植物组织培养技术方案

关于植物组织培养技术方案第1页，课件共41页，创作于2023年2月一、基础知识1、植物的组织培养（1）细胞的分化①概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程。②举例：如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统。③特点：

a、持久性：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度；b、稳定性：细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的；c、全能性：已分化的细胞，仍具有发育的潜能。④结果：形成不同的细胞和组织。⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果。第2页，课件共41页，创作于2023年2月（2）细胞的全能性①定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。③实例：已分化的植物细胞，仍具有全能性。高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质。④全能性的比较:受精卵>生殖细胞>体细胞

植物细胞>动物细胞

第3页，课件共41页，创作于2023年2月（3）植物组织培养细胞离体①必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件②原理:细胞的全能性外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官。③相关概念:脱分化：由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化或者叫去分化。再分化：脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定形状态的薄壁细胞。第4页，课件共41页，创作于2023年2月人参的愈伤组织第5页，课件共41页，创作于2023年2月菠萝的愈伤组织第6页，课件共41页，创作于2023年2月第7页，课件共41页，创作于2023年2月第8页，课件共41页，创作于2023年2月2、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝第9页，课件共41页，创作于2023年2月（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、

Co等C、有机物、植物激素第10页，课件共41页，创作于2023年2月讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。

第11页，课件共41页，创作于2023年2月①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影响第12页，课件共41页，创作于2023年2月②生长素和细胞分裂素作用植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率高第13页，课件共41页，创作于2023年2月生长素细胞分裂素：>有利于根的分化生长素细胞分裂素：<有利于芽的分化，抑制根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h第14页，课件共41页，创作于2023年2月3、植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素>生长素细胞分裂素<生长素再分化植物细胞培养不需要光需要光第15页，课件共41页，创作于2023年2月1、培育无病毒植株2、培养紫草愈伤组织,提取紫草素（治疗烫伤和割伤的药物以及染料和化妆品的原料）4、基因工程中亦需用到植物组织培养的方法4、植物组织培养的应用：3、诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮，制成人工种子，可以解决有些作物品种繁殖能力差，结子困难或发芽率低等问题第16页，课件共41页，创作于2023年2月人工种子第17页，课件共41页，创作于2023年2月二、实验操作（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备。1、配置各种母液①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存；②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液；③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。第18页，课件共41页，创作于2023年2月2、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml。①配制培养液②调PH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素。3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。第19页，课件共41页，创作于2023年2月1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗：菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。②酒精处理：用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。③消毒液处理：取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液。第20页，课件共41页，创作于2023年2月（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种第21页，课件共41页，创作于2023年2月第22页，课件共41页，创作于2023年2月4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分第23页，课件共41页，创作于2023年2月思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。第24页，课件共41页，创作于2023年2月（四）培养1、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养第25页，课件共41页，创作于2023年2月继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养。2、愈伤组织的继代培养在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色。3、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养第26页，课件共41页，创作于2023年2月（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日。1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间。珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培。3、移栽：幼苗长壮后，移栽到土壤中（六）栽培幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。第27页，课件共41页，创作于2023年2月第28页，课件共41页，创作于2023年2月三、课题延伸1、一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养2、实例：芦荟、豆瓣绿、秋海棠、月季第29页，课件共41页，创作于2023年2月课题2月季的花药培养第30页，课件共41页，创作于2023年2月一、课题目标：说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。二、课题重点和难点：选取适宜的培养材料和培养基。三、技能目标：知道被子植物花粉发育的过程；说出产生花粉植株的两种途径；记住影响花药培养的因素，尝试花药培养的实验操作过程，并进行无菌操作；知道花药培养在育种上的意义。第31页，课件共41页，创作于2023年2月基础知识------被子植物的花粉发育：（1）雄蕊由花丝和花药两部分组成。花药是雄蕊的主要部分，多数被子植物的花药由4个花粉囊组成，花粉囊外由囊壁包围，内生许多花粉粒。当花粉囊的壁组织逐步发育分化时，会形成大量的花粉母细胞（小孢子母细胞）。（2）花粉粒是由花粉母细胞经过减数分裂而形成，因此，花粉粒是单倍体的生殖细胞。花粉的发育要经历四分体时期、单核期和双核期等阶段。第32页，课件共41页，创作于2023年2月实例一：关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（）A、花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的B、被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果C、被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段D、花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央注：花粉母细胞经减数分裂形成4个单核花粉粒，每个花粉粒的细胞核进行一次有丝分裂形成1个花粉管细胞核和1个生殖细胞核，每个生殖细胞核再进行一次有丝分裂生成2个精子。BD第33页，课件共41页，创作于2023年2月基础知识-----产生花粉植株的两种途径途径一：花粉通过胚状体阶段发育为植株；途径二：花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。人工种子是由外植体通过组织培养而获得的胚状体，然后加上人造胚乳，人造种皮而制成；外植体进行的是有丝分裂，无须通过两性生殖细胞结合而发育成的个体，属于无性生殖。第34页，课件共41页，创作于2023年2月基础知识------影响花药培养的因素1、主要的影响因素：材料的选择与培养基的组成。（1）接种的花药时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧时，花药培养成功率最高。选择完全未开放的花蕾，可挑选到单核期的花药，菌少、易消毒；花瓣松动，菌多，消毒困难。（2）此外，亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度对诱导成功率都有一定的影响。第35页，课件共41页，创作于2023年2月一、材料的选取1、选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。2、确定花粉发育时期最常用方法：醋酸洋红法；焙花青－铬矾法。注：花粉细胞核内有染色体，染色体主要由DNA和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。二、材料的消毒三、接种和培养实验操作第36页，课件共41页，创作于2023年2月四、结果分析与评价1、能够通过镜检找到处于适宜的发育期的花粉。用醋酸洋红法或焙花青－铬矾法检测单核靠边期的花粉粒。2、花药出现污染的原因：（1）消毒不彻底；（2）接种室污染；（3）人为因素的交叉污染