卫生化学 ppt课件 12色谱概论

色谱分析法概论色谱法是一种重要的分离分析方法，它是根据组分在两相中作用能力不同从而达到分离目的。IntroductionofChromatography色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography1.色谱法的起源2.色谱法的发展3.色谱法的分类色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法是什么？(What?)色谱法（Chromatography）与蒸馏、重结晶、溶剂萃取、化学沉淀及电解沉淀法一样，也是一种分离技术，但它是多种分离技术中效率最高、应用最广的一种方法。随着色谱检测技术的发展，色谱已不仅是一种分离技术，也是一种分析方法。当今的色谱法，包括分离和检测两个部分，因而通常也称为色谱分析（chromatographicanalysis）。

色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的起源1903年，俄国植物学家茨维特（Tswett）把植物的石油醚浸取液倒入装有碳酸钙填充料的玻璃管，然后用石油醚淋洗，在柱管上形成不同颜色的色带，茨维特称之为“色谱”。通过萃取各个色带中组分，或分段收集从柱中淋洗出的各色带的洗出液，便可分离得到浸取液中的叶绿素和其它物质。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatographyPhase1Phase2Phase3色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography1234567“Chromatogram”1－白色吸附剂；2－黄色(叶黄素β)；3－墨绿色(叶绿素)；4－浅绿色；5－黄色(叶黄素α′，α″)；6－白色吸附剂；7－橙黄色(叶黄素α)。色谱法的起源色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的起源此法中所用的玻璃管称为色谱柱（column）；管内填充的固体材料称为固定相（stationaryphase）；淋洗液称为流动相（mobilephase）。这种方法称为色谱法（chromatography）。后来，这种方法也用来分离无色物质，但色谱一词仍沿用至今。也有人称之为层析法。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展1903年茨维特（Tswett）建立的以吸附剂为固定相的吸附柱色谱法。1935年，产生了用离子交换剂作固定相的离子交换柱色谱法。1941年马丁（Martin）及辛格（Synge）发明了以液体为固定相的分配柱色谱法。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展1944年，马丁等人用滤纸作分配色谱的载体，建立了纸色谱法。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展1952年，马丁等人以气体作流动相，建立了气相色谱法。这一年，马丁因其在色谱领域所作的杰出贡献获得诺贝尔化学奖。气相色谱仪气相色谱仪结构示意图色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。薄层色谱法色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展1959年出现凝胶过滤色谱法。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展1968年前后把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展在二十世纪的八十年代初，又产生超临界流体色谱法。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展在二十世纪末，在亲和色谱的基础上，产生了生物色谱法。生物色谱法（Biochromatography）是采用各种具有生物活性的材料（例如，酶、载体蛋白、细胞膜、活细胞等）作固定相的一种新兴色谱技术。由于这种具有生物活性的固定相能特异性地结合与人类生命活动有关的各种生物活性物质，所以在医学和药学研究中，可以利用生物色谱技术，分离和制备各种具有生物效应的物质。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的发展

气相色谱法和高效液相色谱法的出现,使色谱法具有高效、高选择性、快速、灵敏、所需样品少、适用范围广的特点，并向自动化、智能化的方向发展，成为非常有效的分离分析方法。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography

广泛的应用领域---食品及农业/质检/

医药/生命科学/石化……

色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography用超临界流体作为流动相的色谱法称为超临界流体色谱法SupercriticalFluidChromatography

SFC流动相和固定相的物理状态用气体作为流动相的色谱法称为气相色谱法GasChromatograph,GC用液体作为流动相的色谱法称为液相色谱法LiquidChromatograph,LC色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography色谱法的分类（一）按流动相和固定相的物理状态分类气相色谱:

气固色谱（GSC）：固定相为固体吸附剂。气液色谱（GLC）：固定相为液体（涂布在担体或毛细管壁）。液相色谱:

液固色谱（LSC）：固定相为固体吸附剂。

液液色谱（LLC）：固定相为液体（涂布在担体）。超临界流体色谱：固定相为液体（涂布在担体或毛细管壁）。色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography利用不同组分与固定相的高专属性亲和力进行分离的技术亲和色谱法（AC）生物色谱法利用大小不同分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法。又称为凝胶色谱法排阻色谱法SizeExclusionChromatography，SEC利用组分在离子交换剂上的亲和力大小不同而达到分离的方法离子交换色谱法IonExchangeChromatography，IEC利用组分在固定液中溶解度不同而达到分离的方法分配色谱法PartitionChromatography利用组分在吸附剂上吸附能力强弱不同而进行分离的方法吸附色谱法AdsorptionChromatography按分离机制分类色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography柱色谱法ColumnChromatography

将固定相置于柱管内进行分离的方法。按照管柱的粗细和固定相的填充方式又分为：填充柱色谱法（PackedColumn）毛细管柱色谱法（CapillaryColumn）平面色谱法PlanarChromatography

又称平床色谱法FlatBedChromatography按平面色谱材料不同可分为：薄层色谱法（ThinLayerChromatography）将固定相涂铺在玻璃板、铝箔板或塑料板等上纸色谱法（PaperChromatography）将含水滤纸作固定相的（三）按固定相的形状分类色谱法绪论色谱法的起源、发展和分类IntroductionofChromatography1.按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）3.按固定相在支持体中的形状分柱色谱平面色谱纸色谱薄层色谱2.按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱亲和色谱色谱法绪论经典液相色谱法IntroductionofChromatography何谓经典液相色谱法？传统的液相色谱法，包括各种柱色谱法、纸色谱法、薄层色谱法等，称为经典液相色谱法。由于经典液相色谱法具有样品容量大、所需设备简单、操作方便、成本低，所以适用于样品的初步分离和提纯，也可作初步的定性和定量分析色谱法绪论色谱法的基本步骤IntroductionofChromatography色谱法的基本步骤第一步：根据试样分析目的选择固定相，按操作形式的要求制备成色谱床（装填成色谱柱，或涂铺到薄层板上等）。第二步：进样（或点样）。将处理好的样品以一定方式加到固定相的一端。第三步是洗脱或展开。将流动相以一定速率载运样品连续通过固定相，使样品各组分在两相相对运动中彼此分离。第四步是收集从色谱床上分离的各组分，进行检测（定性、定量分析）。色谱法绪论色谱法的分离过程IntroductionofChromatography色谱法的分离过程

当流动相携带样品对固定相作相对运动时，由于试样中各组分性质和结构差异，与固定相和流动相之间相互作用（如吸附力、溶解力、离子交换力、分子排阻力和亲和力等）有微小差别，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移（differentialmigration），从而使有微小差异的不同组分被分离。

色谱法绪论IntroductionofChromatography色谱法的分离过程色谱法绪论IntroductionofChromatography色谱分离过程中的两个重要特点：

差速迁移

谱带展宽差速迁移与防止谱带展宽是研究色谱分离过程必须考虑的两个重要环节。色谱法的分离过程色谱法绪论IntroductionofChromatography色谱分离过程中的两个重要特点：差速迁移：在色谱分离过程中，由于试样中各组分与固定相和流动相的作用力不同，使得不同组分被流动相运载移动的速率不同，产生差速迁移，从而使有微小差异的不同组分被分离。

差速迁移是色谱分离的基础。谱带展宽：同一组分的分子在色谱分离过程中会发生沿色谱柱纵向的扩散分布，使谱带变宽，称为谱带展宽。严重的谱带展宽会使相邻组分色谱峰互相重叠而难以分离。谱带展宽是影响色谱分离的重要因素。色谱法的分离过程

吸附柱色谱法的基本原理：吸附剂通常是多孔径的固体颗粒物质，在它的表面存在分散的吸附中心。吸附色谱的实质就是根据组分在吸附剂上吸附能力的不同来进行分离。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography吸附柱色谱法的基本原理：当试样中组分分子（X）被流动相带入柱内后，在吸附剂表面将发生组分分子（X）与吸附在固定相上的流动相分子（S）的竞争吸附，直到组分分子被吸附到固定相上的速度与其从固定相上解吸下来的速度相等时，达到吸附平衡。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography吸附平衡及吸附平衡常数Kad可表示如下：

Kad的大小取决于组分分子和吸附剂之间以及组分分子和流动相之间作用力的强弱。不同的组分Kad数值不同，Kad值大表示组分在吸附剂上保留强，难以洗脱；Kad值小表示组分在吸附剂上保留弱，易于洗脱。试样中各组分由于kad值不同，在柱色谱过程中得以分离。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography吸附等温线（adsorptionisotherm）在一定温度下，组分在吸附剂表面被吸附达到平衡时，组分在两相中浓度相对关系的曲线，称为吸附等温线。它用于描述组分在吸附剂上的吸附规律。吸附等温线的横坐标为流动相中组分的浓度，纵坐标为被吸附在固定相上的组分的浓度。吸附等温线通常有直线型，凸线形、凹线形三种。

液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography三类等温线与相应的色谱峰液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography吸附等温线（adsorptionisotherm）凸形等温线：吸附色谱容易出现凸形等温线，形成拖尾峰。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography凸形等温线形成原因：吸附剂表面常有多种吸附力不同的吸附点位，溶质分子总是先占据吸附力强的点位，然后再占据吸附力弱的点位。这样，溶质在浓度低时被吸附剂吸附得较牢固，浓度高时吸附力相对减弱。因此，组分高浓度部分的色谱谱带中心部分移动较快，赶上了色谱谱带的前沿部分，而色谱谱带的后沿部分由于吸附较牢固而延迟流出，这样就形成前缘陡峭，后部拖尾的不对称色谱峰。组分浓度较高时，出现凸形等温线较多。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography吸附等温线（adsorptionisotherm）凹形等温线：吸附色谱出现凹形等温线的情况较少，形成前缘平缓，后缘陡峭的不对称色谱峰。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography凹形等温线形成原因：有时因组分浓度较高时，有时在吸附过程中与固定相之间发生相互作用，影响了吸附剂表面的性能，或组分之间的相互作用，使得谱带中心的组分高浓度区域吸附较强，从而移动较慢，这样就形成前缘平缓，后缘陡峭的不对称色谱峰。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography吸附等温线（adsorptionisotherm）直线形等温线：吸附色谱出现直线形等温线的情况也较少。这是理想的吸附等温线。得到对称的色谱峰形。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography直线形等温线形成原因：液相柱色谱法吸附柱色谱法1直线形等温线的直线斜率是一恒定常数，相当于某组分在两相中的吸附平衡常数Kad。2由于Kad恒定，所以谱带中各处的组分分子都以相等速率向前移动，因此得到对称色谱峰形。Adsorptionchromatography吸附等温线（adsorptionisotherm）吸附等温线仅在较低的浓度范围内呈线性。所谓吸附剂的线性容量就是指吸附等温线保持线性、能得到正常色谱峰形时，色谱柱对样品的最大负载量（以每克吸附剂能吸附的样品量表示）。其实，在凸形等温线的起始部分，即低浓度时，也近似为直线。所以，为了得到较好的色谱峰形，应选择较小的进样量。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography

固定相（吸附剂）吸附柱色谱所用固定相为吸附剂。对吸附剂的基本要求是：①吸附剂为粒度均匀，有一定机械强度的细颗粒；②具有较大的表面积，吸附剂表面的活性程度均匀，即吸附点位的吸附能力大小均匀，吸附剂的线性容量大；③不与流动相和被测组分发生化学反应；也不溶于流动相。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography

常用的吸附剂可分为极性和非极性两大类。极性吸附剂包括各种无机氧化物，如硅胶，氧化铝、氧化镁、硅酸镁及分子筛等；非极性吸附剂最常见的是活性炭。其中最常用的吸附剂是氧化铝和硅胶。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography硅胶（SiO2·xH2O）有微酸性，适用于分离酸性和中性物质，是柱色谱和薄层色谱最常用的吸附剂。为多孔性硅氧烷交联结构，表面具有活性基团硅羟基，可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而具有吸附性。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography硅胶（SiO2·xH2O）水能与硅胶表面的羟基结合生成水合硅羟基，使硅胶失去吸附力。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography硅胶（SiO2·xH2O）当加热至100oC左右又能可逆地除去水，这些表面吸附的水称为“自由水”，加热去水过程称为活化。可见硅胶的活性与含水量有关。

液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography硅胶的活化：一般为110oC加热30min。加热到200oC，表面吸附水全部脱附，只剩下表面硅羟基，活性最高；加热至700oC，大部分硅羟基不可逆地变成硅氧烷，对极性分子丧失吸附选择性，不再适用于吸附色谱。

液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography

氧化铝：一种分离能力强、活性可以控制，应用较广的强极性吸附剂。供柱色谱使用的氧化铝有酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝适用于分离酸性物质，例如羧酸和氨基酸。中性氧化铝适用于烃、生物碱、萜类、甾族、甙类、酯、内酯、醛、酮、醌类化合物，尤其是多环芳烃的分离，凡是酸性、碱性氧化铝上可以分离的化合物，中性氧化铝都能分离。碱性氧化铝适用于胺类或其它碱性化合物的分离。

液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography与硅胶一样，氧化铝也能强烈地吸水，水不易被其它化合物置换，因而使其活性降低。通常也采用加热方法使其活化。氧化铝以及硅胶的活性与含水量关系：活性的强弱用活度级数表示，其活性越高，活度级数值越小，吸附剂的含水量越低。吸附剂选择的基本原则是：分离弱极性物质一般选用强极性吸附剂，分离强极性物物质，应选用活性弱一些的吸附剂。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography硅胶、氧化铝的含水量与活性关系

液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography流动相（洗脱剂）在吸附柱色谱中，流动相的选择要比固定相更重要。实际操作中，常常是选定吸附剂后，通过改变流动相的性质和组成来实现较好的分离。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography流动相（洗脱剂）.对洗脱剂的基本要求：（1）纯度合格。

（2）对样品有一定的溶解能力，不与样品和吸附剂发生不可逆的化学反应。（3）粘度小,能保持一定的洗脱速率。（4）性质稳定，有一定挥发性，对分离组分回收率没有干扰。（5）与检测手段相匹配。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography流动相（洗脱剂）的选择：洗脱剂选择通常根据“相似相溶”的原理。对极性大的试样采用极性较强的洗脱剂；对极性弱的试样则采用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数εo来衡量。εo越大，表示洗脱剂的极性越强。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography流动相（洗脱剂）的选择：常用流动相及其极性从大到小的顺序是：水，甲醇，乙醇，丙酮，正丁醇，乙酸乙酯，氯仿，乙醚，甲苯，苯，四氯化碳，环己烷，石油醚。对于多组分复杂混合物的分离难以用一种溶剂实现，可用两种或两种以上的溶剂，按一定比例组成混合溶剂进行洗脱。

液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography分离条件的选择（综合）：选择吸附柱色谱的分离条件时，必须从吸附剂，洗脱剂，被分离的物质三方面综合考虑。通常，当采用硅胶或氧化铝作吸附剂时：对较强极性组分分离时，选用吸附活性较弱的固定相，极性较强流动相；而对较弱极性组分分离时，选用吸附活性较强固定相，极性较弱流动相。即吸附色谱中，被分离物质与流动相极性一致。液相柱色谱法吸附柱色谱法Adsorptionchromatography分配柱色谱法：固定相为涂布在载体上的一层固定液，载体可以用硅胶、多孔硅藻土等惰性物质，固定液可选用不同极性的溶剂；流动相是与固定液不相混溶的某种溶剂。由于固定相和流动相均为液体，故又称为液液分配色谱法。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography分配柱色谱法与吸附色谱法相比，具有以下优点:(1)适用的样品类型广；

(2)重现性好；

(3)稳定性高；

(4)谱带对称，不拖尾。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography分配柱色谱法的分离原理液液分配色谱的分离原理是根据被分离的各个组分在两种互不相溶的液体中溶解度不同，即组分在两相中达到分配平衡时具有不同的分配系数（K=Cs/Cm）来实现的。这种分配平衡可在色谱柱中反复多次进行，各组分因分配系数K不同而产生差速迁移，从而得到分离。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography色谱法绪论色谱法的基本参数IntroductionofChromatography1.分配平衡（distributionequilibrium）在一定温度、压力下，组分在一小段分配色谱柱的固定相和流动相内发生的溶解-挥发的过程称为分配过程。当分配达到平衡时，每种物质分子在固定相和流动相中浓度比例（即，分配系数）不同，造成不同物质分子随流动相向前移动的速度不同（即产生差速迁移）。色谱分离过程是不同物质分子在相对运动的两相之间，多次分配平衡而得到分离的过程。色谱法绪论色谱法的基本参数IntroductionofChromatography1.分配系数（distributioncoefficient）K

在一定的温度和压力下，某个组分在固定相（S）与流动相（m）中达到分配平衡时的浓度之比，称为该组分的分配系数，即，K=Cs/Cm

。色谱法绪论色谱法的基本参数IntroductionofChromatography分配系数（distributioncoefficient）K

K值的大小与组分、固定相及流动相的性质和温度有关，与两相的体积无关。不同组分在两相之间具有不同的分配系数K，使得不同组分在柱中产生差速迁移而得到分离。分配系数K的定义是根据分配色谱类型规定的。与其意义相近的常数，在吸附色谱中为吸附平衡常数，在离子交换色谱中为选择系数，在凝胶色谱中为渗透系数。色谱法绪论色谱法的基本参数IntroductionofChromatography分配比（partitionratio）k

又称为容量因子，在一定的温度和压力下，某个组分在两相分配达到平衡时，分配在固定相和流动相中的摩尔数或质量之比，即

k

=ns/nm

或k=ms/mm=CsVs/CmVm=KVs/Vm

式中ns，nm依次为组分在固定相和流动相中的摩尔数，Vs,Vm依次为固定相和流动相的体积，ms,mm依次为组分在固定相和流动相中质量。色谱法绪论色谱法的基本参数IntroductionofChromatography分配比（partitionratio）k

k值越大，说明组分在固定相中的量越多，它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。k值的大小由组分与两相的热力学性质决定，随温度、压力与两相体积的变化而变化。

(k=KVs/Vm

)

分配色谱法的固定相分配色谱的固定相就是涂渍在惰性载体表面上的固定液。只有基本不被流动相溶解或溶解度很小的固定液才有使用价值，所以，适用的固定液品种并不是很多。同时，由于流动相极性的微小变化都会使组分的保留值出现较大的改变，因此，只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。最常用的强极性固定液为β、β,-氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇和非极性的角鲨烷等。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography分配色谱法的固定相载体又称担体，仅起负载固定液作用，是惰性的多孔固体颗粒。要求其有较大的比表面积，且对样品无吸附作用。常用的载体有多孔硅胶、硅藻土、纤维素和有机支持体如微孔聚乙稀小球等。

液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography流动相在液液色谱中，要求流动相纯度高、粘度小、尽可能不与固定相互溶，即流动相与固定相之间极性差别越大越好。此外，为防止固定液的流失，流动相须预先用固定液饱和。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography流动相一般来说，在分配色谱中，固定液对于被分离组分是一种溶解度较大的溶剂，而选用的流动相对于被分离组分是一种溶解度较小的溶剂。这样可使组分在两相中分配比k控制在一定范围内，否则组分会从柱上很快洗脱下来而不能获得良好的分离。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography正相分配色谱和反相分配色谱液液分配色谱根据所用流动相和固定相的极性，可分为：正相分配色谱(normalphasepartitionchromatography，NPC)反相分配色谱(reversedphasepartitionchromatography,RPC)液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography正相分配色谱：以极性较强的溶剂涂在载体上作为固定相(如-NH2,-CN,-OH)以极性较弱的溶剂(如正己烷)作流动相的分配色谱，亦称常规分配色谱。适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography反相分配色谱：以极性较弱的溶剂涂在载体上作为固定相(-CnHm)；以极性较强的溶剂（如甲醇，水，乙腈）作流动相的分配色谱。适用于非极性及弱极性化合物的分离。其流出顺序与正相分配色谱正好相反，即，极性大的先流出，极性小的后流出。可以看出，在分配色谱法中，被分离物质与固定相的极性一致。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography正相分配色谱：常用的固定液有水、不同pH值的水溶液，以及甲醇、乙醇、甲酰胺等极性溶剂。常用的流动相有苯、甲苯、环己烷、乙酸乙酯等。反相分配色谱：常用的固定液有辛烷、氯仿、硅油和石蜡等，常用的流动相有水、不同pH值的水溶液，以及甲醇、乙醇、甲酰胺、乙二醇等极性溶剂。液相柱色谱法分配柱色谱法partitionchromatography离子交换色谱法(ionexchangechromatography)

是以离子交换剂为固定相，利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的液相色谱法。主要用于离子型化合物的分离。

离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法Sober和Peterson于首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝（Sepharose）上。离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法离子交换色谱法操作简便，无需特殊设备，而且离子交换剂具有再生能力，可以反复使用。对于无机或生物化学领域离子性化合物的分离，离子交换色谱是最有效的方法。离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法离子交换原理在离子交换柱中，待测物质在流动相中电离产生的样品离子Xm和流动相离子Ym，与固定相上带电荷的交换基团Rs进行离子交换。以单价离子为例，离子交换反应的一般通式可表达为，

Xm+RsY

Ym+RsX

离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法由于试样中各种被测离子与离子交换剂的相互作用（或称亲和力）有强弱，在流动相离子的竞争下，作用强的不易洗脱，作用弱的能较快洗脱，在反复进行的离子交换柱色谱过程中产生差速迁移，因而得到分离。KXY是评价分离能力的一个标准。如KXY>1，说明X离子交换能力大，难以洗脱；KXY<1，则说明X离子交换能力小，容易洗脱。一般来说，X离子电荷越大，水合离子半径越小，KXY值就越大。离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法固定相（离子交换剂）通常使用合成的离子交换树脂（聚苯乙烯）和离子交换纤维素作固定相。按可交换的活性基团不同，离子交换剂可分为四种：强酸性阳离子交换剂（交换基团为-SO3H）；弱酸性阳离子交换剂（交换基团为-COOH）；强碱性阴离子交换剂（交换基团为-N+R3X-）；弱碱性阴离子交换剂（交换基团为-NH2，-NHR或

-NR2）。离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法离子交换树脂的指标（1）交联度（degreeofcrosslinking）

以应用最广泛的聚苯乙烯型合成树脂为例，它是以聚乙烯为直链，二乙烯苯把直链交联起来形成的网状结构。二乙烯苯称为交联剂。树脂中交联剂的含量叫交联度，以重量百分比表示，范围从1%到16%。交联度大，树脂网状结构紧密，网孔小，大离子难进入，交换速率慢，选择好，适用于分子量较小的离子性物质分离。交联度小，网孔大，交换速率快，选择差，适用于分子量较大的离子性物质分离。离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法离子交换树脂的指标（2）交换容量（exchangecapacity）指每克干树脂能参加交换反应的活性基团数，单位为mmol/g或mmol/ml，其值反映树脂交换的能力。（3）粒度

指离子交换树脂颗粒的大小，用树脂溶胀态后，树脂能通过的筛孔数表示。制备纯水多用10~50目，色谱分析一般为100~200目。离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法流动相离子交换色谱的流动相大多为水缓冲溶液，有时也可混入甲醇或乙醇等有机溶剂。通过调节流动相pH值和盐浓度（或离子强度）就可调整样品组分的保留值。1.增加盐离子浓度，则削弱试样离子的竞争交换能力，使试样离子保留值降低。2.流动相pH值的变化，能导致可解离化合物在溶液中电离度发生变化。如果电离度增大，则试样的保留值也增大。3.如在流动相中添加有机溶剂，可使峰的拖尾得到改善，调节试样组分保留值。

离子交换色谱法ionexchangechromatography液相柱色谱法凝胶色谱法(gelchromatography)又称尺寸排阻色谱法(sizeexclusionchromatography)。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品各组分的液相色谱法。对于水溶性试样采用水溶液为流动相，称为凝胶过滤色谱法(gelfiltrationchromatography)；对于非水溶性试样采用有机溶剂为流动相，称为凝胶渗透色谱法(gelpermeationchromatography)。凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法凝胶色谱法应用：用于分离高分子化合物并测定其分子量；用于除去高分子（如蛋白质，核酸，多糖等）溶液中低分子量杂质，此操作叫脱盐；用于不稳定生物高分子稀溶液的浓缩；用于酶、蛋白质、氨基酸、核苷酸、多糖、激素、抗生素、生物碱等物质的分离提纯。

凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法凝胶色谱法分离原理凝胶色谱是以依据物质组分分子的尺寸和形状不同来实现分离的。凝胶色谱的固定相为化学惰性多孔网状结构的凝胶，凝胶内具有一定大小的孔穴。当样品组分进入色谱柱，体积大的分子不能渗透到孔穴中而被排除，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透进入较大的孔穴；小分子可完全渗透进所有孔穴，最后洗出。此过程在色谱柱内循环重复进行，使样品分子按分子大小先后由柱中流出，得到分离。凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法固定相凝胶色谱固定相种类很多，按机械强度不同可分为软质、半硬质及硬质凝胶三类(通常用凝胶含水量来判断）。葡聚糖凝胶是最常用的凝胶，它由葡聚糖经稀盐酸降解后，用环氧丙烷交联制成。凝胶的交联度越小，其网状结构的孔隙就越大，吸水量就越大，其机械强度就越小。凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法固定相常用的交联葡聚糖凝胶，交联聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，属于软质凝胶，适用于水溶液体系，主要用于分离生物高分子，如酶、蛋白质、核酸以及多糖类。半硬质交联聚苯乙烯凝胶，常用于有机溶剂系统，可分离各种高分子聚合物。凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法流动相凝胶色谱的流动相必须能溶解样品，并且与固定相凝胶性质相似，能浸润凝胶，防止凝胶吸附作用。当采用软性凝胶时，流动相必须能使凝胶溶胀。溶剂的粘度要低，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。选择溶剂还必须与采用的检测器相匹配。常用的流动相有水和四氢呋喃、甲苯、邻二氯苯、二氯乙烷、氯仿、苯、二甲基酰胺等。凝胶色谱法gelchromatography液相柱色谱法经典液相柱色谱法与仪器分析的色谱新技术比较，选择性差，分离速度慢，分离重复性和灵敏度较低。但是，此法柱内径大，样品容量大，且不需要特殊的仪器设备，操作方便，因而成本低。它适用于样品分组分离或初步分离，纯样品制备，亦用于试样的脱色，脱脂，共存干扰物去除等初步纯化。在有机合成，天然产物，植物化学，中草药成份分离等领域，以及环境、食品、劳动等医药卫生领域仍是必备的分离纯化手段。液相柱色谱法特点和应用

平面色谱法

(PlanarChromatography)又称平床色谱法，是将固定相涂铺在平面载体上，用溶剂把样品展开而分离的一种液相色谱法。它包括薄层色谱法和纸色谱法。薄层色谱法是20世纪50年代，在柱色谱和纸色谱基础上发展起来的分离分析技术。根据分离原理，它又可分为吸附、分配、离子交换及凝胶色谱等类型，通常所指的薄层色谱法属吸附色谱。薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法方法原理薄层色谱法是将吸附剂（固定相）均匀地涂铺在表面光洁的玻璃、塑料或铝铂上制成薄层板。把待分析样品滴加在薄层板一端的起始线上（称为点样）。放入密闭容器（称层析缸或展开槽）中以适当的溶剂（也称展开剂）展开。在薄层板上吸附剂的毛细管作用下，溶剂载带着试样缓缓移动，各组分在两相之间不断地发生吸附、解吸的重复过程。由于不同组分的吸附系数不同，移动速率不同，展开一定时间后，各组分互相分离，在薄层板的不同位置上形成不同的斑点。薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法方法原理各组分在薄层上的位置用比移值Rf表示

Rf值与物质性质以及流动相和固定相性质有关，还受色谱操作条件的影响。当色谱条件一定时，物质的Rf值为定值，Rf值可作为定性的依据。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法方法原理由于影响Rf值的因素较多，Rf值难以重复。为消除因色谱操作条件而引起的误差，建议用相对比移值Rst，定义为：

Rst为样品组分移行距离与参考物质移行距离之比，它可消除系统误差，更适宜作定性参考。参考物质可以是另外加入的物质，也可以是样品中的另一组分。薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法

吸附剂薄层色谱最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝，粒度较细，约为200目（10~40μm）左右。当这两种吸附剂不适宜时才选用其它吸附剂，如聚酰胺、硅藻土、纤维素等。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法展开剂薄层色谱的展开剂可用单一溶剂，也可用混合溶剂。常用溶剂及其选择原则与液相吸附柱色谱法相同，即从被分离组分极性，吸附剂活性和展开剂的极性三个因素综合考虑：当分离极性较小的物质时，应选用活性级别较低（活性较强）的吸附剂，极性较小的展开剂。

当分离极性较大的物质时，应选用活性级别较高（活性较弱）的吸附剂，极性较大的展开剂。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法展开剂实际工作中，选择展开剂常通过实验来摸索。一般先用单一溶剂进行展开，根据待测组分在薄层板上的分离效果，进一步考虑改变展开剂的极性或用多种混合溶剂按一定比例混合试验，直到能良好分离为止。通常要求组分的Rf值在0.2～0.8之间，各组分的Rf值之差大于0.05，以防斑点重叠。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法展开剂在用多元混合展开剂时，各种溶剂所起作用不同。占比例大的溶剂在展开过程中主要起溶解物质和基本分离作用。占比例较小的溶剂主要起调整改善各组分Rf值的作用。一般选用极性比分离物质极性低的溶剂为主要溶剂，否则将使Rf值太大或跟随溶剂到前沿。在分离酸性或碱性组分时，在展开剂中加入少量酸或碱，可使这些物质斑点集中，提高分离度。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法

操作技术1.薄层板的类型、制备和活化（1）类型

薄层板有不加粘合剂的软板和加粘合剂的硬板两种类型。软板无商品，须自制。硬板有商品，也可以自制。常用的粘合剂有煅石膏(Gypsum,2CaSO4·H2O)、羧甲基纤维素钠（CMC—Na），淀粉和聚丙烯酸（为高效薄层板常用粘合剂）。硬板商品有：硅胶G（含煅石膏作粘合剂）、硅胶H（不含粘合剂）、硅胶HF254、硅胶GF254、硅胶HF254+366及高效硅胶薄层板等。F代表含荧光剂，在254nm或366nm紫外光下可观察到荧光，这类薄层板适用于本身不发荧光且不易显色的试样。氧化铝也因是否含粘合剂或荧光剂而分为氧化铝G，氧化铝GF254及氧化铝HF254等品种。薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法

操作技术1.薄层板的类型、制备和活化（2）制备

薄层板制备的好坏直接影响薄层色谱的效果，薄层要求均匀而且厚度（0.25~1mm）一致。薄层色谱通常采用硬板，用湿法制备，即在加粘合剂的吸附剂内按一定比例加水或其它溶剂、溶液，调成糊状后铺层。湿法铺层有倾注法，刮层平铺法和涂铺器铺层法，其中涂铺器制板简单，制成的板均匀光滑。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法

操作技术1.薄层板的类型、制备和活化（3）活化把涂好的薄层板于室温下放平，自然凉干后，放入烘箱加热活化，活化条件根据需要而定。硅胶板一般在烘箱中逐渐升温，维持105~110oC活化30min。氧化铝板在200oC烘4h可得活性II级的薄层，150~160oC烘4h可得活性III~IV级的薄层。常用的氧化铝和硅胶活性为II~III级。为使实验结果具有良好的重现性，薄层板吸附剂的活性应保持一致，故分析前应对薄层板的活性进行测定。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法

操作技术

2.点样

通常将样品溶于低沸点且极性与展开剂相似的溶剂，配成1%试液，应避免用水，以防样点在展开时扩散。用直径小于1mm的毛细管或微量注射器点样，也可用滤纸移样。点样量要适中，一般斑点直径不超过2~3mm，现已有商品点样装置可供使用。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法

操作技术

3.展开

样点上溶剂挥干后，即可进行展开。展开的展开缸要求磨口密闭。常用上行展开法，软板采用近水平方向（薄层板与水平约成5~10o角），硬板用近垂直方向（薄层板与水平成45o~60o角或垂直）展开。对Rf值小的物质可用下行展开法，即在薄层板上方放置一溶剂槽，用滤纸或纱巾把溶剂引到板的上端，借助重力作用使展开剂下移。此法展开较快，但分离效果不好。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法平面色谱法薄层色谱法

PlanarChromatography薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法操作技术对组成复杂的混合物一次展开不能完全分离时，可采用二次展开，连续展开或双向展开。二次展开是在第一次展开后，待溶剂挥干，再用相同或不同极性的溶剂以同样的方法再展开一次。薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法当用混合溶剂展开时，要防止产生“边缘效应”（edgeeffect）。边缘效应是指同一组分的斑点在薄层中部比在边缘移动慢的现象。由于展开缸中混合溶剂未饱和，极性弱的溶剂在两边缘处易挥发，使展开剂组成与中部不同，边缘处含更多极性大的溶剂，洗脱能力强，因此Rf值较大。可用在展开缸内衬一滤纸以加速溶剂蒸发饱和，并将薄层板两侧边缘吸附剂刮去1~2mm的方法消除边缘效应。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法操作技术4.显色

展开后的斑点若没有颜色，则须用显色方法定位。常用方法有：

（1）紫外光照射法

在紫外光（常用汞弧灯）照射下，如样品能产生荧光，可观察荧光斑点；若样品不产生荧光而吸附剂中含荧光物质（如硅胶GF254），板上显荧光，斑点为暗色。薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法操作技术4.显色

（2）气熏显色法

将几粒碘置于密闭容器中，待碘蒸气饱和后，将展开后的干燥薄层板放入，碘与化合物可逆地结合，斑点显淡棕色。薄层板取出后，碘即升华逸出。因此显色后应立即标记斑点。

（3）喷洒显色剂法

软板一般采用湿态显色，硬板应在溶剂挥干后才喷显色剂显色。此法显色后的物质已被破坏，不能再行回收。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法定性定量

1.定性

薄层色谱法的定性依据是组分的Rf值，根据样品与纯品的Rf值对照定性。由于Rf值受很多因素影响，重现性差，文献查得的Rf值只能作定性参考。实际工作中，是将样品与纯品于同一薄层板上以完全相同的条件操作，根据测得的Rf值确认。也可采用相对比移值Rst确认。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法定性定量

2.定量

薄层色谱通常简易的定量方法为：

（1）目视比较定量法

在同一薄层板上比较样品和纯品斑点大小及颜色深浅，估计样品的大概含量。

（2）洗脱法

用适当的方法将斑点位置的吸附剂全部取下，用溶剂将组分洗脱下来，再用光度法或其它分析方法定量。此法要求斑点无拖尾，组分洗脱率要高，比较麻烦费时。目前，比较精确的定量方法是应用专用的薄层扫描仪或光密度计，直接在板上测量斑点的深浅大小。即薄层扫描定量法。

薄层色谱法

PlanarChromatography平面色谱法薄层扫描法（Quantitati