南宁无创产前检测(NIPT)会议课件 NIPT-假阳性、假阴性问题分析

NIPT-假阳性、假阴性问题分析东

莞

博

奥

木

华

基

因

科

技

有

限

公

司陈样宜出生缺陷技术总监2

0

1

7

年

1

2

月

1

0

日人类染色体CABDEFG2染色体结构NGS，芯片，PCR等分子手段的主要检测目标为常染色质区，而随体，主缢痕，次缢痕，异染色质区域多是高度重复区域，一般不能通过NGS等分子方法检测这些区域的结构和数目异常3染色体异常起源：减数分裂1.卵子成熟4染色体异常起源：减数分裂精子成熟5染色体异常起源：早期有丝分裂6染色体异常起源：嵌合体分化7染色体异常信号Z值的计算假设21染色体出现三体异常，胎儿DNA浓度为Fc，则母体浓度为(1-Fc)；N为某次实验有效测序reads数目，r为参考人群21号染色体占常染色体基因组的比例，Sd为标准差，那么理论可获得该染色体的reads数目X为：X=N*r*

(1-Fc)+N*r*3/2*Fc=N*r*(1+1/2*Fc)-----（1）由Z=(X/N-r)/Sd

，联合（1）可知：Z=[r*(1+1/2*Fc)-r]/Sd=1/2*r*Fc/Sd-----（2）-----（3）由CV=Sd/r可得Z=1/2*Fc/CV8浓度越高，检测值越高，容易检出9染色体异常信号Z值的计算一般的情况下，假设胎儿DNA浓度为Fc，测序量为M，则对于任意一段N兆大小的缺失或重复区域，其标准分数的期望值的绝对值为：|Z|=C*Fc*sqrt(N)*sqrt(M)

-----（4）Z值期望与四个因素相关：1.胎儿比例成正比。2.检测区域大小开平方成正比。3.数据量开平方成正比。4.发生缺失重复区域的特征值。10外周血游离DNA纯化：片段筛选•

DNA片段筛选---

排除母体基因组干扰---

确保检测的对象为血浆游离DNA11外周血游离DNA纯化：片段筛选精准的片段筛选，可以大幅度提高胎儿游离DNA比例12胎儿比例预测：片段统计片段分布的统计---质控女胎的胎儿比例---质控检测对象为孕妇13胎儿比例预测效果14NIPT数据分析管理软件质控指标15病例解读：11.早孕唐筛结果21-三体高风险2.无创基因检测21-三体高风险（Z=7.395）3.QF-PCR21-三体4.染色体核型结果47,XY,+2116病例解读：21.早孕唐筛结果21-三体高风险18-三体高风险2.无创基因检测18-三体高风险（Z=8.531）3.QF-PCR18-三体4.

染色体核型结果47,XX,+1817病例解读:31.

中孕超声结构筛查（1）心脏发育异常（2）颅内结构发育异常（3）双肾实质回声增强2.无创基因检测13-三体高风险（Z=9.251）3.

染色体核型结果47,XY,+1318病例解读:41.

中孕超声结构筛查（1）心脏发育异常（2）颅内结构发育异常（3）双肾实质回声增强2.

无创基因检测13-三体（7.269）18-三体（10.712）19病例解读:43.QF-PCR结果：胎儿A:

47,XY,+18胎儿B:

47,XX,+1320NIPT的假阳性•

NIPT的敏感性和特异性尽管很高，但只能用于筛查，而不能替代确认性的染色体核型分析。•

胎儿游离DNA来自胎盘，而胎盘的核型存在与胎儿不一致的情况。•

游离DNA大部分来自母体，母体的缺失重复与其他生理因素均可干扰无创的结果。21病例解读:51.

中孕期唐筛2.

无创基因检测13-三体高风险（Z=7.395）3.QF-PCR未见21-三体未见18-三体未见13-三体4.

染色体核型结果46，XY22病例解读:5分娩后取胎盘组织QF-PCR结果：限制性胎盘嵌合体

46,XY/47,XY,+1347,XY,+13限制性胎盘嵌合体：是指胎盘出现正常与异常的染色体嵌合体,而胎儿核型正常[Dagmar

K,JMedGenet,1996]46,XY23病例解读:61.早孕唐筛结果21-三体高风险2.无创基因检测21-三体高风险（Z=11.529）3.QF-PCR:21-UPDA为拷贝数探针检测出整条21号染色体Log2

Ratio都为0，因此推测21号染色体拷贝数为正常2，不存在任何缺失和重复。4.染色体核型结果46,XX5.CMA结果B为SNP探针检测到表示杂合子的中间“0”基线消失，因此推测该病例21号染色体为纯合子，即两条都来自同一个亲代24病例解读:6父亲母亲21号：STR均为单峰结合胎儿与夫妻双方的峰型比较提示胎儿21号染色体的STR峰均来自母亲胎儿UPD-21胎盘嵌合体胎盘47,+21胎盘UPD-2125假阳性的产生：减I不分离1

12

23

31

12

23

31

12

2

2

23

3

3

31

1

1

12

2

2

23

3

3

31

12

23

31

14

45

54

45

54

4

4

45

5

5

54

4

4

45

5

5

54

45

5联会减I不分离减II6

67

76

67

76

6

6

67

7

7

76

6

6

67

7

7

7次级卵母细胞6

67

7卵子初级卵母细胞1

1

12

2

23

3

34

4

45

5

51

12

23

34

45

51

1

12

2

23

3

34

4

45

5

51

12

23

34

45

512345胎儿三体自救受精精子胎盘部分三体自救6

6

67

7

7受精卵6

67

76

6

67

7

76

67

7胎儿67胎盘（嵌合体）26假阳性的产生：减II不分离1

12

23

31

12

23

31

12

2

2

23

3

3

31

12

23

31

12

23

31

14

45

54

45

54

4

4

45

5

5

54

45

54

45

5联会减I6

67

76

67

76

6

6

67

7

7

76

67

76

67

7卵子减II不分离初级卵母细胞次级卵母细胞1

12

21

12

21

12

21

12

2123451234512345胎儿三体自救3

33

33

33

3受精4

45

54

45

54

45

54

45

5精子胎盘部分三体自救6

67

76

67

76

67

76

67

7胎儿676767受精卵胎盘（嵌合体）27假阳性的产生：母体CNV28假阳性的临床意义1.减I不分离或减II不分离产生的假阳性有一定的机会形成单亲二倍体。2.单亲二倍体的LOH增加了单基因病风险。3.印记区的iUPD、hUPD需要STR、基因芯片才能发现，核型分析不能识别。4.15号染色体会引起PWS或Angeleman综合征。其他染色体致病性不明。5.母体来源的CNV存在一定的致病性可能。6.胎儿比例高的4拷贝重复可能被误认为母体重复。29病例解读:71.NIPT：T15

Z=14.736（短片段

cffDNA

阳性检测值Z=17.383）2.染色体核型结果：46,XY3.芯片结果

：15q24.1q26.3x2

hmz

15q11.2-q13.1无异常？30病例解读:74.父母芯片验证：15q24.1q26.3x2

hmz

为母源iso-UPD，15号染色体其他位置为母源het-UPD，可能存在致病性。31病例解读:81.基本信息：年龄：33；孕周：23w+5；错过血清学筛查2.NIPT：T22

Z=5.474（短片段

cffDNA

阳性检测值Z=6.441）32病例解读:83.羊水核型分析：22号染色体部分三体33病例解读:84.羊水高通量测序：mar染色体为22号染色体部分四体34NIPT的假阴性•

NIPT的假阴性率约为1/300-1/50，所检测样本中发生概率约为1/40000-1/10000。•

胎儿游离DNA来自胎盘，而胎盘的核型存在与胎儿不一致的情况。•

游离DNA大部分来自母体，母体的缺失重复与其他生理因素均可干扰无创的结果。检测判断阳性阴性NIPT阳性阴性阳性T21996254189,22560T21T18256阴性T183189,958T13阳性阴性T1334072190,17135病例解读:91.基本信息：年龄：25；孕周：23w；血清学低风险；胎儿偏小2.NIPT结果：阴性3.28周超声仍提示胎儿偏小，以无创结果阴性为由未作进一步诊断36病例解读:94.出生后特殊面容，核型分析发现易位型21三体37病例解读:95.无创样本出错了？备份血浆重测序，仍为阴性；血浆SNP捕获测序证实未做错，评估出该女胎胎儿比例为12%，与无创预测13.9无明显差异。染色体孕妇白细胞孕妇外周血游离DNAAAaa/AAab

BBbb/BBabAA76BB3chr1chr276344chr37575chr48181chr57575chr67878chr73333chr85353chr94646chr10chr11chr12chr13chr14chr16chr17chr18chr20chr21chr22合计5564771433921160144659315268611051556477143392116014465931526861105155250455250438病例解读:95.胎盘嵌合体？六个位置的胎盘组织及其父母的染色体高通量检测结果：来源UniqueReads6,695,6627,248,2643,941,6553,755,212430368935606064,237,0193,735,933T21T18T13胎儿面胎儿面30.25723.473-0.7192.303-0.695-0.621-0.1130.077-2.856-3.595-1.8461.62-0.761-0.4242.0271.115-2.0781.184-2.521-1.748母体面母体面胎儿面30.70522.491-0.4081.843胎儿面父亲外周血母亲外周血39假阴性的原因（1）1

12

23

31

12

23

31

12

2

2

23

3

3

31

1

1

12

2

2

23

3

3

31

12

23

31

14

45

54

45

54

4

4

45

5

5

54

4

4

45

5

5

54

45

5联会减I不分离减II6

67

76

67

76

6

6

67

7

7

76

6

6

67

7

7

7次级卵母细胞6

67

7卵子初级卵母细胞1

1

12

2

23

3

34

4

45

5

51

12

23

34

45

51

1

12

2

23

3

34

4

45

5

51

1

12

2

23

3

34

4

45

5

512345胎儿未三体自救受精精子胎盘大部分三体自救6

6

67

7

7受精卵6

67

76

6

67

7

76

6

67

7

7胎儿67胎盘（嵌合体）40假阴性的原因（2）1

12

23

31

12

23

31

12

2

2

23

3

3

31

12

23

31

12

23

31

14

45

54

45

54

4

4

45

5

5

54

45

54

45

5联会减I6

67

76

67

76

6

6

67

7

7

76

67

76

67

7卵子减II不分离初级卵母细胞次级卵母细胞1

12

21

12

21

12

21

1

12

2

23

3

34

4

45

5

5123451234512345胎儿未三体自救3

33

33

3受精4

45

54

45

54

45

5精子胎盘大部分三体自救6

67

76

67

76

67

76

67

767676767受精卵胎盘（嵌合体）胎儿41假阴性的原因（3）有丝分裂错误的三体细胞恰好发育成胎儿而胎盘细胞由多种核型细胞组成，此时由于单体细胞比三体细胞多，血浆游离DNA可能检测到小于-3的信号。三体细胞发育成胎儿部分有丝分裂错误卵裂内细胞团（胎儿）受精卵多种核型细胞发育成胎盘滋养层细胞（胎盘）42病例解读:101.基本信息：年龄：36；孕周：21w+4；2.NIPT结果：21号

Z=-4.558（短片段

cffDNA

21号

Z=-6.855）43病例解读:103.临床：21单体，孕中期存活极低；大排畸未见明显异常；未做穿刺诊断；出生后特殊面容。4.核型结果：47，XX，+2144假阴性的原因（4）卵裂受精卵内细胞团（胎儿）三体细胞发育成胎儿多种核型细胞发育成胎盘滋养层细胞（胎盘）5病例解读:111.基本信息：年龄：26；孕周：18w+4；2.NIPT结果1：21号

Z=0.776（短片段

cffDNA

21号Z=-0.168）46病例解读:113.临床：大排畸未见明显异常，出生42天死亡。4.核型结果：46，XY，+21，der(21:21)(q10:q10)47病例解读:115.重复NIPT结果：序号UniqueReads5,036,279T21T18T130.62XY第一次上机结果（第二管血浆）第二次上机结果（第二管血浆）-0.796-0.168-1.0260.684-4.862-5.46917.98118.5446,755,5720.211第四次上机结果（第一管血浆）4,831,0630.163-1.37-0.404-5.95218.69序号UniqueReadsT21T18T13XY第一次上机结果（第二管血浆）45,442,045-0.354-0.212-2.049-8.08826.405第二次上机结果（第二管血浆）第三次上机结果（第三管血浆）第四次上机结果（第一管血浆）45,442,04543,041,48640,970,148-0.017-0.301-0.7000.0150.0600.126-1.020-1.563-1.691-8.197-8.005-8.07526.74427.45128.99148假阴性的原因（5）胎儿比例低于6%时，即使以2为临界切割值仍存在一定的风险胎儿DNA浓度f%=1%Z-score>3（FN）98.63%90.98%70.92%38.91%13.77%2.61%Z-score>2（FN）86.81%58.67%24.93%6.09%f%=2%f%=3%f%=4%f%=5%0.64%f%=6%0.03%f%=7%0.25%0.00%f%=8%0.03%0.00%f%=9%0.00%0%f%=10%0%0%49假阴性的原因（4）序号诊断核型胎儿比例1

检测值1

胎儿比例2

检测值21247,XX,+2147,XY,+1847,XX,+2147,XY,+2147,XY,+1847,XY,+1847,XY