十二点慢性活动性EBV感染,CAEBV

chronicactiveEBVinfection

1975年Horwitz首次描述一些持续性IM患者血清存在高滴度的抗EBV-VCA和EA抗体1982年Tobi进一步描述并证实该病1984年被称为慢性单核细胞增多样综合征1986年被定义为慢性症状性EBV感染1991年被称为慢性活动性EBV感染目前十九页\总数四十九页\编于十二点CAEBV发生于儿童或年轻成年人该病表现为慢性或反复的单核细胞增多样症：发热、肝脾肿大、持续性肝炎、广泛性淋巴结肿大EBV感染的NK和T细胞克隆扩增在CAEBV具有重要意义通常是一种肿瘤前状态或者与严重免疫缺陷有关，可进一步引起EBV相关的T/NK细胞增殖性疾病预后差，病死率高目前二十页\总数四十九页\编于十二点CAEBV的诊断标准1）持续性或反复发作的IM样症状2）异常升高的抗VCA-IgG和EA-IgG

和/或受累组织包括外周血检测到EBV基因组3）慢性疾病不能以其他已知的疾病解释

OkanaM,etal.ProposedguidelinesfordiagnosingchronicactiveEpstein-Barrvirusinfection.AmericaJHematol.2005,80:64-69目前二十一页\总数四十九页\编于十二点Hydroavacciniforme

牛痘样水疱

hypersensitivitytomosquitobites目前二十二页\总数四十九页\编于十二点CAEBV的诊断标准(1)临床症状持续性或反复发作的IM样症状发热、淋巴结肿大、肝脾肿大并发症：血液系统（EBV-HLH、淋巴瘤、白血病、DIC、血小板减少、贫血）消化系统（肝功能衰竭、消化道溃疡）中枢神经系统间质性肺炎心血管（冠状动脉瘤、心肌炎、心瓣膜病）皮肤（蚊虫叮咬过敏、皮肤牛痘样水疱）目前二十三页\总数四十九页\编于十二点CAEBV的诊断标准(2)血清抗体滴度异常升高抗VCA-IgG≥1:640和抗EA-IgG≥1:160抗VCA-IgA和/或抗EA-IgA常呈阳性受累组织和外周血检测到EBV-DNA、RNA、有关抗原和克隆PCR：外周血PBMC中EBV-DNA定量>102.5copies/µg原位杂交：检测出EBER-1阳性细胞Southern杂交：受累组织或外周血中检测出EBVDNA免疫荧光：检测到抗原（EBNA、LMP）感染的B、T、NK细胞、单核/巨噬/组织细胞检测到EBNA、EBER、EBV-DNA目前二十四页\总数四十九页\编于十二点EBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症

EBV-associatedhemophagocyticlymphohistocytosisEBV-HLH

是一种与EBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病EBV感染所致CD8+T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞，导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症（细胞因子风暴）是EBV-HLH的主要病例生理特征临床表现发热、肝脾肿大、黄疸、全血细胞减少、DIC，骨髓和其他组织见嗜血细胞、LDH、铁蛋白、β微球蛋白EBV-HLH常见于儿童和青少年目前二十五页\总数四十九页\编于十二点抗EBV病毒药物无环核苷拟似剂acyclovir（阿昔洛韦），ED500.3µΜganciclovir（更昔洛韦），ED500.05µΜvalaciclovir（缬昔洛韦）无环核苷酸cidofovir，adefovir焦磷酸盐拟似剂

foscarnet（磷甲酸钠）作用机制作用病毒DNA多聚酶，抑制病毒复制目前二十六页\总数四十九页\编于十二点EBV感染的实验室诊断外周血分类淋巴细胞≥50%WBC不典型淋巴细胞≥10%WBC（系激活的CD8+CTL）血清学检查嗜异性凝集实验（heterophiletest/spottest）VCA-IgM、IgG，EA-IgG，EBNA-IgG病毒学标志在PBMC、血清、全血或感染组织检测EBV-DNA、EBER、EBNA、LMP目前二十七页\总数四十九页\编于十二点EBV感染疾病的血清学诊断诊断VCAIgMVCAIgGEAIgGEBNAIgG既往无感染－－－－IM(急性期)＋＋＋－IM（恢复期）＋/－＋＋/－＋/－既往感染－＋低＋/－＋慢性活动性感染＋/－高＋高＋＋/－目前二十八页\总数四十九页\编于十二点临床需要回答的问题是否感染EBV?EBV感染的时相？是否EBV活动性感染？疾病是否与EBV感染相关？目前二十九页\总数四十九页\编于十二点EBV实验室检测方法

病毒培养免疫学技术（免疫荧光法，免疫组化技术）

血清学方法（ELISA法，化学发光法）

基因诊断技术目前三十页\总数四十九页\编于十二点

嗜异凝集抗体试验：也称“Monospot”试验。在EBV还未确定为IM的病因之前，1932年引入临床实践诊断IM。当时发现IM患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞。该抗体在病程第1～2周出现，持续约6个月。在青少年原发性EBV感染中其阳性率可达80％-90％，约10％的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应。EBV实验室检测方法目前三十一页\总数四十九页\编于十二点EBV感染的血清学诊断评价嗜异性抗体（heterophileantibody，HA）凝集实验（“spot”test）嗜异性抗体（IgM）在发病后7天内出现，2-5周达高峰，可以持续6-12个月，偶有12个月后以低水平存在HA阳性提示原发急性感染，EBV再激活感染几乎阴性阳性率：青少年和成年人71%-90%，2-5岁儿童50%假阴性：发病第1周内假阴性率25%，10%成人始终阴性假阳性：2-3%自身免疫性疾病、HIV感染、心内膜炎、HAV肝炎目前三十二页\总数四十九页\编于十二点缺点需要硬件设备成本昂贵优点敏感性高特异性强操作简便化学发光技术目前三十三页\总数四十九页\编于十二点胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶，氯金酸在还原剂的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态简便，快捷，敏感度和特异度较差目前三十四页\总数四十九页\编于十二点EBERS原位杂交试验EBV潜伏感染的细胞含有大量的EBERl／EBER2（EBERS）转录子，其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡。该转录子不翻译成蛋白质，每个EBV潜伏感染的细胞含有大约106拷贝EBERS，被认为EBV潜伏感染的最好标志物，因此原位杂交检测肿瘤细胞中EBERS是诊断肿瘤是否EBV相关的金标准EBV实验室检测方法目前三十五页\总数四十九页\编于十二点EBV病毒核酸检测实时荧光定量PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法鉴别EBV健康携带者的低水平复制与EBV相关疾病患者高水平活动性感染。目前三十六页\总数四十九页\编于十二点EBV载量检测有多种方法，Real-timePCR是目前最主要的监测EBV载量的方法，有较强的敏感性和特异性。不同的EBV疾病进行Real-timePCR检测时，需要的标本不同。EBV病毒核酸检测目前三十七页\总数四十九页\编于十二点疾病感染细胞感染方式检测病毒定量的最合适标本血浆/血清单核细胞全血传染性单核细胞增多症（IM）B细胞浆细胞溶解性感染潜伏Ⅲ理想√不推荐不推荐移植后淋巴增殖性疾病（PTLD）B细胞潜伏Ⅲ理想最合适√慢性活动性EBV感染（CAEBV）T细胞NK细胞潜伏Ⅱ评价预后适合诊断√EBV相关性疾病的病毒DNA定量检测血清游离的EBV-DNA提示原发感染或者再激活健康携带者血清EBV-DNA通常检测不到目前三十八页\总数四十九页\编于十二点目前三十九页\总数四十九页\编于十二点目前四十页\总数四十九页\编于十二点目前四十一页\总数四十九页\编于十二点传单的EBV感染实验室诊断血清学检测：同时满足下列2条者可以诊断为EBV-IM:1.下列临床症状中的3项：发热、咽峡炎、颈淋巴结肿大、肝肿大、脾肿大；2.原发性EBV感染的血清学证据，满足下列2条中任一项：（1）抗EBV-CA-IgM和抗EBV-CA-IgG阳性，且抗EBV-NA-IgG阴性（2）抗EBV-CA-IgM阴性，但抗EBV-CA-IgG阳性，且为低亲和力抗体目前四十二页\总数四十九页\编于十二点传单的EBV感染实验室诊断DNA检测？:IM患者外周血中EB病毒载体在2周内达到峰值，随后很快下降。至病程14天，多数EBV-IM患者血清中已检测不到病毒核酸，病程22天后，所有EBV-IM患者血清中均检测不到病毒核酸。IM患者不推荐进行EB病毒载量检测目前四十三页\总数四十九页\编于十二点慢性活动性EBV感染的实验室诊断EBV抗体检测抗体反应类型EBV抗体比例（%）CA-IgGCA-IgMEA-IgGNA-IgG1+-++54.92+-+-25.53++++5.94+++-5.95+--+3.96+---3.9目前四十四页\总数四十九页\编于十二点慢性活动性EBV感染的实验室诊断