大黄的成分提取

大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定关键词：大黄蒽醌类成分提取2012-08-2709:01来源：丁香园点击次数：344概述大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，用于泄下、健胃、清热、解毒等。自古以来，大黄在植物性泻下药中占有重要位置，是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄(RheumpalmatclmL)，大黄(R.officinaleBaill)及唐古特大黄(R.tangutiumMaxim.etRegli)的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蔥醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：0H00HR：名称晶形熔魚-H-COOH大黄酸(Rhein)黄色针晶-OH大萤素(Emodin)橙色鈴聶23425/CH-CH:OH芦荟大黄素橙色细针晶206<OSC(Alae-emodin)-CHs大黄素甲K(Physcian)砖红色针晶207C41-CH3大黄酚(CI)>Tsophanol)金色片状结196C晶大黄中蔥醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH,酸性最强；大黄素连有〃0H,酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-0H,酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-0CH3和-CH3，后者只连有-CH3,因而后者酸性排在第四位。实验目的和要求1．学习缓冲纸色谱的基本操作技术，并能根据色谱结果，设计液液萃取法分离混合物的实验方案。掌握PH梯度法的原理及操作技术。3．通过磷酸氢钙柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚的试验，进一步熟悉柱色谱操作技术。4．学习蒽醌类化合物鉴定方法。实验方法大黄总蔥醌苷元的提取犬貧粗務(100^)攻浴叵流4hr,过鴻，就冒滤液体积二戟渣 範倉提戴液＜^450ml)注意：①大黄中的蔥醌类成分大部分与糖结合，以蔥醌的形式存在于植物组织中。所以要用酸水解使其生成苷元。蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂，用苯时应注意苯蒸气的挥发，严防中毒；②所得的氯仿液中如带有酸水液，应该用分液漏斗分出弃去，并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取。氯仿提取液放置中如有沉淀析出，可滤取之，该沉淀多为大黄素，余液进行下一步分离试验用。总蒽醌苷元分离方案的设计大黄总蒽醌苷元的纸色谱蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验最佳萃取剂及其用量的确定蒽醌类成分各种萃取剂用量的确定新分离方法的设计蒽醌类成分的分离与精制大黄酸的分离与精制将含有总游离蔥醌的氯仿液450ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8缓冲液275ml振摇萃取，静置至彻底分层，放出氯仿液后，到出碱水液至置250ml烧杯中，加HCI酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。大黄素的分离与精制将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液275ml振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCI酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。芦荟大黄素的分离和精制余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH(9:1)碱水液540ml或用0.5%KOH540mI振摇萃取，碱水液加HCl酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。大黄酚和大黄素甲醚的分离--磷酸氢钙柱色谱4．蒽醌类成分的鉴定1)纸色谱鉴定2)IR光谱解析本实验讲解要点及注意事项pH梯度萃取的原理及注意事项。如何设计萃取分离方案的程序与方法。蒽醌化合物红外光谱的特点。分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCI3,回洗碱水液。缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。每步萃取时，利用纸色谱检查跟踪萃取效果，如未达到预想效果应及时纠正。大黄可减轻内毒素性低血压，消除氧自由基，降低再灌注期血浆、肺、小肠等内源性一氧化氮的水平，降低肠、肝、肺毛细血管通透性，减轻内毒素引起的肠壁血管通透性增加，防止肠道细菌移位及内毒素进入血循环等等。临床可用于严重创伤、感染性休克、MODS等危重病预防及治疗胃肠功能衰竭。我们的经验：生大黄30克煎成100ml,灌肠或口服，100ml,l-3次/日，亦可灌肠和口服并用。直到肠鸣音恢复开始减量大黄含有蒽类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等。蔥类衍生物分为：⑴游离蔥醌衍生物，如芦荟大黄素(aloeemodin)、土大黄素(chrysaron)、大黄酚(chrysophanol)、大黄素(emodin)、异大黄素(isoernodin)、虫漆酸D(laccaicacidD)>大黄素甲醚(physcion)、大黄酸(rhein):⑵结合蔥醌化合物，有大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的单和双葡萄糖甙；大黄素、大黄素甲醚的单糖甙；蒽酚和蒽酮化合物：大黄二蒽酮(rheidin)、掌叶二蔥酮(palmidin)以及与糖结合的貳如番泻貳(sennoside)A、B、C、D、E、F等。苷类化合物：土大黄貳(rhaponticin)、3，5,4'-三羟基芪烯一4'-0-0-D-(6'-O-没食子酰)葡萄糖貳(3,5，4'-trihydroxy-stilbene一4'-O-0-D-(6'-O-gallayl)-glucoside)、3，5，4'-三羟基茋烯-4'-O-0-D-吡喃葡萄糖貳(3,5，4'-trihydroxystilbene-4'-0-0-D-glucopyranoside）。萘衍生物：torachrysone-8-0-0-D-glucopyranoside,torachrysone-8-（6‘-oxaly）-glucoside及决明松（torachryson）。鞣质类：没食子酰葡萄糖、d-儿茶素、没食子酸、大黄四聚素（tetrann）等。大黄四聚苯经水解，得没食子酸、肉桂酸及大黄明（rheosmin）。此外合有树脂。尚含有有机酸：苹果酸、琥珀酸、草酸、乳酸、桂皮酸、异丁烯二酸、柠檬酸、延胡紊酸等。大黄中还含有挥发油、脂肪酸及植物甾醇等。本品横切面：根木栓层及皮层大多已除去。韧皮部明显；薄壁组织发达。形成层成环。木质部射线较密，宽2〜4列细胞，内含棕色物；导管非木化，常1至数个相聚，稀疏排列。薄壁细胞含草酸钙簇晶，并含多数淀粉粒。根茎髓部宽广，其中常见黏液腔，内有红棕色物；异型维管束散在，形成层成环，木质部位于形成层外方，韧皮部位于形成层内方，射线呈星状射出。粉末黄棕色。草酸钙簇晶直径20〜160》m,有的至190》m。具缘纹孔、网纹、螺纹及环纹导管非木化。淀粉粒甚多，单粒类球形或多角形，直径3〜45》m,脐点星状；复粒由2〜8分粒组成。取本品粉末少量，进行微量升华，可见菱状针晶或羽状结晶。取本品粉末0.1g，加甲醇20ml浸渍1小时，滤过，取滤液5ml,蒸干加水10ml使溶解，再加盐酸1ml,置水浴上加热30分钟，立即冷却，用乙醚分2次提取，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加氯仿1ml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄对照药材0.1g,同法制成对照药材溶液。再取大黄酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照溶液。照薄层色谱法（附录WB）试验，吸取上述三种溶液各4》l，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶H薄层板上，以石油醚（30〜60°C）-甲酸乙酯-甲酸（155:1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的五个橙黄色荧光主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的橙黄色荧光斑点，置氨蒸气中熏后，日光下检视，斑点变为红色。【检查】土大黄苷取本品粉末0.2g，加甲醇2ml,温浸10分钟，放冷，取上清液10》l,点于滤纸上，以45%乙醇展开，取出，晾干，放置10分钟，置紫外光灯（365nm）下检视，不得显持久的亮紫色荧光。干燥失重取本品，在105C干燥6小时，减失重量不得过15.0%（附录IXG）。总灰分不得过10.0%（附录XK）。酸不溶性灰分不得过0.8%（附录XK）。【含量测定】照高效液相色谱法（附录WD）测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.1%磷酸溶液（85:15）为流动相；检测波长为254nm。理论板数按大黄素峰计算应不低于1500。对照品溶液的制备精密称取大黄素、大黄酚对照品各5mg，分别置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取大黄素溶液1ml、大黄酚溶液2ml，分别置25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得（大黄素每1ml中含4》g、大黄酚每1ml中含8》g）。供试品溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约O.lg［同时另取本品粉末测定水分（附录IXH第二法）］，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加甲醇25ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，精密量取续滤5ml，置50ml圆底烧瓶中，挥去甲醇，加2.5mol/L硫酸溶液10ml，超声处理5分钟，再加氯仿10ml，加热回流1小时，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液用氯仿提取2次，每次约8ml，合并氯仿液，以无水硫酸钠脱水，氯仿液移至100ml锥形瓶中，挥去氯仿，残渣精密加甲醇10ml，称定重量，置水浴中微热溶解残渣，放冷后，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。测定法分别精密吸取上述两种对照品溶液与供试品溶液各5“l，注入液相色谱仪，测定，即得。本品按干燥品计算，含大黄素（C15H10O5）和大黄酚（C15H10O4）的总量不得少于0.05％。大黄中有多种游离蒽醌及其苷类,总含量约2-5%。主要有大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚以及它们的葡萄糖苷等。从大黄中提取分离游离蒽醌时,先用20%硫酸加热使苷类水解，保留滤饼，滤饼用乙醚加热回流提取总蒽醌苷元（游离蒽醌），提取液作TLC鉴识。实验对象实验对象实验对象实验对象::::大黄滤饼 主要仪器主要仪器主要仪器主要仪器、、、、试剂试剂试剂试剂::::电热套、圆底烧瓶、冷凝管、乙醚、硅胶薄层板、石油醚乙酸乙酯实验操作步骤实验操作步骤实验操作步骤实验操作步骤::::总羟基蒽醌苷元的提取：取干燥滤饼，放入100ml圆底烧瓶中，加入乙醚50ml,回流提取3-4小时，得乙醚提取液。乙醚提取液经薄层层析检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶G-CMC-Na,展开剂为石油醚（60-90°C）—乙酸乙酯（7：3）,直立展开。 实验注意事项实验注意事项实验注意事项实验注意事项::::①加热回流时电热套电压小于50v。 ②取石油醚（60-90C）7ml，乙酸乙酯3ml,混合均匀。。③控制点样量，注意点样斑点位置。④仔细观察斑点、溶剂前沿移动距离。后记后记后记后记::::结论：在可见光下可看到4个斑点，Rf最大的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚的混合物，其

20%H2SO4滤乙酸水层乙酸乙酯层乙酸乙酯层弃掉黄色沉淀粗品大黄素结晶具体操作步余3个斑点依20%H2SO4滤乙酸水层乙酸乙酯层乙酸乙酯层弃掉黄色沉淀粗品大黄素结晶具体操作步大黄素的提取、分离流程图大黄粗粉30g【4】150ml 加热1h,抽滤、干燥饼 乙酸乙酯回流提取1h乙酯层 5%NaHCO3萃取紫红色5%Na2CO3 水层红色HCl水洗至中性丙酮溶解分离纯化骤 1.游离蔥醌的提取称取大黄粗粉30g加20%H2SO4水溶液150mL加热1小时放冷抽滤同时滤饼水洗至近中性除去H2SO4 于70°C干燥后置回流装置中加入乙酸乙酯300mL回流提取1小时得到乙酸乙酯提取液。2.PH梯度萃取分离 1将乙酸乙酯提取液加入分液漏斗中用5%NaHCO3水溶液萃取三次经观察乙酸乙酯层颜色变浅及无气泡产生为止。2经5%NaHCO3水溶液萃取后的乙酸乙酯层继以5%Na2CO3水溶液萃取三次乙酸乙酯层经薄层检查（标准大黄素作对照）得知已提尽大黄素后合并三次Na2CO3萃取液并用HC1酸化得大黄素沉淀。注意:加酸时应缓慢加入以防酸液溢出。 3.大黄素的精制过滤大黄素沉淀水洗沉淀物至洗出液呈中性用适量丙酮溶解用自备薄层色谱分离纯化大黄素。薄层层析板上橙色层为大黄素将其刮下溶于丙酮中。【2】用旋转蒸发仪浓缩丙酮溶液得到大黄素结晶。4•大黄素的薄层色谱检识【5】薄层板硅胶CMC-Na板样品液自制大黄素溶液对照品标准大黄素溶液展开剂石油醚-乙酸乙酯7 3显色观察斑点颜色及计算Rf值五、注意事项1）游离蒽醌的提取要控制温度不宜太高2）PH梯度萃取分离时要检查是否萃取完全3）注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。、酸水解用天平称取大黄粉10g,置500ml烧杯中，加20%硫酸水溶液100m1,直火加热1h,用布氏漏斗抽滤，滤饼水洗后于70度左右干燥。2、总羟基蔥醌苷元的提取滤饼经干燥后，置索氏提取器中（（（（预习索氏提取器的预习索氏提取器的预习索氏提取器的预习索氏提取器的结构原理和使用方法结构原理和使用方法结构原理和使用方法结构原理和使用方法、、、、注意事项注意事项注意事项注意事项）））），加入乙醚150ml，回流提取2h，得乙醚提取液。乙醚提取液经TLC检查有大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚和大黄酚。薄层板为硅胶CMC-Na板，展开剂为石油醚-乙酸乙酯，展开后在可见光下可看到四个斑点，Rf=0.9的黄色斑点为大黄酚和大黄素甲醚混合物，在此条件下分不开，其余三个斑点，按Rf值由大到小分别为大黄素（橙色斑点）、芦荟大黄素（黄色斑点）、大黄酸（黄色斑点）。3、pH梯度萃取分离（1）大黄酸的分离与精制将上述乙醚提取液以5%碳酸氢钠溶液振荡萃取，水层呈紫红色。分出水层，再重复萃取数次，直至不显红色为止。合并水层萃取液，用盐酸酸化至pH3左右，即得黄色沉淀。过滤，先用水洗沉淀数次，再用少量冰冷的丙酮洗，以除去有色杂质。干燥后以冰醋酸或吡啶结晶2-3次，得黄色针状结晶。经TLC与标准品对照鉴定为大黄酸。（2）大黄素的分离与精制碳酸氢钠溶液提取后的乙醚层再以5%碳酸钠溶液振荡萃取数次，水层呈红色，合并水层提取液，加盐酸至酸性，得黄色沉淀，过滤，用水洗沉淀，以冰冷丙酮洗，在冰醋酸或吡啶中结晶数次，得橙色大针状结晶。经TLC与标准品对照为大黄素。 （3）芦荟大黄素的分离和精制 碳酸钠溶液提取后的乙醚层，再经0.25%氢氧化钠溶液振荡萃取数次，水层呈红色，合并水层，加盐酸至酸性，得橙色沉淀。过滤后用水洗沉淀，干燥后在冰醋酸或乙酸乙酯中结晶数次，得橙色长针状结晶。经TLC鉴定为芦荟大黄素。（4）大黄酚和大黄素甲醚的分离与提纯上述萃取后的乙醚层用5%氢氧化钠溶液振荡萃取数次，直至无色。合并深红色的水层溶液，加盐酸至酸性，得黄色沉淀。过滤水洗，干燥后得大黄酚和大黄素甲醚混合物，将此混合物溶于乙酸乙酯中，用硅胶柱色谱分离，洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯（15:1）混合液，先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚，再分别经乙酸乙酯结晶纯化，两者经TLC鉴定皆为纯品。、硅胶柱色谱精制大黄素（1）装柱：取100-200目硅胶约10g，按湿法装住（2）加样：将大黄素粗提物溶于5ml石油醚-乙酸乙酯（7:3）混合溶剂中，用吸管吸取样品溶液于色谱柱床顶端。（3）洗脱：用石油醚-乙酸乙酯（7:3）为洗脱剂洗脱，分段收集，每份10ml，用TLC跟踪检查。请大家先预习硅胶柱色谱的湿法和干法装柱及上样的相关注意事项请大家先预习硅胶柱色谱的湿法和干法装柱及上样的相关注意事项请大家先预习硅胶柱色谱的湿法和干法装柱及上样的相关注意事项请大家先预习硅胶柱色谱的湿法和干法装柱及上样的相关注意事项（五）注意事项1、酸水解过程中加热时间应足够长，以保证水解充分。2、同一碱液萃取分为数次，以保证萃取充分，可用TLC监测。3、乙醚总提取物要用保鲜膜封严实，防止乙醚挥发。（六）实验报告要求①记录大黄蒽醌的提取方法及其原理。②比较大黄素、大黄酸、大黄素甲醚的酸性及在TLC中的Rf值（附色谱图）。 3、仪器及试剂大黄中大黄素的提取、分离和鉴定一一一一、、、、实验目的与要求实验目的与要求实验目的与要求实验目的与要求 1．熟悉蒽醌类成分的提取分离方法。2．掌握PH梯度提取法的原理和操作技术。3．学习用硅胶柱色谱法分离精制大黄素。4．学习羟基恩醌类化合物的鉴定方法。二二二二、、、、实验方法实验方法实验方法实验方法（一）、基本原理大黄中羟基葸醌类化合物多数以苷的形式存在，故先用稀硫酸溶液把蒽醌苷水解成苷元，利用游离葸醌可溶于热氯仿的性质，用氯仿将它们提取出来。由于各羟基葸醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离它们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差别，用柱色谱分离之。（二）操作步骤实验步骤实验操作实验现象和结果总羟基蒽醌苷元的提取1称取大黄粉3.5g，用滤纸包裹，置索氏提取器中，圆底烧瓶中加入乙醚150m1,回流提取2h,得乙醚提取液。 乙醚提取液为黄色澄清溶液。2点板，展开，展开剂为石油醚-乙酸乙酯（7:3）。硅胶板上可见四个斑点，从上往下依次为黄色斑点、橙色斑点、黄色斑点、黄色斑点。pH梯度萃取分离1大黄酸的分离和提纯：将提取液用5%NaHCO3振荡提取数次，分出水层，重复提取数次后合并水层提取液，用盐酸酸化至pH3,得黄色沉淀。抽滤，水洗沉淀，再用丙酮洗，干燥后待测。水层提取液为呈紫红色。盐酸酸化时有大量气泡生成。酸化后得到黄色沉淀。2大黄素的分离和纯化：碳酸氢钠溶液提取后的乙醚层以5%Na2CO3振荡提取数次，分出水层，合并水层提取液，加盐酸至酸性（pH6左右），得黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀，再用丙酮洗，干燥后待测。水层提取液呈红色。盐酸酸化后得到黄色沉淀。3芦荟大黄素的分离和提纯：碳酸钠溶液提取后的乙醚层，用0.25%NaOH振荡提取数次，合并水层提取液，加盐酸至pH约为6,得橙色沉淀。抽滤，水洗沉淀，干燥后待测。水层提取液层红色。盐酸酸化后得到橙色沉淀。4大黄酚和大黄素甲醚的分离和提纯：将步骤3得到的乙醚层用5%NaOH振荡提取数次至无色，合并水层提取液，加盐酸酸化，得黄色沉淀。抽滤，水洗沉淀，干燥后待测。水层提取液呈深红色。盐酸酸化后得到黄色沉淀。三、实验结果（1）分离与精制大黄酸的过程中得到了黄色的针状结晶，此结晶就是大黄酸。（2）分离与精制大黄素过程中得到了橙色针状结晶，此结晶就是大黄素。（3）分离与精制芦荟大黄素的过程中得到了黄色针晶，这个就是芦荟大黄素。（4）大黄酚和大黄素甲醚的分离和提纯中得到的黄色沉淀为大黄酚和大黄素甲醚的混合物。实训项目五大黄中游离蒽醌的提取分离及鉴定【实训目的】1．能够运用回流提取法对大黄中总蒽醌类化合物进行提取2.能够熟练运用pH梯度萃取法对大黄中游离蔥醌进行分离。3．正确判断显色反应、薄层色谱的结果【实训原理】大黄中含有大黄素型游离蒽醌及其苷类，本实训利用大黄中的蒽醌类化合物均可溶于乙醇而提取，根据游离蒽醌及蒽醌苷在水和乙醚中溶解度的不同采用萃取方法分离。游离蒽醌的分离是利用各羟基蒽醌类化合物酸性不同，采用pH梯度萃取法进行。【实训材料】圆底烧瓶冷凝管研钵水浴锅分液漏斗烧杯三角瓶表面皿试管层析缸pH试纸薄层硅胶CMC-Na大黄粗粉95%乙醇乙醚盐酸三氯甲烷5%KOH5%Na2CO35%NaHCO30.5%NaOH新华色谱滤纸（20cmX7cm）苯-醋酸乙酯（8：2）苯-甲醇（8：1）甲苯氨0.5%醋酸镁1%大黄酸三氯甲烷溶液1%大黄素三氯甲烷溶液1%芦荟大黄素三氯甲烷溶液【实训步骤】1．乙醇总提取物的制备游离蒽醌的提取取大黄粗粉50g,置于500ml圆底烧瓶中，加95%乙醇以约高出生药面为度，置水浴加热回流2〜3小时，趁热抽滤。滤渣再以95%乙醇热提二次，趁热抽滤后合并三次乙醇提取液。浓缩乙醇提取液，得到乙醇总提取物。2．总游离蒽醌的提取，亲脂性成分与亲水性成分分离将乙醇总提取物浸膏加水适量混悬，加乙醚150ml于500ml分液漏斗中萃取，充分振荡后放置，倾出醚层，再加50ml乙醚振摇，放置，倾出醚层，同法操作6次，直至乙醚液呈色较浅时为止，合并乙醚液，乙醚溶液含总游离蒽醌。3．蒽醌单体的分离大黄酸的分离将含有游离蔥醌的乙醚溶液移至250ml的分液漏斗中，加5%NaHCO3水溶液20m1,振摇