凝血因子Ⅷ抑制物测定试验标准操作程序-202

凝血因子皿抑制物测定试验标准操作程序1检验目的明确凝血因子皿抑制物测定试验的操作程序，指导检验人员正确进行凝血因子皿抑制物测定试验的检测。测定甲型血友病患者血液中凝血因子皿抑制物的含量。2检测原理将受检者血浆与已知量的正常人因子皿血浆（乏血小板）混合，温育一定时间后，测定剩余凝血因子皿的活性，把受检温育混合物和正常温育混合物的因子皿活性进行比较，以Bethesda单位来计算抑制物的含量，1个Bethesda单位相当于灭活50%因子皿的量。3标本采集患者准备患者应处于休息状态下进行，早餐前采血。服用某些药物或某些生理状况下（如怀孕、情绪激动或剧烈运动）会对一些凝血试验结果造成影响。所以一般在进行此类检测时，应停用有关药物一周，因故不能停药者必须注明。标本采集容器与添加剂血液标本采集的容器是一次性含枸橼酸钠溶液的真空采血管（蓝头）。抗凝剂与血的比例是1:9（即1份抗凝剂与9份血液混合），此比例必须准确，否则影响检测结果。若果血球比积＜20%或＞55%,须调整血与抗凝剂比例，方法是：0.00185X血液毫升数X（100-压积）二抗凝剂毫升数。血浆，枸橼酸钠抗凝（抗凝剂与血的比例为1:9）。4设备和试剂设备STA-R全自动凝血分析仪恒温水浴箱试剂STA®-FW（Cat.No.00725）:凝血因子皿试剂，生产厂家法国STAGO公司；STA®-PTTA（Cat.No.00595）:活化部分凝血活酶试剂，生产厂家法国STAGO公司。STA.-OWREN-KOLLER缓冲液（Cat.No.00360）。STA.-氯化钙0.025M（Cat.No.00367）。STA.-通用定标血浆（Cat.No.00675）。STA®-系统质控N+P（Cal.No.00678）:试剂盒中有正常和异常两个水平的质控血浆。5操作步骤手工操作步骤将20个体检正常人血浆混合，作为对照血浆。用OWREN-KOLLER缓冲液制备受检者1/2（受检者血浆1份加OWREN-KOLLER缓冲液1份）和1/3（受检者血浆1份加OWREN-KOLLER缓冲液2份）的稀释血浆。温育混合物的制备：（1）对照OWREN-KOLLER缓冲液0.2ml加对照血浆0.2ml；（2）受检者1/2稀释血浆0.2ml加对照血浆0.2ml；（3）受检者1/3稀释血浆0.2ml加对照血浆0.2ml；将上述3支混合物试管置37℃水浴箱中温育2小时。上机操作步骤申请单及标本编号审核血液标本量是否足够，有无凝血，患者信息是否齐全等，然后对标本进行编号，放入标本架。编号原则：凝血标本编号每天从1号开始进行编号，不同类型的标本录入相应组的LIS系统中，如凝血标本录入51人^下。申请单录入有申请序号的申请单录入：登录检验信息管理系统一在相应的操作仪器下扫描条码f核对申请单病人信息及所申请的项目于电脑自动调出的信息是否一致f保存。无申请序号的申请单录入：登录检验信息管理系统f在相应的操作仪器下输入患者ID号（基本信息）f核对申请单病人信息及所申请的项目于电脑自动调出的信息是否一致f保存。试剂制备和存放：*鉴于因子VIII的不稳定性，质控结果仅在4小时内有效试剂制备复溶后放置在的稳定时间STA-R上的存放时间

STA.-DeficientVIII复溶后的试剂在室温中（18-25℃）稳定4小时试剂抽屉30分钟，然后混匀。4小时试剂抽屉STA.-C.K.PREST.⑤将一瓶混匀好的试剂2（复溶水）全部倒STA.-C.K.PREST.⑤入试剂1中。复溶后的试剂在室温中（18-25℃）稳定30分钟。混匀后放入搅拌棒并盖上带孔的盖子。随后放在仪器上稳定和混合（间歇搅拌）20分钟再使48小时实际抽屉中具有搅拌功能的位置STA.-PTTA⑤加入5皿1蒸馏水。复溶后的试剂在室温中（18-25℃）稳定30分钟。混匀后盖上带孔的盖子。24小时试剂抽屉STA.-OWREN-KOLLER缓冲液每瓶15ml,即开即用3天样本抽屉STA.一氯化钙0.025M每瓶15ml,即开即用3天试剂抽屉STA.-通用定标血浆加入51蒸馏水。复溶后的试剂在室温中（18-25℃）稳定30分钟，然后混匀。4小时试剂抽屉STA.-系统质控NSTA.-系统质控P加入51蒸馏水。复溶后的试剂在室温中（18-25℃）稳定30分钟，然后混匀。8小时试剂抽屉当试剂准备完毕，在STA-R.的条码阅读器上扫描试剂瓶上的条形码。装载标本，STA-能够根据LIS上传的数据自动运行VIII项目。具体参见《STA-R凝血分析仪标准操作程序》JYK-XY-S0P-YQ-06。用测FW：C的方法，测定各种温育混合物的皿：C水平。结果计算剩余FW：C（%）=（受检者/对照）X100%按下表将剩余的因子浓度换算成Bethesda单位。剩余因子灭活因子W剩余因子灭活因子W剩余因子灭活因子W

W：C(%)Bethesda单位数W：C(%)Bethesda单位数W：C(%)Bethesda单位数970.05610.70401.35930.10590.75381.40900.15570.80371.45870.20550.85351.50840.25530.903341.55810.30510.95331.60780.35501.00321.65750.40481.05301.70730.45461.10291.75700.50451.15281.80680.55431.20271.85660.60421.25261.90640.65411.30252.00以Bethesda单位计算因子抑制物含量：受检血浆稀释度XBethesda单位二每毫升血浆中因子皿抑制物的Bethesda单位数。举例：对照温育混合的因子皿：C=52%受检血浆与正常1/2混合的因子皿：C=35%剩余因子皿：C=35/52X100%=67%从表上查得。67%剩余因子皿：C对应0.575Bethesda单位。稀释度X单位二因子皿抑制单位值：1X0.575=0.575Bethesda/ml血浆。.仪器校准程序校准频率：当方法改变，试剂厂家或试剂型号改变，仪器维修影响测定结果等情况时，必须进行校准。校准操作：设置标准曲线分析（由仪器提供商指定工程师执行）。.质量控制每批样本同时测定两个浓度水平（高值和正常值）的质控品，以2S为警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。质控规则详见《凝血检验室内质量控制标准操作程序》JYK-XY-SOP-ZK-04。.干扰因素在采血、实验技术、试剂、温度及PH值上很小的变化都会导致试验结果明显的变化，是凝血酶原时间测定时应严格控制的参数。血浆绝不能在37℃下放置10min。实验前应检查血浆是否有溶血、黄疸、脂血或出现凝块。在红细胞比容＜20%或＞55%时，抗凝剂与血液的比例须按公式：抗凝剂（mL）=（100%-HCT）*血液（mL）X0.00185。止血带的压力要小，时间要短。采血要一针见血，拉柱速度要慢且均匀，不能在淤血部位采血，不要从输液三通管取血，不要拍打前臂，避免产生凝血、溶血、气泡和组织液污染。采血立即与抗凝剂混合（颠倒混匀10次，避免用力振摇），尽快送往实验室。.实验室解释测定凝血因子皿的抑制物多用于血友病甲患者出现抗因子皿抗体者，也用于获得性血友病A病，对其他原因所致抗因子皿抗体者不慎敏感。也可用本法测定其他凝血因子所产生的抗体。血循环中偶见存在抗因子xn、xi、ix、皿、v、n的抗体，在上述因子缺乏者应用血或血液制品替代治疗的患者，也偶见于免疫性疾病，如系统性红斑狼疮、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症等。当筛查试验如复钙交叉试验、APTT纠正试验出现阳性结果时，患者有血友病A病史或因子皿活性下降，用凝血因子皿抑制物测定（Bethesda法）可以定量反应抑制物的水平，用于血友病A患者产生因子皿抑制物或获得性血友病A的诊断与疗效检测。该方法是一种经典方法。.异常结果处理当发现异常的初步结果或检验结果与患者临床资料、历史结果不符时，应及时与临床医生或护士联系，报告复查情况，允许的情况下要求重新采集标本，并了解病人最新状况和询问治疗情况。所有的复核应做好记录。采用双签双核对政策，报告单发放前需双人核对（双签双核对为操作者、组长或组长委派人员）。.结果计算原理及不确定度凝血因子VIII活性测量不确定度来源包括样本、标本采集过程、送检时间、保存条件、药物、检测系统、员工素质等因素。参见《测量不确定度操作程序》。.生物参考区间正常参考值：正常人体内无抑制物，剩余因子皿：C为100%；血浆中有抑制物者，剩余因子浓度小于100%。.操作注意事项：干粉试剂及质控血浆溶解确认溶剂类型，一般溶解液包括：蒸馏水、生理盐水、缓冲液、厂家特定溶解液，必须按说明书要求使用。溶解时，轻轻转动容器，保证干粉完全溶解，避免剧烈振荡。复溶后，室温放置5-10分钟方可使用。.变异的潜在来源抗凝剂：草酸盐、EDTA、肝素不能用于VIII测定项目，抗凝比例不当也将影响结果的准确性。样本采集处理不当，如血与抗凝剂未充分混匀，出现小凝块；混匀时过分用力，使红细胞破坏出现溶血，均会造成结果变异。纤溶药物的影响：如双香豆素、链激酶、尿酶等妊娠与急性炎症的影响.环境与安全实验室及工作人员一般安全防护措施见《实验室安全管理程序》。血液标本溢出后，由工作人员立即用0.2%过氧乙酸溶液或75%酒精溶液对污染环境进行消毒。如操作人员的皮肤或衣物上沾到了血液及废液。应立即用0.2%过氧乙酸溶液或75%酒精溶液消毒处理，再用肥皂水、清水进行冲洗。如果眼睛中溅入血液及废液，用大量清水冲洗并采取必要的医疗措施。在仪器转动过程中，勿触及样品针、移动的传输装置等，避免造成人身伤害。禁止触摸血液细胞分析仪密封面板内的电路。如血液标