经典液相色谱法

第十章液相色谱分析法学习目标1.掌握色谱法的基本概念，吸附色谱法和分配色谱法的分离机制，薄层色谱法的基本原理及其应用。2.熟悉色谱法的分类，离子交换色谱法和凝胶色谱法的分离机制，各种经典的柱色谱法基本原理及其应用。学会应用薄层色谱法等对物质进行分离和鉴定。3.了解色谱法的由来和发展。一、色谱法的由来1906年由俄国植物学家Tsweet分离植物色素时开始创立，现在已经成为一种重要的分离、分析技术(分离混合物各组分并加以分析)。第一节概论Tsweet将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。茨维特(俄国植物生理学家和化学家)固定相——CaCO3颗粒流动相——石油醚色谱柱——玻璃管色谱柱：装有固定相的柱管（玻璃管或不锈钢管）；

利用物质的物理化学性质（溶解性、极性、离子交换能力、分子大小等）的不同而进行的分离、分析方法。固定相：装填在柱管（玻璃管或不锈钢管）内静止不动的一相（固体或液体）；

流动相：自上而下运动的一相（进行洗涤的气体或液体）；流动相固定相不同的颜色代表不同的组分色谱柱石油醚CaCO3二、色谱法定义色谱法构成要素（“两相一柱”）三、色谱法的发展柱色谱—20世纪初；发展趋势：新型固定相和检测器及各种检测技术的联用。薄层、纸色谱—20世纪30～40年代；气相色谱—20世纪50～60年代；高效液相色谱—20世纪70年代；超临界流体色谱法毛细管电泳法……20世纪80年代初液相色谱液体固体液-固色谱液体液体液-液色谱气体固体气-固色谱气体液体气-液色谱气相色谱流动相固定相色谱类型四、色谱法的分类1．按两相分子的聚集状态分：2．按固定相的固定方式分：3.按分离机制分：平面色谱纸色谱薄层色谱高分子薄膜色谱柱色谱填充柱色谱毛细管柱色谱分配色谱：利用溶解性质的差异进行分离吸附色谱：利用吸附性能的差异进行分离离子交换色谱：利用离子交换能力不同进行分离空间排阻色谱：利用分子大小的不同进行分离五、色谱法的特点色谱分析法具有“三高”、“一快”、“一广”的特点：■高选择性——可将性质相似的组分分开；■高效能——利用组分性质的差异，分离效果好；■高灵敏度——10-11～10-13g，适于痕量分析；■分析速度快——几～几十分钟完成一个样品分析；一次可以同时分析测定多种成分；■应用范围广——气体、液体、固体样品或化学衍生化的样品均可用色谱分离、分析一、色谱过程

色谱法是一种分离分析技术，是被分离物质在两相间（固相和液相）分配平衡的过程。以顺式和反式偶氮苯的分离为例进行说明：第二节色谱法的基本原理

开始，组分1、2都被吸附在柱上端的吸附剂上；洗脱时，组分1、2在两相间进行吸附、解吸附……作用；吸附剂对组分1、2的吸附力不同，差异变大，最终完成分离。◆色谱分离是利用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离。◆吸附能力的微小差异→微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出、吸附能力强的组分后流出。

结论：色谱法就是先将混合组分分离，然后进行逐个分析的方法。１.分配系数（K）色谱分离过程是混合物中各组分在两相间分配的过程，当分配达到平衡时各组分被分离的程度可用“分配系数”来表示。二、色谱相关术语在一定的温度和条件下，某组分在两相间达到分配平衡时，被分离组分在固定相与流动相中的浓度之比称为分配系数，用“K”表示K在一定条件下是一常数，只与被分离组分本身的性质有关。●保留时间：组分从洗脱开始到从柱中出来所需要的时间叫保留时间，用“tR”表示。2.保留值保留值包括：保留时间和保留体积。●保留体积：某组分从洗脱开始到从柱中出来所需要的流动相体积叫保留体积，用“VR”表示。3.分配系数与保留值的关系

可见，色谱分离是利用吸附剂对不同组分的吸附能力的微小差异而实现分离。分配系数的微小差异（吸附能力的微小差异）→微小差异积累→较大差异→吸附能力弱的组分先流出、吸附能力强的组分后流出。分配系数K值越大，则该组分在固定相中的浓度越大，表示被吸附剂吸附得越牢固，在柱中移动的速度越慢，保留时间越长，保留体积越大，流出越慢：反之则相反。分配系数不等是组分分离的前提。第三节柱色谱法

在柱中进行色谱分离的方法称为柱色谱法，根据分离原理的不同，柱色谱法分为:

是将固体吸附剂充填于色谱柱中作固定相，用流动相进行冲洗（洗脱）的色谱分离方法。吸附柱色谱法分配柱色谱法离子交换柱色谱法分子排阻柱色谱法柱色谱法一、吸附柱色谱法如果流动相是液体则为液—固吸附柱色谱；如果流动相是气体则为气—固吸附柱色谱。（以液—固吸附柱色谱为例进行分析）固定相装柱：如吸附剂Al2O3样品混合组分（A+B）：从柱顶倾入流动相：从顶部加入洗脱剂ABA、B两组分随流动相的流动而向下移动，A、B组分在两相不断进行着的溶解、吸附、再溶解、再吸附……过程，由于吸附剂对A、B存在吸附能力的差异，A、B移动的速率有差异，从而使两组分分离开来。A+B装柱加样洗脱1.吸附柱色谱法的分离原理

A、B组分有不同的吸附平衡常数K值。K值越大，平衡时该组分在固定相中的浓度越大，在柱中的移动的速度越慢，则该组分的保留时间越长，保留体积越大，后流出色谱柱。组分在固定相与流动相之间达到分配平衡时，分配系数称为吸附平衡常数，用Ｋ来表示。2.固定相液—固吸附柱色谱的固定相常用固体吸附剂。（1）固体吸附剂的要求较大的表面积；较强的吸附力；颗粒均匀；颗粒细小。（2）常用的固定相吸附剂常用的固定相吸附剂有：硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭、大孔吸附树脂等。A.氧化铝氧化铝吸收一定的水分后活性会降低→脱活性（失活），氧化铝的含水量越高，活性越低，吸附能力越差。碱性氧化铝pH9～10分离碱性、中性物质

中性氧化铝

pH＞7.5分离酸性碱性和中性物质

酸性氧化铝pH4～5分离酸性、中性物质硅胶表面有硅醇基→氢键作用→吸附活性中心→适用于分离酸性或中性物质B、硅胶1）硅醇基能与极性物质或不饱和化合物形成氢键物质极性↑，吸附能力↑。2）硅胶吸水→失活，加热→活化

酰胺键结构中存在的酚羟基可与酸类、酚类、硝基类以及醌类化合物形成氢键作用，因而用于这些化合物的分离分析，常用聚己内酰胺。

特性：组分形成氢键能力↑强，组分越后出柱。C、聚酰胺非极性吸附剂，适用于水溶性物质的分离。特点：在水中吸附力最强，在有机溶剂中较弱．因而水的洗脱能力最弱，有机溶剂较强。D、活性炭E、大孔吸附树脂具有大孔网状结构的高分子吸附剂，利用吸附性和筛选性相结合的分离材料，适用于水溶性化合物的分离，如苷类化合物的分离。●根据被分离组分的极性大小选择被分离组分的极性越大，则被吸附剂吸附得越牢，因此需要极性较大的流动相才能洗脱。流动相的选择应考虑被测组分的极性、吸附剂能力的大小和流动相的极性。3.流动相及其选择●根据吸附剂的活性大小选择吸附剂的活性↑，对被测组分的吸附能力↑因此：强极性组分——选择弱吸附剂弱极性组分——选择强吸附剂分离极性大的物质，选择极性大的溶剂作流动相；

分离极性小的物质，选择极性小的溶剂作流动相。“相似相溶”原则：极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂。●根据被分离组分的溶解性选择综合以上三个方面的考虑，流动相的选择方法是：

被分离组分吸附剂流动相强极性活性小强极性非(弱)极性活性大非极性或弱极性被测物质的极性、吸附剂活性和流动相极性之间的关系示意图

■装柱装柱的方法有：干法装柱和湿法装柱。装柱的要求是：均匀、平整■加样■洗脱4.柱色谱的操作方法二、液---液分配柱色谱

固定相→机械吸附在惰性载体上的液体

流动相→必须与固定相不为互溶的液体

惰性载体→仅起承载或支撑固定液的作用◆流动相携带样品流经固定相时，各组分在两相间不断地进行溶解、萃取，再溶解、再萃取的过程，分配系数大的组分移动速度慢，分配系数小的组分移动速度快。进入固定相的组分分子进入流动相的组分分子固定相分离原理：利用混合物中不同组分在两相溶剂中的溶解度不同（即分配系数不同）进行分离。

固定相→离子交换树脂

流动相→水、酸或碱溶液适用范围→只能分离离子型化合物三、离子交换柱色谱分离原理：利用各种被分离的离子与离子交换树脂交换能力（亲和力）的不同，因而在柱中移动的速度不一样而被分离。离子交换剂Θ固定离子组分离子⊕可交换阳离子阳离子交换色谱分离机制示意图分离原理:

利用被测组分分子大小不同，小分子进入凝胶内部孔穴被滞留，大分子沿着凝胶颗粒之间的空隙随流动相下移，从而被分离。

固定相→有机物制成的分子筛（多孔性网状物质）

流动相→溶解样品用的溶剂四、分子排阻色谱（凝胶柱色谱）组分的分离取决于凝胶颗粒的孔径大小和被分离物质分子的大小。出柱顺序：首先是大分子，其次是中等大小的分子，最后是小分子。。凝胶色谱分离机制示意图O：凝胶颗粒o：大分子组分·：小分子组分

第四节薄层色谱法

将固定相（如吸附剂）均匀涂布在表面光滑的平板上形成薄层，在薄板上进分离、分析的方法。铺好固定相的板称为薄板，样品的分离就在薄板上进行。与柱色谱不同，薄层色谱法是在平面上进行分离，因此称为平面色谱，纸色谱法也一样，都是属于平面色谱法。一、基本原理1.分类薄层色谱法按其分离原理可分为吸附、分配、离子交换和凝胶色谱法。其中，吸附薄层色谱法应用最广。固定相为吸附剂的薄层色谱法就是吸附薄层色谱法。其分离机制与吸附柱色谱的分离机制相似。固体吸附剂试样溶液点在薄板的一端，当展开剂（流动相）携带样品沿着薄板展开时，吸附剂对各组分的吸附能力有差别,展开剂对各组分的解吸附能力也不同，各组分移动的速度不同而被逐渐拉开距离，从而实现分离。2.分离原理薄层色谱分离示意图二、薄层色谱操作方法

将吸附剂涂铺于光滑平整的玻璃板上使成厚度均匀一致的薄层叫做制板，制备好的板应在105～110℃活化1小时，冷却后备用。一般制成的薄板有两种:1.制板、活化软板：不加黏合剂硬板：加入黏合剂常用的硅胶薄板硅胶G——自含粘和剂硅胶H——不含粘和剂硅胶HF254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光硅胶HF365——含荧光剂，365nm紫外光照发光距板一端2cm处用铅笔画一细线作为起始线，画“×”示点样位置，用平头毛细管或微量注射器点1～2滴试样溶液于“×”处(点样斑点称为原点)，斑点直径不超过2～3mm，斑点间的距离为2cm点样后用电吹干燥，点样时间不超过10分钟。2.点样点样3.展开点样点不得浸入展开剂中，待展开剂展开到薄板的3/4高度时取出薄板，,标记好前沿线。4.显色取出薄板,检查斑点有无颜色，若无色斑则用显色剂显色，然后标出位置和斑点大小.5.定位找“两点”、划“两线”、量“两距离”两点：原点和斑点两线：起始线和溶剂前沿线两距离：原点到斑点中心的距离和原点到溶剂前沿的距离6.计算比移值（1）比移值Rf原点到斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离叫做比移值用“Rf”

表示。（2）相对比移值Rs试样组分Rf,与对照品的Rf,值之比就称为相对比移值Rs。

Rf(A)=a/cRf(B)=b/c

薄层色谱中一般要求各斑点的Rf值在0.2