血液病检测技术讲稿

绪一、临血液学检验的概述定义床血液学检验是采用各实验室检查方法和技术来分析和研究血液和造血器官的病理变化，从而阐明血液系统疾病的发病机制，协助诊断、治疗观察和预后判断的一门科学。发展：近血液学形态血液学免疫血液学分子病随着医学科学技术的发展和各学科的相互渗透，当代的临床血液学检验已发生根本性变化。在检验科室内，它已经是一个业务内容广泛、拥有大量自动化精密仪器、由许多具备血液学基础及床知识和娴熟技术的人员组成的临床专业科室务内容已扩展到包括血细胞计数与形态学分析红细胞病理相关分析、白细胞病理相关分析以及血栓与止血相关分析等方面。血胞数形学由于实验室检测的自动化，以往的所谓“血常规”正被检测参数更多的全血细胞计数（CBC）取代。最新一代的血分析仪，除了通常项目和白细胞分类计数以外，还可直接计数网织红细胞，包括网织红细胞血红蛋白含量）表示网织红细胞成熟程度的多项指标；直接检测有核红细胞数，并可从白细胞总数中自动扣除有核红细胞，以及准确计数血小板总数和计数型。因为现代血液分析仪作为常规检测的红细胞分布宽度Price-Jones曲反映红细胞大小分布更为精确和直观。如果将、、MCHCRDW等5项，合网织红细胞的多项数综合分析，必要时再辅以血片红细胞形态学观察，有经验的血液病医师，基本上能较准确地进各种贫血分类和鉴别诊断。此外，这类仪器在白细胞分类检测百分比时，也报告绝对数。各种白胞所占百分比是一个相对数，其局限性显而易见。当前不少血液学专家提倡今后只检测各种白细的绝对数，因为那才是反映血液中某一细胞真实含量的科学指标。红胞理关析除了上述由血液分析仪给出的各项红细胞指标外，显微镜下的红细胞形态学观测也十分重要，但是现今一般血液检验者对此往往不够重视Williams血学第6版经细胞形态分为12类17种并介绍了每种形态与病的关联见这方面有多么丰富的内容其他与红细胞疾病相的检验还有：与遗传有关的溶血性贫血和高铁血红蛋白血症患者红细胞内各种酶的测定、异常血蛋白分析和红细胞膜骨架蛋白等的检测。以往分析这些蛋白质，多采用繁琐的生物化学法，耗时费钱、技术要求高；虽然有一部分后来有了专用的商品试剂，但也难以推广。由于这些蛋白质的1因序列绝大部分已查明，目前生化方法正逐步被已相当成熟的分子生物学方法（如PCR、酸分子杂交，基因或蛋白质芯片技术等）所取代。白胞理关析

当前，用自动化血液分析仪进行白细胞分类，虽然已经取得长足进步，但尚未达到完全取代手工镜下分类的程度。它还不能准确辨认各类幼稚细胞、原细胞以及诸如中性粒细胞的“毒性”变化和“不典型淋巴细胞”等，必要时还必须在显微镜下进识别。事实上，外周血白细胞的构成十分复杂，单用一般染色和镜检也不可能达到准确分类。例如来似乎比较单一的外周血淋巴细胞上由胞细胞自然杀）细胞所构成，其中T细还可再成许多亚群。这些细胞在显微镜下是无法区分的，必须用特异的抗淋巴细胞分化抗原群（CD）单隆抗体，建立免疫方法（如流式细胞术）进行免疫表型检测。粒细胞、单核细胞甚至血小板等也是如此，这些分化抗原目前也采C编号对临床有重要意义，小接近白细胞的巨大血小板和大小类似血小板的白细胞碎片和红细胞碎片，在血液分析仪和肉眼下往往也不易与血小板区分，只能用免疫学方法加以鉴别。血与血关析血栓与止血相关的检验，是近年来临床血液学发展最快的领域。近年，由于在凝血、抗凝和纤维蛋白溶解机制及其相互关系方面进行了一系列基础性研究，在止血与血栓形成理和实践上取得了重大突破。许多新的凝血、抗凝、纤溶因子抑制物的发现及检测方法的建立、自化仪器的普及和试剂的商品化开发，带动了血栓与止血检验技术的发展，成为临床血液学检验的亮点。目前，这一类检验的工作量很大，在发达国家估计已占血液学检验的1/3。华医学会检验学分会与中华医学会血液分会血栓与止血专业委员会在1997年台会议上联合提出了与国接轨的、APTT和纤蛋白原定标准化方案的建议；同时建议淘汰玻片法凝血时间和Duke出时间（需要时可用模板式出血时间法测定目前，我国一般中等以上医院，大都开展“内源”、“外源”和“共同”途径凝血因子的过筛试验（如PT、APTT、等和常用凝血因子测定。在抗凝因子方面抗凝血酶Ⅲ，蛋白C蛋白S测也日益普及。在纤维白（原）降解产物FDP二体测定已相当普及。在止血功能方面血小板计数、出血时间测定方法的改进和规范化、血小板活化标志物和vWF等检测，为临床出血性疾病和血栓病（如心、脑血管栓塞等）的诊断、判断患者是否处于高凝状态和抗凝治疗监控等，提供了许多新的检测指标。与其他临床检验一样，分子生物学方法在血栓与止血检验，别是遗传性出、凝血异常和血栓检验工作者，近年来在这方面已经取得不少重大成果，有的已达国际先进水平。血胞析的展血细胞分析仪的发展已有50年史了内医院应用血细胞分析仪的情况也越来越普及年2来由于综合性高科技的飞速发展，血细胞分析仪上也不断采用了最新的电子、光学、化学和计算技术，从而不断满足临床工作对血液细胞分析的要求。提供更加方便适用、更多功能和参数、更准确、更快速度的血细胞分析仪，已经是各血细胞分析仪生产厂商的目标。二、临血液学检验和临床的系血液系统的疾病常具有非血液系统表现的临床特征。许多非血液疾病也可以出现血液系统的变化。非血液系统疾病可以同时合并存在血液系统疾病。三、学临床血液学检验的方和要求基础理论与检验实践相结合。临床血液学检验的学习，要做到检验和临床相结合。临床血液学检验是一门实践性很强的应用学科，要求检验人员积极认真、一丝不苟、严谨有序、勤学苦练，在长期的实践中不断积累经验，不断提高有关的基础、临床和检验的知识。3第一节造血器官和造血微环境一、造器官造血器官指生成血细胞的器官，包括骨髓、胸腺、淋巴结、肝脏以及脾脏。其中骨髓、胸腺、淋结及脾脏又称淋巴器官。人体处于不同的时期，其造血器官有所不同l一2个的胎儿，其造血细胞来源于卵黄囊，故卵黄囊为其造血器官。2—5个的胎儿，肝脏、脾脏、淋巴结开始造血，产生红细胞、白细胞、血小板，取代了卵黄囊的造血作用。胎儿从第月开始出现骨髓造血，胎儿后期出现胸腺造血。婴儿出生后主要是骨髓造血，它能制造红细胞、白细胞、血小板等各种血细胞；脾脏、淋巴结及巴组织也造血，但只产生少量的单核细胞、淋巴细胞。成人的造血器官就是骨髓。骨髓是一种海样胶的脂肪性组织封闭在硬的骨髓腔内骨分红髓造血细胞和髓脂细胞两部分。骨髓造血在开始时分布在全身骨路，以后逐渐局限于颅骨、肋骨、胸骨、脊柱、髂骨以及肱骨和骨的一部分，其他部位逐渐由黄髓所替代。黄髓不能造血。血细胞生成于造血器官，在胚胎期及出生后的不同发育时期，其主要的造血器官并不相同。（一）胚胎期的造血器官中胚叶造血期：发生于胚胎的1—月。卵黄囊是最先出现的造血地点。卵黄囊壁上的中胚层间质细胞是造血系统的始基，最初血细胞产生于卵黄囊的血岛，血岛外周的细胞分化发育成始血细胞，原始血细胞进一步分化为胞浆内具有血红蛋白的初级原始红细胞，即胚胎的血细胞。肝脏造血期：发生于胚胎的2—个月卵黄囊萎缩退化，由肝脏取代其造血功能。它不但能分化初级的原始红细胞，而且能分化为次级原始红细胞，这些细胞逐渐发育成熟为红细胞，经窦进入血液。此时，肝脏的造血活动甚为活跃。脾脏在胎儿第个左右，亦参与造血，主要生成红细胞、粒细胞、淋巴细胞及单核细胞。至第月，脾脏造血机能逐渐减退，仅制造淋巴细胞及单核细胞，而这一造血活动则维持终生。骨髓造血期：此期始于胚胎的第4个。胎儿开始出现骨髓造血组织，最初仅制造粒细胞，继之还制造红细胞和巨核细胞。在骨髓造血的同时，胸腺及淋巴结亦开始造血活动。胸腺生成淋细胞，至出生后仍保持此功能；淋巴结则主要生成淋巴细胞及浆细胞，早期也参与制造红细胞。以上3个段，彼此相互交错，际上很难截然分开。（二）是出生后的造血器官4(1)骨髓骨是人体出生后唯生成红细胞细胞和巨核细胞的造血器官时也生成淋巴细胞和单核细胞。从新生儿到4岁的儿，全身骨髓具有活跃的造血功能5—岁，在管状骨造血细胞之间开始出现脂肪细胞。随着年龄的增长，管状骨中红髓的范围逐渐减少，脂肪组织逐增多骨髓变黄色为骨髓髓中虽已不再造血仍留有潜在的造血功能约在18—岁左右，红髓仅局限于颅骨、胸骨、脊椎、髂骨等扁平骨以及肱骨与股骨的近端。红髓约占骨髓量的一半。以后红髓的造血活动持续终身，但其活跃程度可随年龄的增长而稍有减少。肉眼观察骨髓是一种海绵状胶或脂肪性的组织封闭在坚硬的骨髓腔内分红髓(造血细胞和髓脂细)两部分正常成人骨髓重量为1600克—3700克约合体重的3.4%—5.9%其中红髓的重量约克骨髓有复杂和丰富的血管系统。人的骨髓中主要靠营养动脉供应整个骨髓腔的毛细血管。骨髓的全部动脉都有神经束伴行，神经纤维来源于脊神经，和动脉共同自营养孔进入骨髓腔，与营养脉平行分布于骨髓腔并终止于脉壁的平滑肌纤维髓的血窦之间充满实质细胞即造血细，骨髓造血多能干细胞向红系、粒系及巨核系的分化和造血微环境有关，造血微环境应可能由血管巨噬细胞、神经及基质等组成。若从其功能考虑，造血微环境应包括影响造血作用的全部因素，中血管因素是很重要的，因为各种造血物质及其刺激物质都要通过血管进入骨髓，才能造血。造部位和血液循环之间存在屏障，即骨髓血液屏障，它具有控制血细胞进出骨髓的作用。(2)胸腺：出生后至老年，胸腺经历了一定的变化。到青春期后造血活动逐渐消失，为脂肪组织所代替。胸腺不但是胚胎时期的重要造血器官之一，而且出生后仍具有活跃的造血功能，特别在出生后两年内腺组织的生长较为迅速造血活动也很旺盛腺被结缔组织分隔成许多不完全的小叶小叶的周围部分称皮质中央部称髓质皮充满密集的淋巴细胞最浅层为较原始的淋巴细胞，中层为中等大小的淋巴细胞，深层为小淋巴细胞，从浅层到深层呈干细胞增殖分化成为胸腺依赖巴细胞T细胞)的过程。成年胸腺虽然萎缩，但由于T细已在周围淋巴组织中定居，自己能够繁殖。胸腺除向周围淋巴组织输送T淋细胞外，还由上皮性网状分泌胸腺素，干细胞在胸腺激素的作用下，被诱导分化成熟为免疫活性巴细胞。脾脏脾是人体最大的淋巴器实质分为红髓和白髓两部分白髓包括中央动脉周围淋巴鞘与脾小结。在中央动脉周围的是脾脏的胸腺依赖区，区内主要是T淋细胞。而脾小结即脾内的淋巴小结，小结内有生发中心，主要是B淋巴细胞。脾脏除能产生淋巴细胞及单核细胞以外尚具有贮血和破坏衰老红细胞的功能。阑尾及回肠的淋巴集结髓的干细胞在此集结诱增殖的干细胞分化为骨髓依赖淋巴细胞(B细胞，播散于周围淋巴器官中。淋巴结为围部分的皮质和央部分的髓质质层淋巴滤泡的中央为细胞殖的5场所，称为生发中心或反应中心；皮质深层主要是由胸腺迁来的T细胞成，称胸腺依赖区；在抗原的刺激下，淋巴胞可以增殖，产生大量致敏的小淋巴细胞，经血流直接作用于抗原。髓质要由髓索淋巴索和巴窦构成。髓索的主要成分是B淋巴细胞、浆细胞及巨噬细胞等。以上((3)(5)部属巴器官造血巴器官为中枢淋巴器官和周围淋巴器官。胸腺及骨髓中的淋巴组织属中枢淋巴器官，为淋巴系定向干细胞聚焦的场所；淋巴结、脾脏及其淋巴组织为周围淋巴器官，是分化了的T细胞细胞在的场所。(6)网状内皮系统RES)：包括脾和淋巴结的网状细胞，覆盖在肝脏、骨髓、肾上腺皮质、脑垂体前叶的窦状隙上的内皮细胞以及其它器官内的游离组织细胞。其主要细胞成分为网状细胞，状细胞能分化为吞噬性网状细胞。血中单核细胞，自髓生成后进入网状组织，则为组织细胞；在定条件下，可转化为具吞噬功能的游离吞噬细胞，形成所谓的单核一巨噬细胞系统。在正常情况下出2个月后的儿绝不会有骨髓外造血病理状态下骨以外的组织官如脾、肝、淋巴结等都可出现造血灶，此即髓外造血，这是由于这些部位保留具有造血能力的间细胞，恢复其胚胎时期的造血功能。二、造微环境骨髓微血管系统骨髓神经基质细胞及其分泌的调控因子第节造细的长育造调一、造细胞的生长发育造血细胞的生长发育包括增殖、分化、成熟和释放。过程见图：1-2P9二、造血干细胞造干胞源于人胚（受精后第2周）的卵黄囊血岛；当胚体立循环后，造血干细胞经血流迁入胚肝第3～6月胎儿肝主要的造血器官造血干细胞较多近应用分离的胎肝造血胞治疗再生障碍性贫血等血液病患者。出生后，造血干细胞主要存在于红骨髓，约占骨髓有核细的0.5％其次是脾和淋巴结，周血中也有极少量。关于造血干细胞的形态结构，至今尚无定论，多数学者认为类似小淋巴细胞，直径7～m，胞质内除大量游离核糖体和少量线粒体外，无其他细胞器。造血干细胞的基本特性是：①有很强潜能，在一定条件下能反复分裂，大量增殖；但在一般生理状态下多细胞处于G0期止状态②有多向分化能力在一些因素的作用下能分化形成不同的祖细胞。③有自我复制能力，即细胞分裂后的子代细胞仍具原有特征，故造血干细胞可终身保恒定的数量。6造血祖细胞由血干细胞分化为几种不同的造血祖细胞进而再分别分化为形态可辨认的各幼稚血细胞。造血祖细胞的增殖能力有限，它们依靠造血干细胞的增殖来补充。造血祖细胞可用外培养的细胞集落法测定。在不同的集落刺激因子CSF作用下，可分别出现不同的血细胞集落目前已确认的造血祖细胞有：①红细胞系造血祖细胞，必需在红细胞生成素，肾等产生）用下才能形成红细胞集落，又称红细胞集落生成单位CFU-E中性粒细胞－巨噬细胞系造血细胞，需在粒细胞生成素作用下形成该种细胞的集落，又称粒细胞巨噬细胞系集落生成单位（CFU-GM核胞系造血祖细胞在血小板生成素作用下形成巨核细胞集落又称巨核细系集落生成单位CFU-M在胞的造血祖细胞的存在，目前尚无确切实验结果。三、造血调控（一）集落刺激因子骨髓造血干细胞体外半固体培养技术的建立和重组集落刺激因CSF的问世给集落刺激因子的研究提供了前提。根据细胞因子刺激不同造血细胞系或不同分化阶段的细胞在半固体培养基中成不同细胞集落，分别命名为粒细胞CSF（G-CSF噬细胞（M-CSF细和巨噬细胞CSF（GM-CSF集刺激因子又IL-3细因子细胞生成（有人将IL-5称为嗜酸性粒细胞集落刺激因子Eo-CSF外IL-1IL-6和IL-11在骨髓多能细胞早期的分化中也有重要的作用。（二）白细胞介素的生主由活化T细或T细克隆产生小髓样单核细系WEHI-3B细胞可自发产生一定水平的IL-3。外，胸腺上皮细胞、活化小鼠肥大细胞等也可表达IL-3。IL-3的子结构和基因1984年美国和澳大利亚分别从ConA刺激小鼠T细胞和WEHI-3B细胞中提取高活性部分mRNA，逆录成，进行克隆化和序分析。编码小鼠IL-3和GM-CSF的基因都定位于第11号染色体IL-3的基因组由5外显子和4个含子组成。编166氨基酸残基，端26氨酸残基为信号肽，此外N端另有数个氨基酸残基可能被血清蛋白酶所切除成熟小鼠IL-3由131氨酸残基组成，含有糖基，分子量为25～28kDa（三）其他细胞因子粒系红系祖细胞体外培养【参考值】粒系祖细胞体外琼脂培养：正常骨髓：细胞丛与集落数之比为5：1CFU-C约5070/105有细胞。正常外周血中浓约为骨髓的1/10。7555555红系祖细胞体外血浆凝块培养：正常骨髓：CFU-E为66/10有细胞BFU-E为13/10有核细胞正常外周血BFU-E为2～有核细集落的产率影响因素很多，各实验室报告均不一致，所以各实验室应建立自己的参考值。【临床意义】一般认为造血干细胞是一类特殊组织中的原始细胞，依靠这类细胞的增殖分化，而不是依靠机体的其它组织所提供的细胞来维持这类组织的功能和恒定的细胞群或恒定的细胞数量1961年现脾结节生成的实验技术后，造血干细胞的研究得到了进一步发展1965年后相继地出现了骨髓细胞体外琼脂培养等技术，为深入研究和认识造血干细胞的增殖和分化特性，以及造血干细胞中多向性造血干细胞与各类定向祖细胞之间的相互关系提供了重要的研究手段。目前用于造血干细胞的研究方法主要有：脾结节测定法、体外琼脂培养法、体内扩散盒琼脂培养法，扩散盒造血干细胞测定法、促红细胞生成素）反应细胞测定法，体外血浆凝块培养等。骨髓在体外琼脂培养中，当在培养体系中加入一定量的细胞团生成刺激因子或称集落刺激因子（ColonyfactorCSF）后，一般过7天养后，可以生成由粒细胞、单核—巨噬细胞或两者混合组成的细胞团，在琼脂培养中每生成的一个细胞团称为一个细胞团生成单位（

Colony琼培养中个上细胞聚集在一起称为集个胞聚集在一起称为丛（在醋酸地依红染色中，在低倍镜下见到集落有三种类型：致密型Colse）:主由不同发育阶段的粒细胞系统的细胞组成。混合型（胞团的中央为密集的粒细胞，周围环境疏散分布的单核巨噬细胞。疏散型type要单核—噬细胞组成。自从骨髓细胞在CSF作下可以在体外琼脂培养体系中生成由粒细胞和单核—巨噬细胞组成细胞集落后年现造血细胞在体外血浆凝块培养中养体系中加入适量促红细胞生成EP）的条件下，经过短期培养后生成了由红系细胞组成的细胞团或称集落，为了区别于粒细胞组成的胞团（CFU-C或CFU-C）将红系细胞组成的细胞团称为CFU-E造血干细胞与临床血液疾患的关系极为密切，已有许多资料证明，大多数再生障碍性贫血是由于血干细胞数量的减少或质量异常所致，少数可能由于造血环境或免疫异常引起。白血病则认为是细胞的癌变，导致其分化与增殖失去平衡，增殖减慢，成熟受阻。急粒细胞性白血病患者，体研究发现CFU-C增异常，特点是集落生成少或无，但有大量细胞丛生成，集落和丛由原始、幼稚和成熟缺陷的粒细胞组成。还有大量的残存的单个原始细胞散在琼脂中，在白血病治疗前呈“非血病型生长（集落生成减低或不生长呈非白血病型生长（有小丛和大丛或残存原始细胞相比前的完全缓解率比后者高诱导缓解期琼脂培养出现正常集落者予示将会得到缓解8因此CFU-C体琼脂培养对估计急性粒细胞白血病的预后和指治疗具有一定意义。在对M研究中发多数造血组织增生征者的血清和尿中水增高如果出“血病型生长落，多数患者会在10个内发生白血病阵发性睡眠性血红蛋白症性细胞增多症等也是造血干细胞异常的疾病，因此深入研究造血干细胞的生长特性及增殖分化的调节和控制已成为当前血液学究中一个活跃领域。测定正常及各种血液疾患的骨髓和外周血中CFU-CCFU-E等的变化可为血液疾患的治疗预后提供有用帮助，对于预测骨髓移植后的恢复状况，评价化疗药物对正常胞的影响以及深入认识发病原理等都有一定的价值。9第一节血胞形态演变的一规律血细胞的发生是一连续发展过程种血细胞的发育大致可分为三个阶段始阶段稚（分早、中、晚三期）和成熟阶段。骨髓涂片检查，是血液病诊断的重要依据。血细胞发生过程中形态变化的一般规律如下：①胞体由大变小，而巨核细胞的发生则由小变大。胞核由大变小，红细胞的核最后消失，粒细胞的核由圆形逐渐变成杆状乃至分叶，巨核细胞的核小变大呈分叶状；核内染色质由细疏逐渐变粗密，核仁由明显渐至消失；核的着色由浅变深。③质的量由少逐渐增多，胞质嗜碱性逐渐变弱，但单核细胞和淋巴细胞仍保持嗜碱性；胞质内的特结构如红细胞中的血红蛋白、粒细胞中的特殊颗粒均由无到有，并逐渐增多。④细胞分裂能力从到无，但淋巴细胞仍有很强的潜在分裂能力。．红细胞发生红细胞发生历经原红细细称碱性成红细中幼红细胞（或称多染性成红细胞polychromatophilicerythroblast幼红细胞（或称正成红细胞,者去胞核成为织红细胞，最终成为成熟红细胞。从原红细胞的发育至晚幼红细胞大约需～4天噬细胞可吞噬晚幼红细胞脱出的胞核和其代谢产物为红细胞的发育提供铁质等营养物。红细胞发生过程的形态演变发育阶段和名称

胞体大小形状

胞核形状染色核仁质比

胞质嗜碱性着色红蛋白分能（m原始阶段原红细胞

～22圆

圆细状2>／圆粗粒状偶见>1

强墨蓝无有很强墨水蓝开始出现有幼早幼红细胞稚中红细胞阶晚红细胞

～19圆～14

圆粗状消约／圆致块消更小

减弱嗜多性增多红蓝间染弱红大量

无

弱段

圆

无成熟网红细胞阶红胞

～12圆7～9圆盘状

无

微量无

红红

无

大大段

7圆

量

无状10．粒细胞发生粒细发生历经原粒细胞myeloblast幼粒细（又称前髓细胞，粒细又称髓细胞粒细（又称后髓细胞metamyelocyte进而分化为成熟的杆状核和分叶核粒细胞原粒细胞增殖分化为晚幼粒细胞大约需4天骨髓内的杆核粒细胞和分叶核粒细胞的贮存量很大，在骨髓停留～5后释放入血。若骨髓加速释放，外周血中的粒细胞可骤然增多。各阶段细胞的一般形态特点见表5。．单核细胞发生单细胞的发生经过原单核细胞）幼单核细胞(变为单核细胞。幼单核细胞增殖力很强，约3％的幼单核细胞处于增殖状态，单核细胞在骨髓中的贮存量不及粒细胞多，当机体出现炎症或免疫功能活跃时，幼单核细胞加速分裂增殖，以提供足量单核细胞。．血小板发生原巨细胞（）经幼巨核细胞（promegakaryocyte）育为巨核细胞，巨核细胞的胞质块脱落成为血小板。原巨核细胞分化为幼巨核细胞，体积变大，胞核常呈形，胞质内出现细小颗粒。幼巨核细胞的核经数次分裂，但胞体不分裂，形成巨核细胞。巨核细呈不规则形，直径～μm甚至更大，细胞核分叶状。胞质内有许多血小板颗粒，还有许多由滑面内质网形成的网状小管将质分隔成许多小区每小区即是一个未来的血小板内含颗粒并可见到巨核细胞伸出细长的胞质突起沿着血窦壁伸入窦腔内，其胞质未端膨大脱落即成血小板每个巨核细胞可生成约2000个小板。粒细胞发生过程的形态演变发育阶段和名称

胞体大小形状

胞核形状染色核仁核比例

胞质嗜碱性着色嗜天青特殊分颗粒颗能力（m原始阶段原细胞

11－18圆－20圆

圆细状2／卵圆粗网偶见／

强天无无有减弱淡蓝大少量有幼早粒细胞

－16圆

半圆网块消失约／

弱

浅蓝少增有稚中粒细胞阶晚粒细胞段成

－15圆－15圆－15圆

肾形网块消失／带状粗块消失／分叶粗块消失更

极弱浅少明无消失淡红少大量无消失淡红少大量无熟杆核粒细胞阶分核粒细胞段．淋巴细胞发生巴细胞的发生较复杂。淋巴细胞有多种亚群，它们既有发生育过，又可因抗原刺激出现小淋巴细胞母细胞化和单株增殖过程，而且还缺乏常规光镜下可见的分化标志，很难从形态上严格划分淋巴细胞的发生和分化阶段。以往的光镜形态观察，将淋巴细胞的发生传地分为原淋巴细胞、幼淋巴细胞和淋巴细胞三个阶段，与近年免疫学研究结果尚无明确的关联11第二节各血细胞的形态特一、粒胞系原粒细胞早幼粒细胞中幼粒细胞（酸、嗜碱）晚粒细胞（酸、嗜碱）杆核粒细胞（嗜酸、嗜碱）分核粒细胞（嗜酸、嗜碱）二、红细胞系原红细胞早幼红细胞中幼红细胞晚幼红细胞网织红细胞红细胞三、巨细胞系原巨核细胞幼稚巨核细胞颗粒型巨核细胞产板型巨核细胞裸核型巨核细胞血小板四、淋细胞系原淋巴细胞幼淋巴细胞淋巴细胞（大、小）五、单细胞系原单核细胞幼单核细胞单核细胞巨噬细胞六、浆胞系原浆细胞幼浆细胞浆细胞七、其细胞网状细胞组织嗜碱细胞内皮细胞纤维细胞成骨细胞12

破骨细胞脂肪细胞退化细胞分裂型细胞骨第一节概一、适应症和禁忌症确诊某些造血系统疾病协助诊断部分血液系统疾病提高某些疾病的诊断率二、标本的采集骨髓取材的部位和方法标本采集的质量控制干抽三、骨髓涂片、染色及其质量保证第二节骨髓象检查的方法一、检查的步骤（一）骨髓涂片检查1.低镜检查(1)判断标本是否满意满的骨髓涂片应薄厚适宜，细胞分布均匀、有核细胞着色清晰。(2)判断骨髓增生程度通借助骨髓涂片中成熟红细胞与有核细胞之比来判断骨髓增生情况，并将其分为五级，见下表。骨髓增生程度的分级骨髓增生程度

成熟红细胞与有核细胞之比

常见原因增生极度活跃1:1增生明显活跃10:1增生活跃20:1增生减低50:1增生严重减低300:1

白血病、红白血病等白血病、增生性贫血正常骨髓或某些贫血造血功能低下典型的再生障碍性贫血(3)估计巨核细胞系增生情况于倍镜下逐一视野浏览计数全部片膜内的巨核细胞数。(4)注意涂片上、下两缘及片尾有无体积较大或成堆出现的特殊细胞，如Gaucher细胞细及转移癌细胞等。132.油浸镜检查选有细胞丰富、分布均匀处，油镜下分类计数至少200个有核细胞，同时注意有无质的变化。计算粒系细胞总百分率及各阶段细胞所占百分率，并描述其细胞形态。计算红系细胞总百分率及各阶段细胞所占百分率，并描述其细胞形态。计算粒、红比值粒细胞系各阶段细胞总和与红系各阶段细胞总和之比。分别计算淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等的百分率。写出全片所见巨核细胞数。有无寄生虫及特殊细胞。描述成熟红细胞形态学。(二血涂片观察低倍镜观察涂血染色是否满意。油镜下分类计数至少100个白胞，分别报告各类白细胞所占百分率，描述其形态染色情况及注意有无幼稚细胞出现。如外周血涂片出现幼红细胞则按分类个白细胞过程中见到多少个来报告明其属于何阶段。描述成熟红细胞大小、形态、染色情况。估计血小板数量并描述其形态大小和分布情.注意有无寄生虫。二、报告单的书写及资料存档根据检验结果，按要求逐项详细填写并加以描述，综合骨髓象、血象所见结合临床资料提出具体意见供临床参考。作出肯定性诊断如骨髓、血象细胞学特征和临床表现均典型即可作出肯定性诊.如各型白血病、巨幼细胞性贫血、多发性骨髓瘤、恶性组织细胞病、骨髓转移瘤等。作出支持性诊断如骨髓、血象改变可以解释临床表现时即可提出支持性意.如支持缺铁性贫血、再生障碍性贫血、粒细胞缺乏症等诊断。作出排除性诊断如骨髓、血象所见与临床诊断不符时可提出否定性意见以排除某些诊断。4.骨髓、血象确有某些改变，但临床表现提不出支持或否定性意见时，可描述其特点、并尽可能地提出进一步检查的建议供临床参考，必要时迫踪观察。骨髓、血象告单一式份，其中份发给临床，另一份随同骨髓检查请单及检标本一并档妥善保存以复查、总、研究及学使用。第三节正骨髓象14由于正常骨髓内各细胞系及其各阶段百分率范围较大，因此凡分类符合下列情况者均可视为正常骨髓象。骨髓增生活跃。粒细胞系约占有核细胞的40%～60%，中原粒细<2%，早幼粒细胞、、晚幼粒细胞各15%，状核粒细胞多于分叶细胞，嗜酸粒细胞一<5%，嗜碱粒细胞<，胞大小、形态、染色基本正常。幼红细胞总百分率约占有核细胞的20%右，其中原红细<1%，早幼红细胞<5%，中、晚助红细胞约各占10%，细胞形态、色基本正常。粒、红比值正常为2～4:1。淋巴细胞百分率约为小可达40%)，均为成熟淋巴细胞。单核细胞一般<4%，浆细胞<3%，为成熟阶段者。巨核细胞系通常于1.5×3cm2骨片膜上可见巨核细胞735，多为成熟型。可见少量网状细胞、内皮细胞、组织嗜碱细胞等。虽然它们各占百分率很低，但却均为骨髓成分的标志核分裂细胞不易见到，仅约为1‰成熟红细胞大小、形态、染色大致正常。第四节骨髓活检骨活检的临床意义正确判断血细胞减少患者骨髓增生程度及其病因。判断骨髓的铁储存，尤其是怀疑储存铁降低或缺铁时，骨髓活检比骨髓涂片更有诊断价值。⑶对于某些疾病（如再生障碍性贫血、缺铁性贫血及骨髓增生异常综合征）及化疗后骨髓抑制程有明确诊断意义。可以发现骨髓穿刺涂片检查不易发现的病理性变化（如骨髓纤维化、骨髓坏死、胶样变性及肉肿等相疾病的诊断和造微环境及骨髓移植的研究有重要意义。对各种急、慢性白血病和骨髓增生异常综合征有确诊和化疗效果及判定预后的意义。对骨髓转癌、恶性组织细胞病、戈谢病和尼-皮克病等诊断的阳性率比涂片得多。可诊断慢性骨髓增生性疾病，如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、骨髓纤维化等。⑺为明确“干抽”的原因，探讨竟是真正的骨髓增生低下、骨髓纤维组织增生，还是髓腔因细胞增生极度活跃而致干抽引起，须作骨髓活检明确诊断。．骨髓活检适应征⑴多次骨髓穿刺取材失败。反复多部位骨髓穿刺干抽”，怀疑骨髓纤维化、髓转移癌、多发性骨髓瘤、多毛细胞白血病、某些急、慢性白血病及骨髓硬化症等的患者。15血象显示全血细胞减少，反复骨髓穿刺均血液稀”，或骨髓增生低下、病态造血，怀疑再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征及低增生性白血病的患者。某些贫血、原因不明的发热、脾或淋巴结肿大，骨髓涂片检查不能确诊者。凡需进行骨髓抽取物涂片检查的所有血液病、某些内科病、恶性肿瘤以及骨病患者。除血友病外，骨髓活检目前尚无绝对的禁忌症。即使在血小板减少症和其他许多出血性疾病中，行此项操作也比较安全，一般没有明显出血。只要操作中注意严格消毒与适当的局部麻醉，必要给予镇静与止痛剂，患者均能接受此项操作。．方法简介及质量保证方法：骨髓活检部位常选择髂后上棘和髂前上棘，病人的体位、局部消毒、穿刺技术基本与骨穿刺术相似。所不同之处骨髓活检选用活检穿刺针，以一定的方向旋转入骨皮质，活检针固定后拔出连手柄针芯，套入长（或短）接柱，将针芯插入针座和针套管内，再以一定的方向旋转推进定深度（约一方向转动几周，一定方向旋转退针。将针管内的骨髓组织块（约入米粒大小针推出，放入装有甲醛液或95%酒精小瓶内，备切片用。质量保证同骨髓穿刺注意事项。开始进针不易太深，否则难以取出骨髓组织。穿刺活检时，一般不易吸取骨髓液涂片，因活检针管径较大）,易发生血液稀释。第五节血胞检验的临床应用评价结果的可靠性实验方法的评价16实准一器：载玻片盖玻片：滴管：4橡皮吸头：4个玻璃棒：4根烧杯：ml，量筒：、、ml各蜡笔棕色小口瓶碾钵载玻片处理一将载玻片先用洗衣粉水溶液煮沸20分用流水冲洗再清洁液浸泡过夜，用流水反复冲洗，最后入5%酒精浸泡约1小。取出，以净布巾夹持玻片边缘擦干备用。二试：瑞氏染液240ml瑞氏染料粉剂0.1g纯甲醇（AR）将粉剂放入洁净干燥碾钵内，先加少量甲醇研磨使染料溶解后已溶解的染料倒入洁净的棕色玻璃瓶内，剩下未溶解的再加入少量甲醇研磨，如此反复，直至染料完全溶解为止。新配制的染液需密封保存，室温放置1周才能使用。染料存放越久，染色效果越好。磷酸盐缓冲液1%KH24HPO24

30ml20ml加蒸馏水至800ml，调值6.5~7.0，容至。甲醇二甲苯实步一涂（）液片制（1需载玻片，分别称为玻片和玻片2推片17用玻片1一接3mm直径的滴，将此玻片保水平。取另一边缘平整的载玻片（推片其端放在滴前，与片保30角并稍向后移与血滴接触，即见血液沿片2推片）下缘散开，使血液展开并充满整个推片的宽度。立刻将推片与载玻片呈°角，边轻压推片边将血液按下图的箭头方向推动涂抹，至血液铺完血膜为止。挥动片1使膜干，用蜡笔将血膜边缘圈画备染色。每只动物涂片一张。一张良好的血片，要求厚薄适宜，头、体、尾分明。置～1hr较利于观察红细胞的形态。注意事项

如标本本身太短，可观察的部分会受局限，故以在离开载玻片另一端2cm地方涂抹为宜。载玻片、推片的角度越小、血液越薄；涂抹速度越慢、也越薄。在涂抹贫血病人的血液时，将推片稍竖起（不是30°而是35°～40°右较快的速度推比较好，而对红细胞增高的病人则相反。

如用力过猛白细胞容易破损。二染（）液片染将待染涂片平放于染色架上。用滴管将染液滴于涂片上，覆盖整张涂片，放置～3分。加入等量的磷酸缓冲液或蒸馏水，与染液混匀，可以用滴管从一端吸入，另一端放出，混匀为止，或用嘴来回轻轻吹之，使之混匀，室温下染色～10分钟（白细胞数多或骨髓标本时间应长一些，如2030min染色结束时，先用蒸馏水或缓冲液洗将涂片上的染液直接冲掉。再将片子用自来水温和冲洗，至血液膜呈淡红色。甩干或晾干玻片。封片。（）髓片染同血液涂片。【色理．氏料是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料。美蓝（又名亚甲m）四甲基硫堇染料，通常为氯盐，即氯化美蓝。伊红（又名曙eosin）通常钠盐即伊红化钠。美蓝和伊红水溶液混合后产生一种憎液性胶体伊红化美蓝中性沉淀，即瑞氏染料。瑞氏染料溶于甲醇后重18解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。．胞染既有物理性的吸附作用又有化学的亲和作用，各种细胞和细胞的各种成分化学性质不同对各种染料的亲和力也不一样，因此用染色液染色后在同一血片上可以看见不同的色彩。例如：

血红蛋白嗜酸性颗粒为碱性蛋白，与酸性染料伊红结合染成粉红色称为—酸物。细胞核蛋白和淋巴细胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染蓝色或紫色称为—碱性质中性颗粒成等电状态与伊红和美蓝均可结合，染紫红色称为—中物。．PH对细染的响细胞各种成分均由蛋白质构成，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液而定，在偏酸性环境中正电荷增多易与伊红结合染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合染色偏蓝，因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，在染色过程中玻片必须清洁，配制瑞氏染液必用优质甲醇，稀释染液必须用缓冲液，冲洗水应近中性，否则各种细胞染色反应异常，致使细胞识别困难，甚至造成错误。【细发规】血细胞在分化成熟过程中，其形态和大小的变化基本上有一个共同的规律：．胞体：随着血细胞的发育成熟，胞体由大逐渐变小，但巨核细胞系统则由小变大，原始粒细至早幼粒细胞也逐渐由小变大。．胞核大小：由大变小，但红细胞系统例外，成熟红细胞核消失。形状：圆形变为不规则形；粒细胞核呈分叶状；淋巴与浆细胞系统变化不大。染色质：细致、疏松逐渐变为粗糙、紧密。核膜：不明显变为明显；原淋巴细胞核膜最厚；原幼粒细胞核膜最薄；原始单核细胞介于两者之间。核仁：由有至无。清楚的核仁是原始和比较原始细胞的重要标记，呈淡蓝色，随着细胞的成熟而消失。．胞浆量：有少到多。颜色深蓝到浅蓝于巴细胞与浆细胞细胞与粒细胞的胞浆各逐渐变成桔红和粉红色。（3颗粒：一般从无到少并逐渐增多。粒细胞系统由少量的嗜天青颗粒逐渐代之以大量中性、嗜酸和嗜碱颗粒。（4胞核与胞浆体积之比：由大到小。19血片观方．眼察在观察染色标本时，首先用肉眼对颜色进行观察。如果是正常的末梢血液则呈粉红色，白血病时白细胞高度增加或骨髓瘤的γ球蛋白血症等情况下，血涂片会带有蓝色（如下图1-4-1时应意识到为异常标本。．倍下察首先观察血涂片制备和染色是否良好、细胞分布是否均匀，同时可估计白细胞数量增减情况。最后对血涂片的体尾交界的区域进行观察，选择细胞分布均匀不重叠、标本不太厚容易观察的地进行油镜观察（如图．镜观边移动视野边观察下列各项：染是良：果血涂片染色确实不好，应重新染色。观红胞态有无人为造成的变形，此外有时载玻片上的碱性物质的溶出（玻璃效应）会导致红细胞呈严重的棘形红细胞。如固定不良（固定液中含有水分时）会导致呈面包圈形红细胞，从而无法观红细胞的形态。大小如何，是大细胞还是小细胞，有无红细胞大小不一。形态如何，注意有无畸形红细胞、球形红细胞、椭圆新红细胞、靶形红细胞、口形红细胞（唇形红细胞心染色红胞、棘形红细胞、胆状红细胞、皱缩红细胞、泪滴状红细胞、破红细胞及镰状红细胞等。是否有染色性的变化，有无嗜多色性红细胞，中心淡染红细胞。红细胞内有无异常。观察是否有嗜碱性点彩、乔小体、卡波环状体红细胞、幼红细胞、帕彭海姆氏小体和疟原虫的出现。有关大小不一，畸形和嗜多色性，可分为轻度±、中、高度三个级别。）察细形与红细胞比较，判断白细胞数是否正常，是否增加或减少。红细胞/白细胞数约为：。有关白细胞的种类要观察大量白细胞后才可判断是否异常后算白细胞的百分率。在日常检查中，一般只计算个，但是发现异常或白细胞有增加，尽量增加到200。计算的白细胞数越多，白细胞百分率的可信度越高。）察小形通过与红细胞的比较，判断血小板数量是否正常，是增加或减少。正常情况下每15～个红细胞中有个血小板。注意大小的变化。观察未加抗凝剂而直接从毛细血管采集的标本时，要注意血小板的凝集性（观察由若干血小板凝集的现象。如果呈散在状，则怀疑为血小板无力症观察有无寄生虫当白细胞减低白细胞分类中单核细胞增多时注意观察红细胞内有无疟20原虫。注事：．染色涂片水冲洗后，应在空气中自然干燥或风干，不可用火烤干。．染液量要充足，勿使染液蒸发干燥。．细胞染色过浅或过深，待标本干燥后，立即用瑞氏染液或甲醇重新染色数秒或数分钟。．保存过久的细胞涂片，细胞染色会退色，可重新染色。．新鲜涂片应立即染色。血涂和髓片观内血液涂片：选择个野，每个视内红细胞的数量大致相同，观察红细胞的排列、分布及形态，白细胞的数量及核的变化。骨髓涂片面观察成熟红细胞与有核细胞的大致比例确定增生度级标准见表：级别ⅠⅡⅢⅣⅤ

增生度增生极度活跃增生明显活跃增生活跃增生减低增生严重减低

成熟红细/有核细胞1~2/110/120~30/150/1

常见原因白血病白血病、增生性贫血正常骨髓或某些贫血造血功能低下再生障碍性贫血21血一、过氧化物酶POX）色意义POX主要在于粒细胞系，除原粒细胞外，随细胞成熟阳反应增强（嗜碱性粒细胞反应阴性细系从幼单核细胞起呈弱阳性反应，淋巴细胞系、红细胞系及巨核细胞系则任何阶段均呈阴性反应。本染色法最主要用于鉴别急性白血病细胞类型，急粒细胞性白血病呈强阳性，单核细胞性白血病呈弱阳性，急性淋巴细胞性白血病呈阴性反应。二、中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP染色意义细菌性感染时，NAP活性明显增，病毒性或寄生虫性感染时常无明显变化或减低。慢性粒细胞性白血病时明显减低，类白血病反应时则显著增高。慢性粒细胞性白血病时NAP活明显减低，急变时活性增强。急性粒细胞性白血病时活性减低，急性淋巴细胞性白血病时活性增高。再生障碍性贫血时活性增强，阵发性睡眠性血红蛋白尿时活性减低。三、酸性磷酸酶ACP）染色意义单核细胞、网状细胞、吞噬细胞、组织细胞中此酶呈阳性反应，有助于急性单核细胞性白血病、组织细胞性淋巴瘤及恶性组织细胞病的诊断。毛细胞白血病时呈阳性反应，且不为左旋酒石酸所抑制，有助于毛细胞白血病的诊断。高雪细胞呈阳性反应，尼-匹细胞呈阴性反应，有助于两者鉴别。四、特异性酯酶SE）染色意义急性粒细胞性白血病时，原粒及早幼粒细胞的SE活显著增强；急性单核细胞性白血病时一般呈阴性反应；急性淋巴细胞性及巨核细胞性白血病时均呈阴性反应五、非特异性酯酶（NSE）染色义NSE主要存在于单核细胞系，从原单细胞到成熟单核细胞其活性逐渐增强。在急性单核细胞性白血病时呈强阳性反应，但其活性能被氟化钠抑制。急性粒细胞白血病时，有部分病例可呈弱阳性反应，但其活性不能被氟化钠抑制，有助于急性单核细胞性白病与急性粒细胞性白血病的鉴别。六、糖原染色意义鉴别良性与恶性淋巴细胞增生性疾病鉴别幼红细胞增生的性质鉴别急性白血病的类型鉴别某些细胞类型：如巨核细胞呈强阳性反应等。七、铁染色意义鉴别缺铁性与非缺铁性贫血诊断铁粒幼细胞性贫血22血小．细．常细2324染色1.目的:了解过氧化物酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。2.原理:（甲基联苯胺法）粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物peroxidase,POX)，POX能底物四甲基联苯胺tetramethylbenzidine,TMB)氢离子传递给H2O2使之氧化为四甲基联苯胺蓝。四甲基联苯胺蓝又可与亚硝基铁氰化钠结合进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒位细胞质酶所在部。若无亚硝基铁氰化钠基苯胺蓝则自我脱氢氧化成棕色的四甲基苯醌二胺沉着于酶所在部。3.方法步骤取0.1％乙溶液加硝基铁氰化钠饱和溶液10l溶液呈淡棕黄色染色液应在临用前配制。在新鲜干燥的涂片上，加％TMB-硝基铁氰化钠饱和溶液的混合试剂0.5ml，放置后再加稀过氧化氢溶液0.7ml，匀，染色6min。直接用流水冲洗，待干，再用瑞氏染液复染15～20min流水冲洗后，待干，用油镜镜检。结果判断在胞质中出现蓝色蓝黑色颗粒为阳性反应。阴性无颗粒。弱阳性：颗粒小，分布稀疏。阳性颗粒略粗，分布较密集。强阳性：颗粒粗大，密布于整个胞质中。4.注事项：涂片应新鲜制作、厚薄适宜。TMB配制85％～％乙醇溶中染色效果较好，勿用90％～95％醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而使显色反应减弱或消失。过氧化氢溶液需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红25胞呈棕色或绿色，即表示过氧化氢过浓。若过氧化氢加于血片上不产生气泡，则示无效。染色液适宜pH值应为5.5，若pH值<5.0会出现假阳性结果。试剂应置于低温暗处，防止光线照射失效。染色时加稀过氧化氢溶液之后必须与染色液充分混匀，否则同一片子上细胞染色情况不一致。1.目的掌握骨髓铁染色bonemarrowironstain)原理、方法、注意事项及临床意义。2.原骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞内铁也可此法显示，根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量。3.方法步骤干燥涂片用甲醇固定10min，待干。玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，℃染色30min。用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染1015min。流水冲洗，待干，镜检。结果判断幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞外铁用倍镜观察涂片，别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。细胞内铁用镜计数100个红细胞胞中含有蓝色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四。细胞外铁的划分标准(-)：无颗粒。(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小(粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者称为铁小)。(++)：有较多的铁颗粒或小珠。(+++)：有很多的铁颗粒、小珠少数小块状。(++++)：极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。铁粒幼细胞划分：Ⅰ型：幼红细胞内含1～个小铁颗粒。Ⅱ型：幼红细胞内含3～个小铁颗粒。26Ⅲ型：幼红细胞内含6～个铁颗粒，或1-4个大铁颗粒。Ⅳ型：幼红细胞内含10个上铁颗粒，或5个以大铁颗粒。环形铁粒幼细胞：是指幼红细胞含铁粒6，绕核2/3以者。4.注意事项：玻片需经去铁处理将玻片用洁液浸泡24h取出后反复水洗浸入95%酒中24h，晾干，再浸泡在5%盐中24h，用双蒸反复浸洗玻片，取出烤干后备用。骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材不佳时，往往影响结果。酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制5.床意义：鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血时髓细胞外铁显著减少或消失粒红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见，Ⅲ型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁迅速增多，此检查是诊断IDA及指铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如HA、、AA等人的细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可以见到Ⅲ型，罕见Ⅳ型。因此，有助于鉴IDA与非IDA。用于诊断铁粒幼细胞性贫血能到数量不等的环形铁粒幼细胞多见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。用于诊断伴环形铁粒幼细胞增多的MDS：骨髓中环形铁粒幼细胞＞15%。27酸1.目的:了解过碘酸雪反应的原理、方法、注意事项和临床意义。2.原理:过碘酸雪反应(PeriodicacidSchiffreaction,PAS)称糖原染色，其原理为过碘酸可将细胞内含有1,2-乙醇基的糖类化而产生双醛基，后者与雪(Schiff)染料作用，使无色品红为紫红色的化合物，定位于含有多糖类的胞质中。根据胞质中糖原种类及含量多少，可呈现粗细等红色颗粒、块状物或均匀红色。3.方步骤1)新干燥的涂片用％醇定10min流水冲洗，待干。加入10g/L过酸氧化15～20min，馏水冲洗，待干。置雪夫染液中℃或温染30～60min用亚硫酸溶液冲洗3次后再用流水冲洗～3min，待干。20g/L甲复染10～20min。水洗，待干，镜检。结果判断：如在胞质中出现弥散状、颗粒状或块状红色为阳性。胞质无色或无颗粒为糖原阴性反应强度判断标准如下：（）性粒细胞的分级标准：0分胞质无色。分胞质内呈淡红色，有极少颗粒。分胞质呈红色，厚而不透明，或有少量颗粒。分胞质呈深红色，颗粒较紧密，但尚有空隙。分胞质呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。（）巴细胞分级标准：0分胞质内无色。分胞质内呈弥散淡红或有少数细颗(<10个。分胞质内呈弥散较深的红色或有多数细颗10个。分胞质内有较粗颗粒或少数小块状红色物质。284分胞质内呈多数粗颗粒并有块红色物质。（）红细胞的分级标准：0分胞质内无色。分胞质内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。分胞质中有1～个浓的颗粒胞质呈弥散红色。分胞质中有较粗红色颗粒直至小块红色物质。分胞质中有粗大红色块或有粗大致密的紫红色颗粒。（）核细胞的分级标准：0分胞质内无红色颗粒，但仍弥散性着色，此系其它多糖类物质。分少量糖原包涵体，常定位于核膜附近。分中等量糖原包涵体，定位于核膜处或分散在胞质中，约占胞质的1/3。分大量糖原包涵体分散于胞质中，占胞质1/2。分糖原包涵体充满整个胞质。4.注事项：所用染色缸及器具应十分清洁、干燥。雪夫Schiff)染液应避光密封冰保存般4下可保存6个月剂应为无色变红则失效。3）10g/L过碘酸溶液质量要保，变黄则不能用。氧化时间要准确，以20min为。染色时间和温度应相对恒定，一般以37℃染色30min适宜。染色好的涂片应及时检查，以免褪色。偏重亚硫酸钠易于分解，过碘酸易潮解，应密封干燥保存。7)碱品红的质量对实验结果有影响。5.临床意义红血病红白血病及贫血类型的别血病白血病铁性贫血ironanemia,IDA)、重型地中海贫血及骨髓增异常综合(myelodysplasticsyndrome,MDS)时幼红细胞呈强性反应；溶血性贫血hemolyticanemia,、急慢性白血病、淋巴瘤时幼红细胞呈阴性反应或阳性反应；再生障碍性贫血(aplasticanemia,AA)巨幼细胞贫血(megaloblasticanemia,MA)时幼红细胞呈阴性反应。白血病类型的鉴别AML原始粒胞与早幼粒细胞呈阴性或弱阳性反应弥性反应为主原、幼淋巴细胞多呈块状阳性反应，也有少数呈阴性反应原幼单核细胞呈强阳性反应，其颗粒细小，弥散分布。1.目的：掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、方法、注意事项和临床意义。292.原：中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝RR坚牢蓝BB、牢紫酱等。3.方步骤：新鲜干燥的涂片用冷甲甲固定液固定30s流水轻轻冲洗30～，干。把涂片浸入基质孵育液中，在室(季放水浴箱下育1015min。流水冲洗1～2min，苏木素色液中复染～8min流水冲洗，待干，镜检。结果判断胞中出现紫黑色或红色颗粒为阳性。判断标准如下：0分：质中无阳性染色颗粒。分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。5)计阳性率和积分值4.注事项：磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多根据基质选择相适应的重氮盐牢等重氮盐的质量好坏是本法成败的关键。基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥后，才开始配制基质液。若无氨基-甲基-1,3-丙醇，可用巴比妥缓冲pH9.2)或0.2mol/LTris缓液pH9.2)代替。5.临意义：临床上主要用于鉴别：1）慢性粒细胞白血病与类白血反应：慢性粒细胞白血(chronicmyelogenousleukemia,无发性感染者时NAP积一般明显下降，积分常＜分，至零分；类白血病反(leukemoidreaction)时显著增高，积分常＞200分2）阵发性睡眠性血红蛋白尿症再生障碍性贫血：阵发性睡眠性血红蛋白尿(nocturnalhemoglobinuria,PNH)常降低；再生障碍性贫血常增高，病情好转时NAP积分则可逐渐下降。3）急性白血病的细胞类型：增高下降。30第二篇红细胞疾病及其检验第五章

贫血概述第一节贫血的概念和分类诊断：是贫血贫血的程度贫血的原因和类型红细胞的生成与破坏年等将贫血动物的血清注射给兔子天发现兔子血液中红细胞数量增加了2040%据一现象Carnot等提出存在一种体液因子可以调节红细胞的生成年Etslev等人的工作为这种因子的存在提供了直接的证据。在实验中，发现给予贫血动物的血清后，动物内有网织细胞生成现象时血机能增强据人研究的结果Bonsdorff与Jalavisto于1948年提出了"红细胞生成素"（erythropoietin）的概念，以表明该因子对红细胞生成的特异性刺激作用。现在研究表明红胞生成素是种糖蛋白胎儿体内由肾脏及肝脏产生在成人体内主要由肾脏产生。肾功能受到损害，如在慢性肾衰竭的病人中，红细胞生成素的产生受到妨碍，可导贫血的产生。正常人体内血液中红细胞生成素的含量为1018毫位毫。当体内缺氧时，红胞生成素的含量可提高到1000倍上红胞生成素与靶细胞如骨髓细胞脾细胞胎肝细胞特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中红胞的释放量。由此可见，红细胞生成素是一种重要的造血生长因子，对体内红细胞的生成起着不缺少的调控作用。由于该体液因子能刺激红细胞的生成，同时其作用限于红细胞系，故将其命名“红细胞生成素”是很恰当的。红胞生过红细胞系发育的过程是从原红细胞开始的。原红细胞体积大，胞核也大而圆，染色质细粒状，核1～3个，质呈强碱性。由原红细胞发育成为早幼红细胞时，核染色质变粗，胞质内开始合成红蛋白。早幼红细胞约经四次分裂发育为中幼红细胞。中幼红细胞胞体较小，核染色质呈粗块状，质内血红蛋白渐增多。中幼红细胞再增殖，分化，发育成为胞体更小、核固缩、胞质内充满血红白的晚幼红细胞。晚幼红细胞已无分裂能力，它脱去细胞核后就成为网织红细胞，网织红细胞再育成为成熟红细胞而释放入血液循环。31红胞成调组织缺是促红细胞生成的有刺激。不论何种原因而引起的组织缺氧，都能促进红骨髓加速生成和释放红细胞。实验表明，缺能进肾脏产生一种红细胞生成酶，此酶作用于血浆中促红细胞生成素原，使它转化为促红细胞生成素（激素素由血液运送至骨髓，作用于原红细胞膜上的受体，促使这些细胞加速增殖分化并发育为成熟的红细胞，此外，肝细胞和巨噬细胞也可能产促红细胞生成素。雄性激素不但能直接刺激骨髓成血组织，加速红细胞生成，而且还能作用于肾脏使红细胞生成酶活性提高，从而使血液中红细胞数量增多。这就可能解释成年男性红细胞的数量多于女性的原因红胞破红细胞因衰老而被破坏，但也可因其他物理的、化学的或其他病理原因而被破坏。正常时红细胞更新率每日约为1％，比其他组织为高。红细胞老时，细胞膜的可塑性减小而脆性增加，它可因血流撞击血管壁或因穿过毛细血管被压挤变形而破裂，此时膜内酶活性下降也影响膜的坚固性而致破裂。此外，麻醉剂和毒素等也可使红细胞膜的脂质溶解；在免疫过程中，抗体和补体吸附到胞膜上可使红细胞致敏并产生凝集现象，最终导致细胞破裂。红细胞破坏后，血管中的中性粒细和单核细胞可将其吞噬，也可当血液流经肝和脾脏时，被其中的网状内皮系统的巨噬细胞清除。细胞被吞噬后，血红蛋白分解成珠蛋白和血红素，二者均可被摄取回收再利用。临表：一般表现：疲乏、困倦无力是贫血最早症状心血管系统表现：活动后心悸、气短最为常见，部分人出现心衰中枢神经系统：头疼、头晕目眩耳鸣、注意力不集中、嗜睡消化系统表现：食欲减退，腹胀恶心为常见泌尿生殖系统表现：重度贫血，可有轻度蛋白尿，夜尿增多其它：皮肤干燥毛皮枯干等。诊：贫血的病因诊断最重要，诊断贫血的主要手段有：详细询问病史，仔细体格检查，必要的实验室检查。（一）病史询问：贫血发生时间、病程、症状32（二）体检：皮肤，巩膜有无黄染，淋巴结、肝、脾是否肿大，肛诊等（三）实验室检查：是诊断贫血的主要依据血常规检查，血红蛋白及细胞计数是确定贫血的可靠指标。血涂片检查：观察红C、白C、血小板数量变化及形态改变。网织红细胞计数：了解红细胞增生情况以及作为贫血疗效的早期指标（四）骨髓检查：任何不明原因的贫血都应作骨髓穿刺，必要时作骨髓活检。（五）病因检查：根据患者的不同情况选择病因检查项目。33第六章铁谢性疾病一、铁的代谢铁的代谢包括了铁的吸收,在体的运转分布成各种功能性铁蛋白发挥其重要生理作用的储存，铁蛋白分解后铁的再利用及排滞等一系列复杂的生理过程。尽管历经上百年的不懈探索人们已经了解了铁代谢的基本过程，但科学的讲，我们的铁在生理体内的许多代谢细节和调控律并不真正了解。深入研究，掌握铁的代谢规律依然是一个诱人而广阔的研究领域。1的收1938年和Widdowson通口服和静脉注射铁剂后察铁的吸收及利用情。他们发现与其他微量元素不同，铁的排泄能力并不是一个恒定的数值，为此，他们认为铁的吸收到了肠道的调节McCane和widdowson工作是人们认识铁吸收规律的第一项飞跃。此后一些工作证实了McCane等认识。但对在机体的内稳态机制了解很少Granik在1946年出了第一个吸收模式，认为铁有倡导粘膜细胞由肠道粘膜细胞吸收，并与粘膜细胞中的储铁蛋白结合，然后据生理需求，铁进入血液[2]。样Granik认为道粘膜细胞中储铁蛋白库是铁吸收得到调节的原因。进入60年后，越来越的研究结果表明，铁似乎并不经过粘膜细胞中的铁库，而是直接被肠道吸收的。另一些研究成果则显示粘膜细胞储铁蛋白的含量与体内铁水平有一定相关性。这样Wheby在1966年提出了新的铁吸模式，即铁是直接吸收的，但其吸收水平则受到粘膜细胞中储铁蛋白的调节现在看来粘膜细中储铁蛋白的确对铁吸收的抑制和促进起着重要作用仅此，粘膜铁蛋白血液中的转运速度也是铁吸收的重要调节因素。2．铁的排泄55Fe稳定性同位素标记研究表明铁的日排出量为0.95-1.02mg肠排出0o皮肤损失0．2-o．3mg。性失铁多而体存铁又较少是造成女性易贫血的原因。体内储铁水平的化对铁排出有一些影响。如铁缺乏可降低铁排泄量至0．5mg／，铁过量者的铁排泄量可达1．5mg/d。然这一影响并不是很大。其他造成丢失的原因有献血、寄生虫感染、慢性便血等。3．铁的转运、利用和保存运铁蛋白肠道吸收的铁和体内血红素分解的铁经血液转运至机体各部位，与需铁组织细胞膜上的铁蛋白受体结合，运铁蛋白受体的铁运入细胞内。目前，运铁蛋白及运铁蛋白受体的三维结构，34结合部位以及其基因编码已研究的比较清楚，这两种蛋白的合成均受到机体铁水平的调[13]。血球的合成在骨髓完成，作为颗粒球，单核细胞及血小板等细胞前体的多能干细胞也是合成红血的前体。铁卟啉的合成在骨髓细胞的线粒体及细胞质进行，形成的铁卟啉与珠蛋白亚单位结合形血红蛋白。正常情况下，约80％与血浆转铁蛋白结合59Fe入骨髓中红血球细胞，4—天这标记铁又再现于循环的红血球中。血红蛋白与红血球形成的后期的网织红细胞结合，形成红细胞并进入循环。体内过多的铁蛋白和铁血黄素形式储存。铁蛋白中的铁被脱铁蛋白包围，脱铁铁蛋白可摄Fe2，并将其氧化为Fe3＋沉淀在铁心中。正常情况下1μg/L血清铁蛋白可储铁10mg。铁蛋白可被溶酶体尽噬并分解为铁血黄素，铁血黄素为蛋白质，脂类和铁的非特异性结合物。铁进入或离开铁白是铁代谢调控方式，而铁血黄素内的铁重新利用则缓慢而不易调控。铁蛋白的结构及基因编码位点也已被研究了解，其合成也受到铁水平的调节。4.影响铁吸收和利用的因素影响铁吸收的主要因素有以下几个方面：(1)龄，铁营养状况，健康状况；(2)胃肠道内内环；(3)摄入的铁量及化学形式；(4)食中其他有机和无机组分物组织中的血红蛋白与肌红蛋白是膳食中血红素铁的主要来源，其血红素部分在胃中与蛋白质分离。血红素在肠腔中不降解，被小粘膜、上皮细胞以卟啉复合物的形式直接摄入，在细胞内血红素及加氧酶作用下，铁从卟啉环中离出来，再转运入循环血液。因此，血红素铁的吸收一般不受膳食因素影响，也不受胃肠道分泌与PH值影响，吸收率较高，达到％。血红素的吸收不受铁原子价数的影响。在肠道中，红素处于溶解状态时，血红素分子吡哆环中铁六价键中的两个游离价键与其他血红素分子的游离键通过氧化物或桥键形成高分子量聚合体。这种聚合作用降低了血红素铁的吸收。动物率白质的解产物尼克酸，均可与血红素分子中铁的2游离价键结合形成单体的亚铁血色原，而防止血红素间的分子间聚合，这可能是畜类肉、鱼、禽可促进血红素铁吸收的原因。非血红素铁的吸收则受到较多因素的影响，胃肠道中的PH对铁复合物的形成及溶解性有一定作用进而影响铁的吸收；是吸的有效促进因子，其有助于Fe3＋向＋的转变，后者是铁的吸收状态；肉类中含有铁吸收的促进因子，目前认为这可能是由于肉蛋白的分解产物，某些氨基或肽所致；柠檬酸、乳酸、酸、丙酮酸、琥珀酸以及酒石酸等也可促进铁的吸收；一些碳水化合物乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉曾被认为对铁吸收有一定抑制作用，但有关报道有所矛盾，目前难以成定论。组氨酸、赖氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、铬氨酸以促进Fe3＋的吸收。肠道微生物的某些分35产物可抑制铁的吸收；一些金属络合物如有障碍铁吸收的作用；植酸、丹宁、多酚物质的铁合能力较强，是障碍铁吸收的重要因素；这也是茶和咔咖阻碍铁吸收的主要因素。过多摄P、、锌、铜、铬、锰等也可能对铁吸收构成障碍，但也有相当数量的报道表明，微量元素间的影响可比想象的要小得多。维生素A，酸，维生素12核黄素等微营养素对铁的吸收和作用的发挥也起到重要协助作用。二、缺铁性贫血的临床诊断血象轻度贫血为正细胞正色素性贫血。重度贫血为典型小细胞低色素性贫血，红细胞平均体积（MCV、红细胞平血红蛋白含量MCH<28pg、红细胞平均血红蛋白浓度MCHC<30%。血片中红细胞大小不一，小者多见，形态不规则，出现少数椭圆形、靶形和不规则形红细胞，红胞中心淡染区扩大，甚至变成狭窄环状，网织红细胞多数正常，急性失血时可暂时升高。骨髓象骨髓显示细胞增生活跃，主要为幼红细胞增多，幼红细胞体积较小、胞浆发育不平衡。血清铁血铁明显降低。红细胞原卟啉因缺铁而血红素合成减少，缺铁性贫血的红细胞游离原卟啉μg（正常200400μg小细胞低色素性贫血血蛋性小于性小于小于80fl，MCH小，MCHC于。有明确的缺铁病因及临床表现。血清铁小于10.7μmol/L(60总结合力大于μgmol/L(360g/dl)。运铁蛋白饱和度小于。骨髓细胞外铁消失，细胞内铁小于。胞游离原卟啉（）于0.9μmol/L(50g/dl)。血清铁蛋白（SF小于μg/L。铁剂治疗有效。三、鉴别诊断慢性感染性贫血。铁粒幼细胞性贫血。维生素反性贫血。地中海贫血。36(一)血象红细胞、血红蛋白减少，以后者的减少更为严重。贫血轻微时红细胞形态变化不大。重者则呈典型的小细胞低色素性改变MCV<82fl、27pg、MCHC<320g/L、RDW>l5%。白细胞计数及分类一般正常。血小板计数多正常。网织红细胞常轻度增高。(二骨髓象骨髓增生明显活跃。红细胞系明显增生，幼红细胞总百分率>30%其中以中、晚幼红细胞增多为主，各阶段幼红细胞胞体常较小，胞质量少，边缘不整齐，嗜喊性色调较强，细胞核小而致密。粒系细胞总百分率常因红系增生而相对减低，各阶段百分率及细胞形态染色大致正常。粒、红比值减低。巨核细胞系常无明显变化，血小板形态一般正常。成熟红细胞形态学变化同外周血，嗜多色性红细胞较易见到。(三细胞化学染色骨髓涂片铁染色显示细胞内、外铁均减少，幼红细胞中铁小粒减少且着色浅淡。(四其他检查血清铁、血清铁饱和度及血清铁蛋白可呈不同程度的减低，血清总铁结合力增高。37【概述】

DNA巨幼细胞性贫血是由于脱氧核糖核(DNA)合成障碍所引起的一组贫血要体内缺乏维生素B12或叶酸所致，可因遗传性或药物等获得性DNA合成障碍引起。本症特点是呈红细胞性贫血，骨髓内出现巨幼红细胞系列，并且细胞形态的巨型改变也见于粒细胞、巨核细胞列，甚至某些增殖性体细胞。该巨幼红细胞易在骨髓内破坏，出现无效性红细胞生成。约95%的例系因叶酸(和维生素B12缺引起的营养性贫血，其早期阶段，单纯表现为叶酸或维生素B12缺乏者临床上并不少见养巨幼细胞贫血具有地区性国以山西和陕西省等西北地区较多见患病率可达5.3%；性贫血在我则罕见。【病因学】(一维生素缺症1.摄入不足，需要量增加单纯摄入不足引起者甚罕见，仅见长期严格素食者。需要量增加见于妊娠、婴幼儿、溶血性贫血、感染、恶性肿瘤等。2.吸收障碍系生素B12缺症的主要原因。有：①缺乏内因子。见于恶性贫血，存在内因子的抗体：阻断抗体和结合抗体，前者阻止维生素B12与因子结合，后者能和内因-生素B12复合体或单独与内因子结合，以阻止维生B12吸。内因子缺乏也见于胃全部或大部切除及胃粘膜腐蚀性破坏，胃全切除术后发生巨幼细性贫血时间平均为5年，30%40%次全胃切除者有维生素B12吸不良。罕见病例有分泌无力的内因子。②小肠疾病，如小肠吸收不良征群、口炎性腹泻、节段性回肠炎、回肠切除后、小淋巴瘤及硬皮病等。小肠病变常同时有叶酸和铁的吸收减少。此外，尚有罕见的家族性选择性吸不良症Imerslund综合征。某些药物，如对氨柳酸钠、新霉素、苯妥英等，影响小肠内维生B12的收。④阔节裂头绦虫寄生在较高小肠部位，手术盲袋形成及回肠憩室炎因其中细菌繁殖都可夺取食物中维生素，起吸收减少。⑤胃泌素瘤和慢性胰腺炎可引起维生素12吸收碍，系由于维生素B12和R结蛋白结合转变为和内因子结合发生障碍。383.利用障碍如TCⅡ缺乏或存在常的维生素B12合蛋白及应用一氧化氮可响维生素B12转运和利用。(二叶酸缺乏症1.摄入不足，需要量增加见于婴儿、儿童及妇女妊娠期。营养不良性主要由于新鲜蔬菜及动物蛋白质摄入不足所致。需要量增加尚见于慢性溶血、骨髓增殖症、恶性肿瘤、甲状腺机能亢进及剥脱性皮炎等。慢性酒性肝硬化，叶酸摄入和贮存都减少，酗酒使叶酸摄入减少。2.肠道吸收不良如小肠吸收不良综合征、热带口炎性腹泻、短肠综合征、小肠疾病及某些药物作(抗癫痫药如苯妥英、扑米酮等，及口服避孕药。3.利用障碍叶酸对抗物如氨甲喋呤胺嘧啶和甲氧苄氨嘧啶都是二氢叶酸还原酶的抑制剂致酸利用障碍。4.丢失过多如血液透析过程丢失。(三维生素或酸治疗无效合成障碍包括许多抗代谢药如6-巯嘌呤、氟尿嘧啶、羟基脲及阿糖胞苷等的治疗；某些遗传性疾病如乳清酸尿症Lesch-Nyhan综征亚甲基转移酶或N5-基四氢叶酸转移酶的缺乏尚有维素B6反性巨幼细胞性贫血和生素B1反应性巨幼细胞性贫血。【发病机理】〔维生素和酸代谢〕(一维素B12代维生素B12为含钴的维生素，化学名钴(cobalamin)，仅由某些微生物所合成，人体所需的维生素B12主从动物性食物，如肉类、肝、鱼、蛋和乳制品等中摄取成人每天需要量约g，一饮食中的供给量已远超过需要量。正常成人体内含维生B12总约为2～5mg，中约2mg贮在肝内，因此单纯因食物中含量不足而导致缺乏者极为罕见。具有代谢活性的钴胺有两种：甲基钻胺和腺甙钻胺。药用维生素B12系氰胺，它必需在体内转变为活性形式才能被组织所利用。甲基钴胺系蛋氨酸合成酶的辅酶，蛋氨酸系体内合成蛋质的必需氨基酸腺蛋氨酸又是体内许多重要酶反应的甲基提供者甙胺是