过敏编制说明

《食品中多种植源性过敏原同步定量确证同位素稀释质谱法（征求意见稿）》编制说明《食品中多种植源性过敏原同步定量确证同位素稀释质谱法》标准编制组二0二三年四月《食品中多种植源性过敏原同步定量确证同位素稀释质谱法》编制说明1项目背景1.1任务来源根据浙江省食品学会关于2022年度第一批团体标准立项的通知，南开大学、浙江工商大学、杭州海关技术中心组织起草工作组负责团体标准《食品中多种植源性过敏原同步定量确证同位素稀释质谱法》草案稿的起草工作，并由浙江省食品学会归口。1.2标准制订工作主要过程2022年10月：提交《食品中多种植源性过敏原同步定量确证同位素稀释质谱法》草案稿2022年12月：召开标准起草工作组会议2023年2月：在全国团体标准信息平台发布该标准征求意见稿2023年4月：根据征求意见对标准进行修改，形成送审稿2023年6月：召开团体标准评审会2023年8月：正式发布该团体标准1.3与我国法律法规和其他标准的关系经查新机构查新，目前国内外没有相关的多种过敏原同时定性和定量检测的技术标准。国内标准：目前过敏原检测有国家标准GB/T38163-2019《常见过敏蛋白的测定液相色谱-质谱串联法》和出入境检验检疫行业标准SN/T5276-2020《口食品中多种过敏原的测定液相色谱-质谱串联法》出。这两种方法都是进行单一过敏原的定性检测，外标法进行定量，准确度和通量都低。即，不能实现对多种过敏原的同步定性和精准定量。其他参考了《AOACSMPR2016.002StandardMethodPerformanceRequirements(SMPRs®)forDetectionandQuantitationofSelectedFoodAllergens》及《食品检验操作技术规范（理化检验）》中的技术要求。2标准制订的必要性（标准制订工作的目的与意义）2.1食物过敏已成为全球广泛关注的重大公共卫生和食品安全问题食物过敏是人体摄入食物中的某种成分（过敏原或变应原）后，机体对其产生的异常免疫反应。食物过敏反应发生迅速，微小剂量即可引发消化问题、荨麻疹或气道肿胀等体征和症状，有的可导致严重症状，甚至危及生命。近年来食物过敏已成为全球广泛关注的重大公共卫生和食品安全问题。一些国外流行病学调查研究表明,在世界范围内食物过敏影响近8%的5岁以下儿童和5%的成年人。我国尚没有全国性的食物过敏发生率的调查，但区域调查的结果显示我国的食物过敏形势也不容乐观。如2016对全国31个城市儿童食物过敏调查情况显示，0-14岁儿童食物过敏报告率为5.83%，2022年温州市、江西省调查显示儿童过敏报告率分别为12.86%和3.75%等。随着经济贸易全球化，食品种类越来越丰富和多样，食物过敏的发生率也以每年10%的速度递增[7]，严重影响了易敏人群的身体健康，也给其家庭和社会带来沉重的负担。2.2过敏原定量检测的必要性针对食物过敏治疗，目前尚无完备方案及特效药，食物过敏联盟（FoodAllergyandAnaphylaxisNetwork,FAAN）、美国国家过敏和传染病研究所（NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,NIAID）等的研究结果均表明，避免接触或摄入过敏原是防止过敏反应发生的唯一有效途径。食物过敏原标签制度是国际公认控制食物过敏的最有效手段，易敏人群通过识别食品标签规避对自己有害的食物过敏原。目前，欧美日澳加韩等30多个国家或地区相继对食物过敏原标识进行了规定。我国GB7718-2011《预包装食品标签通则》中也规定，食品及其制品若可能导致过敏反应，需要进行标注。食品标签准确标注过敏原信息依赖于过敏原精准检测技术，所以建立准确的过敏原检测方法可以为过敏原标识标准实施提供技术支撑。更重要的是，食物过敏原按“风险管理”的方式在国内外形成广泛共识，随着激发过敏反应的过敏原阈值被逐渐确定，在实际检测中需要关于过敏性食品的阈值剂量的准确数据（不会在食物过敏人群中引起反应的最高水平的过敏原），从而更有效地向消费者传达这些风险。可见，精准、灵敏的过敏原定量检测技术可为准确评估食物过敏性风险提供技术基础。3国内外相关分析方法研究3.1国内外现有食物过敏原检测技术目前已有多种检测技术应用于食物中潜在过敏原的检测，一类是基于蛋白水平的免疫学检测技术，如免疫吸附实验(radio-allergosorbenttest,RAST)、酶吸附实验(enzymeallergosorbenttest,EAST)、火箭免疫电泳(rockedimmuno-electrophoresis,RIE)、免疫印迹(immuno-blotting)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)等。免疫学方法是目前应用最广的过敏原检测方法之一，但由于靶蛋白构象易受加工过程（热处理，pH变化，水解等）的影响，检测结果往往会出现假阳性或假阴性，准确度较差。另一类是基于基因水平的分子生物学检测技术，包括基聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，实时荧光定量PCR法(quantitativereal-timePCR)以及环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)等。PCR法是间接检测食物过敏原，难以反应过敏原蛋白的真实情况，具有一定的局限性。此外，随着检测新技术和新装备的发展，针对食物过敏原已有不少仪器检测技术，如,生物传感器，纳米材料等。而质谱分析技术以高分辨率、高灵敏度、高通量等优势，在食物过敏原的识别、表征以及定量等研究领域发挥了巨大的作用，成为近年来的研究热点，被认为是过敏原精准定量检测的有力技术手段。3.2同位素稀释质谱法的优越性同位素稀释质谱法（Isotopedilutionmassspectrometry，IDMS）被国际计量组织定为基准方法，是唯一能直接提供微量、痕量和超痕量量值的权威方法[11,12]。也被定为国际上食品安全检测最权威的仲裁检测方法，可实现复杂食品基质中目标物精准定量的重要确证技术，通过将已知质量和丰度的稳定同位素标记物加入到待测样品中，可有效校正检测过程中的基质效应[13]。该技术以筛选到的靶蛋白特征肽段为待检目标物，对应的同位素标记定量特征肽段为内标。由于目标待测物质与其同位素标记物在样本前处理，后期的色谱分离、离子化、质谱分析的整个过程在一起，过程中各因素影响程度相同，因此可以将各类误差降至最低，具有较高的准确度。3.3现有质谱法检测食物致敏原存在的问题在现代化的饮食模式中，加工类食品已成为主要的食品消费模式。目前针对食物过敏原的IDMS方法多是基于单一未加工过敏食物如花生、大豆、鸡蛋、牛奶、榛子等建立的，与实际检测的复杂加工食品（面包、饼干、豆瓣酱、鱼丸虾丸等）或餐饮食品（沙拉、三明治等）不同。相较于未加工的过敏性食物，加工食品中的过敏原具有复杂性、多样性和痕量性的特征，对过敏原的精准定量检测技术提出了更高的要求。首先，加工食品中组分众多，基质效应更加复杂。且食品加工过程（高温、美拉德反应、低PH等）会对过敏原的结构等信息产生较大影响，从而影响过敏原的可检测性[14]。有研究将6种食物过敏原加入巧克力和奶粉基质，质谱扫描分析结果也可以看到：在两种基质中，检测到的肽段数量和种类显著不同。鉴于加工食品中过敏原的复杂性，对筛选的特征肽段提出了更高的要求，用于检测的过敏原特征肽段需较少受基质效应和加工过程的影响。其次，加工食品中往往含有不止一种的食物过敏原，如坚果面包就同时含有小麦、鸡蛋、牛奶、坚果等过敏物质。冰淇淋中同时含有牛奶、鸡蛋、坚果等过敏性食物。由于绝大多数的加工食品都同时含有多种过敏原，具有多样性的特点，因此，高通量的检测方法极具优势，可大大提高检测效率。同时，食品加工环境复杂，链条长，在加工制造过程中因共用加工生产线、共用存储空间等原因而常常存在“痕量”的“cross-contact”。由于极少量的（mg级）食物过敏原即可激发过敏反应[9]，所以加工食品中隐蔽的痕量过敏原极具危险性，潜在风险较大。因此过敏原的检测方法应具有较高的灵敏度，以便能够准确的检测出潜在的痕量过敏原。3.4本标准应用方法的目的和意义建立过敏原精准、灵敏、高通量的检测方法具有重要的应用价值，是保障过敏原标识标准顺利实施、准确评估食品中的过敏原风险、保障我国食品安全和大众健康的技术手段和必然要求，具有良好的应用前景。从应用场景“复杂加工食品”出发建立食物过敏原的确证检测技术，建立一种可以同时对食品中多种过敏原定性和定量的检测方法。其特点一方面可以实现多重检测，通量高，可同时对食物中多种植源性过敏原（小麦、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻）检测；特点二是既能定性，同时又能绝对定量，且内标法的准确度远高于外标法。用该方法进行食物过敏原的检测既能提质（准确性高），其多重检测的特点又使得其检测效率提高，检测成本下降，达到了降本增效的目的。4标准查一下，是制订，还是制订。通篇改一下制订的基本原则和技术路线查一下，是制订，还是制订。通篇改一下4.1标准制订原则根据《中华人民共和国食品安全法》及其实施条例等有关法律法规，按GB/T1.1-2020的编写原则进行编写。以加强海藻纤维卫生安全为原则，深入调查研究，保证起草工作的科学性、规范性和可操作性。（一）可操作性原则本文件制订过程中根据可操作性的原则，结合实际情况，对文件内容进行科学设定。为生产企业、检测单位、市场监督等部门提供科学管理的依据。（二）与国内外标准协调一致原则在制订过程中，起草组按照食品安全标准《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》（GB/T1.1-2020）中的原则要求进行编写。仔细查阅国内外的相关标准，根据实际情况，确定了团标的框架结构和各项技术内容要求。（三）公开透明的原则起草过程中坚持公开、透明的原则，除召开专家座谈会听取意见外，还将向社会公开广泛征求意见，如来自行业协会、检测机构、生产企业以及食品安全监督管理部门等各方意见，并吸收和采纳部分意见。4.2标准制订的技术路线技术路线见下图。图SEQ图\*ARABIC1标准制订的技术路线示意图5方法研究报告5.1方法研究的目标本标准规定了加工食品中小麦、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻过敏原定量确证液相色谱-串联质谱检测方法。本标准适用于饼干、巧克力、冰淇淋、早餐谷物、奶制品等食品基质中小麦、大豆、花生、榛子、核桃、杏仁、腰果和芝麻过敏蛋白的液相色谱-串联质谱测定和确证。5.2规范性引用文件在规范性引用文件中，根据要求和管理引用了相关国家标准等文件。5.3术语和定义、缩略语明确了食物过敏、过敏原、过敏蛋白、多肽、特征肽段等定义规定了下列缩略语适用于本文件。DTT：二硫苏糖醇（dithiothreitol）IAA：碘代乙酰胺（iodoacetamide）IDMS：同位素稀释质谱法（theisotopedilutionmassspectrometry）LC-MS：液相色谱-串联质谱法（liquidchromatography-tandemmassspectrometry）PRM：平行反应检测（parallelreactionmonitoring）Tris：三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]5.4原理利用质谱技术筛选出过敏原特征肽段。利用同位素标记特征肽段（重标肽段）和目标特征肽段（轻标肽段）具有相同的理化性质的特点，以同位素标记肽段为内标，建立轻标肽段与重标肽段丰度比与过敏原含量的线性关系，内标法定量。5.5主要试剂及试剂配制根据实验确定食物中多种植源性过敏原同步定量确证同位素稀释质谱法所需的试剂5.6主要仪器及设备根据实验确定了主要仪器及设备：液相色谱-串联质谱仪：UHPLC和配有HESI源的obitrap高分辨率质谱；分析天平：测量精度为0.0001g；恒温水浴锅；离心机：转速不低于12000g；组织研磨器；各规格移液器；pH计：测量精度为0.01；真空离心浓缩仪；注射器和0.22μm的水系滤膜（聚醚砜滤膜）；酶标仪。5.7试样制备和保存5.7.1标准溶液制备及保存因难以购买到标准物质，实验中以摩尔浓度处理，肽段浓度与靶蛋白同摩尔浓度，以此定量。实验用到的特征肽段和重标特征肽段均要求纯度大于98%。目标肽段，也称轻标肽段，为不含同位素标记氨基酸的各肽段。目标肽段用0.1%的甲酸溶液配置成106fmol/μL的储备液，每管分装成10μL，在-80℃长期冻存。使用时每次使用一管，不重复使用。内标肽段，也称重标肽段，为对应的含有同位素标记氨基酸的肽段。重标肽段也使用0.1%的甲酸溶液配置成106fomol/μL储备液，每管分装成10μL，在-80℃长期冻存；使用时每次使用一管，不重复使用。5.7.2基质溶液制备及保存超市购买面粉、巧克力、冰淇淋、麦片、饼干、早餐谷物粉等产品，参照其配料表含有的成分，同时提取总蛋白并酶解后（详细步骤同8.1试样前处理），进行质谱扫描，采用fullMS-ddMS2扫描模式，确认其含有的蛋白成分。参照AOACSMPR2016.002要求的基质，且不含目标蛋白的基质用于肽段稀释。基质参照其说明书的保存条件密封保存；提取的蛋白用Bradford方法测定提取液中总蛋白的浓度，提取液置于-20℃冰箱内保存。质谱分析前的酶解产物用肽段定量试剂盒进行定量，并置于-80℃冰箱内保存。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。5.8分析步骤5.8.1试样前处理5.8.1.1蛋白提取、还原、烷基化和酶解1）2-3g的食品样本充分研磨后，称量3g放入50mL离心管中，加入20mL300mMTris（pH9.2）、2M尿素，20℃震荡温浴30min，90℃水浴10min。2）5000g离心10min。3)取1mL上清用1mL溶解buffer（200mM的NH3HCO3，pH8.2）稀释。选做步骤：取10μL上清跑SDS；用蛋白定量试剂盒蛋白浓度。4）加入40μL的500mM的DTT，75℃温育30min；80μL500mM的IAA（避光），室温温育30min。5）加入100μL的1%的胰酶乙酸溶液，37℃过夜。6）次日，3000g离心30秒，取上清在90℃孵育10min，终止酶解。7）12000g离心30min，取上清（底部多留一些，上清取500μL足够）。5.8.1.2脱盐用MonoSpinC18脱盐柱（GLSciencesInc.）或其他等同产品进行脱盐，方法参见产品说明书。简述为：1）调节样本pH值：样本用甲酸调节pH约为3-4。2）condition柱子：加入200μL的乙腈，5000g离心1min。加入200μL0.1%的甲酸，5000g离心1min。3）上样：将样本加入柱子上，5000g离心1-2min。4）加入300μL0.1%的甲酸，5000g离心1min。5）将柱子放入回收管内，加入300μL80%的乙腈（含0.1%甲酸），5000g离心1-2min。离心所得溶液即为脱盐后的肽段。5.8.1.3真空悬干用真空浓缩仪悬干脱盐后的肽段。5.8.6.4上样前处理上样前用500μL0.1%的色谱纯甲酸回溶悬干后的肽段，12000g离心30min或过0.22μm的PES滤膜。质谱扫描前建议用肽段定量试剂盒确定肽段浓度，根据质谱要求适量上样。5.8.2标准曲线绘制5.8.2.1轻标肽段系列标准溶液制备取轻标肽段的储存液用不含目标肽段的食物基质制备得到的胰酶酶解物稀释至2500，1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25fmol/μL的标准浓度。5.8.2.2重标肽段溶液的制备向上述轻标肽段系列标准溶液中加入固定量的重标肽段，最终小麦重标浓度为100fmol/μL，杏仁重标肽段浓度为200fmol/μL，其余重标肽段浓度均为50fmol/μL。5.8.2.3LC-MS检测取10μL上述配置好的系列标准溶液，进行LC-MS检测，采用PRM扫描模式。条件参考8.3仪器参考条件部分。5.8.2.4结果计算轻标肽段和重标肽段产物离子的面积，从而得出丰度比与轻标浓度对应关系的标准曲线，并得到最低定量限（S/N=10时的最低浓度）。5.8.3仪器参考条件5.8.3.1液相色谱条件仪器：ThermoScientic™VanquishBinaryFlexUHPLC或相当者。其中ThermoScientic™VanquishBinaryFlexUHPLC型号的UHPLC包含以下组件：SystemBaseVanquishFlex(P/NVF-S01-A)；BinaryPumpF(P/NVF-P10-A-01)；SplitSamplerFT(P/NVF-A10-A)；ColumnCompartmentH(P/NVH-C10-A)；MSConnectionKitVanquish(P/N6720.0405)；VanquishFPumps100μLMixerSet(P/N6044.5100)；VanquishSplitSamplerHTSampleLoop,100μL(P/N6850.1913)分离条件：流动相A:0.1%甲酸/水;流动相B:0.1%甲酸/乙腈色谱柱:Shim-packGISS-HPC18(metalfreecolumn)3.0μm,2.1mm*150mm(P/N:227-30924-03)柱温：40℃，stillair液相色谱梯度见表1。表1高效液相色谱梯度洗脱程序Time（min）Flowrate（mL/min）%A%B00.29010300.26040310.21090360.21090370.29010420.290105.8.3.2质谱条件质谱仪器：ThermoScienticTMQExactive或相当者。质谱源参数：表2。表2扫描所选的质谱源参数Sheathgasflowrate35Auxgasflowrate10Sweepgasflowrate0Sprayvoltage3.8kVCapillarytemp320℃S-lensRFlevel55.0Auxgasheatertemp350℃扫描模式：PRM。扫描条件：见表3，表4和表5。表3PropertiesofthemethodGlobalsettingUserroleStandUselockmassesOffChrom.peakwidth(FWHM)5sTimeMethodduration42minGeneralruntime0to42minPolaritypositiveDefaultchargestate2Inclusion2MS2Resolution70,000AGCtarget1e6MaximumIT100msIsolationwindow1.6m/zFixedfirstmass-(N)CE/stepped(N)CE27表4PropertiesofPRM表5inclusionlist设置Mass（m/z）CS(z)PolarityStart[min]End[min]479.610003positive11.4513.45481.943003positive11.4513.45525.793002positive13.7115.71528.793002positive13.7115.71560.786002positive8.4810.48563.786002positive8.4810.48571.800002positive11.8613.86574.800002positive11.8613.86576.288002positive5.977.97579.288002positive5.977.97678.847002positive7.299.29682.347002positive7.299.29684.355003positive14.6016.60687.688003positive14.6016.60713.433402positive19.2021.20716.433402positive19.2021.20849.968002positive20.1622.16852.968002positive20.1622.165.8.4测定5.8.4.1定性和定量测定该方法能同时完成定性和绝对定量。按8.1试样前处理的步骤对样本进行处理，除了在胰酶酶解步骤后加入和标准曲线绘制时等量的重标肽段。采用和标准曲线绘制时同样的液相色谱条件和质谱条件进行扫描。用和标准曲线绘制时一样的参数进行数据处理，得到轻标肽段和重标肽段的丰度比。每例样本进行三个平行实验。待测物质的保留时间，与重标肽段的保留时间偏差在±2.5％之内，且样本中所选肽段定性离子均出现（附录Ａ中表A.1），则样本中含有相应的主要过敏原。根据内标法原理，将测得的产物离子峰的丰度比值代入基质相近的标准曲线，得到样本中含有的过敏原的绝对数量。对于同时有多个特征肽段的过敏原物质，应根据质谱响应选择最佳肽段用于定量，其余肽段用于辅助过敏原物质定性。5.8.4.2空白实验除不加试样外，均按以上操作步骤进行。5.9结果计算和表述试样中过敏原物质的含量按式（1）进行计算，计算结果保留两位有效数字。C=C=X×V×Mm×106……………（1）式中：C——试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；X——从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为飞摩尔每微升（fmol/μL）；V——样品定容体积，单位为毫升（mL）；M——过敏原蛋白的分子量，单位为千克每摩尔（kg/mol）;m——样品称样量，单位克（g）。5.9.1精密度在重复性条件下，获得的三次独立测定结果差值的绝对值，不得超过其算术平均值的20％。5.9.2线性和定量限通过实验确定不同基质中的定量标准曲线、线性范围及定量限5.9.3回收率通过实验确定不同基质中添加浓度水平各待测过敏原的回收率范围6方法验证6.1方法验证方案参考了《AOACSMPR2016.002StandardMethodPerformanceRequirements(SMPRs®)forDetectionandQuantitationofSelectedFoodAllergens》及《食品检验操作技术规范（理化检验）》中的方法验证要求，在3家有资质的实验室进行准确度和精密度验证。具体验证方案如下：方法准确度：样品中加入标准品，通过加标实验计算回收率。6.2方法验证的主要过程验证方案设计；建立质量检验要求；选定分析人员和单位；样品的统一制备；数据记录、处理；最后报告结果。被委托机构按照委托方提供的验证方法，结合已有的设备仪器情况进行验证，具体方法见方法研究报告。6.3方法验证结果经验证，该方法符合标准要求，回收率在60-120%之间。表6肽段回收率项目加标量理论Arearatio实际Arearatio回收率%（实际Arearatio-截距/理论Arearatio-截距平均回收率fmol/μL榛子TNDNAQISPLAGR2.50.01750.0125571.51%71.51%0.0125571.51%250.20450.2035599.51%98.04%0.1975596.58%2502.08351.9945595.73%96.66%2.0335597.60%榛子ADIYTEQVGR2.50.05340.052498.13%97.19%0.051496.25%250.66240.653498.64%99.09%0.659499.55%2506.64146.565498.86%98.76%6.552498.66%核桃ISTVNSHTLPVLR2.50.04350.041595.40%94.25%0.040593.10%250.46950.437593.18%96.38%0.467599.57%2504.58154.514598.54%96.70%4.346594.87%杏仁GNLDFVQPPR2.50.01630.012375.46%72.39%0.011369.32%250.21230.199393.88%94.58%0.212395.29%2502.11332.081398.49%98.39%2.077398.30%腰果ADIYTPEVGR2.50.08200.060073.16%76.82%0.066080.48%250.70800.666094.07%94.35%0.670094.63%2506.80706.625097.33%98.07%6.726098.81%芝麻AFYLAGGVPR2.50.07980.069887.47%88.10%0.070888.72%250.80580.777896.53%97.52%0.793898.51%2507.47287.459899.83%98.34%7.237896.86%大豆VLIVPQNFVVAAR250.47110.431191.51%92.25%0.438193.00%2505.01114.915198.08%98.09%4.916198.10%花生RPFYSNAPQEIFIQQGR2.50.13420.110282.12%86.22%0.121290.31%250.42020.417299.29%97.62%0.403295.95%2502.64122.482293.98%99.37%2.6002104.75%小麦2506.9475.48179.0%78.92%YFIALPVPSQPVDPR5.48878.9%牛奶TPEVDDEALEK250.20420.192295.05%97.04%0.202299.02%2502.83822.629292.64%97.29%2.6802101.94%牛奶HQGLPQEVLNENLLR2.50.00870.006777.02%88.51%0.0087100.00%250.13070.111785.46%91.97%0.128798.47%2501.70271.686799.06%97.68%1.639796.30%鸡蛋GGLEPINFQTAADQAR2.50.08370.080796.42%96.42%250.33370.276782.92%85.02%0.290787.12%2504.06173.848794.76%95.65%3.921796.55%虾蟹AISNAEGEVAALNR250.27160.244690.06%100.34%0.2706110.63%2503.35163.317698.99%97.96%3.248696.93%鱼TIDDLEDELYAQK250.03530.030385.83%85.83%2500.66730.606390.86%89.88%0.593388.91%7标准实施建议本方法的过敏原特征肽段作为“内标试剂”，形成的高通量定量确证方法可以推广应用于国家及省市食品安全风险评估中心或监测中心对食品过敏原的国检、法检中。还可应用于企业对产品的过敏原筛查及污染源追溯之中。此外，随着国际上30多个国家或地区出台了过敏原标签标识的规定，本研究形成和建立的食品中多过敏原的高通量定量检测技术，还可应用于食品加工企业的委托检验，以便准确进行标签标识，避免因过敏原标识错误而导致的产品撤回和召回，保证进出口食品贸易顺利进行。8参考文献[1]LopesJP,SichererS.Foodallergy:epidemiology,pathogenesis,diagnosis,prevention,andtreatment.CurrOpinImmunol.2020Oct;66:57-64.

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加入300μL0.1%的甲酸，5000g离心1min。（5）将柱子放入回收管内，加入300μL80%的乙腈（含0.1%甲酸），5000g离心1-2min。离心所得溶液即为脱盐后的肽段。真空悬干用真空浓缩仪悬干脱盐后的肽段。上样前用500μL0.1%的色谱纯甲酸回溶悬干后的肽段，12000g离心30min或过0.22μm的PES滤膜。质谱扫描前建议用肽段定量试剂盒确定肽段浓度，根据质谱要求适量上样。标准曲线绘制轻标肽段系列标准溶液制备：取轻标肽段的储存液用不含目标肽段的食物基质制备得到的胰酶酶解物稀释至2500，1000，500，250，100，50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25fmol/μL的标准浓度。重标肽段溶液的制备：向上述轻标肽段系列标准溶液中加入固定量的重标肽段，最终小麦重标浓度为100fmol/μL，杏仁重标肽段浓度为200fmol/μL，其余重标肽段浓度均为50fmol/μL。取10μL上述配置好的系列标准溶液，进行LC-MS检测，采用PRM扫描模式。条件参考8.3仪器参考条件部分。计算轻标肽段和重标肽段产物离子的面积，从而得出丰度比与轻标浓度对应关系的标准曲线，并得到最低定量限（S/N=10时的最低浓度）。仪器参考条件液相色谱条件仪器：ThermoScienticUltimateTM3000UHPLC。其中ThermoScienticUltimateTM3000UHPLC型号的UHPLC包含以下组件:SRD-3600(P/N5035.9230)；HPG-3400RS(P/N5040.0046);WPS-3000TRS(P/N5340.0020);TCC-3000RS(P/N5730.0000);分离条件：流动相A:0.1%甲酸/水;流动相B:0.1%甲酸/乙腈色谱柱:Shim-packGISS-HPC18(metalfreecolumn)3.0μm,2.1mm*150mm(P/N:227-30924-03)柱温：40℃，stillair液相色谱梯度见表2。表2，高效液相色谱梯度洗脱程序Time（min）Flowrate（mL/min）%A%B00.29010300.26040310.21090360.21090370.29010420.29010质谱条件质谱仪器：ThermoScienticTMQExactive或相当者。质谱源参数：表3。表3，扫描所选的质谱源参数Sheathgasflowrate35Auxgasflowrate10Sweepgasflowrate0Sprayvoltage3.8kVCapillarytemp320℃S-lensRFlevel55.0Auxgasheatertemp350℃扫描模式：PRM。扫描条件：见表4-1，表4-2和表4-3。表4-1，PropertiesofthemethodGlobalsettingUserroleStandUselockmassesOffChrom.peakwidth(FWHM)5sTimeMethodduration42min表4-2，PropertiesofPRMGeneralruntime0to42minPolaritypositiveDefaultchargestate2Inclusion2MS2Resolution70,000AGCtarget1e6MaximumIT100msIsolationwindow1.6m/zFixedfirstmass-(N)CE/stepped(N)CE27表4-3，inclusionlist设置Mass（m/z）CS(z)PolarityStart[min]End[min]479.610003positive10.8012.80481.943003positive10.8012.80525.793002positive13.1515.15528.793002positive13.1515.15560.786002positive8.0610.06563.786002positive8.0610.06571.800002positive11.2813.28574.800002positive11.2813.28576.288002positive5.907.90579.288002positive5.907.90678.847002positive7.079.07682.347002positive7.079.07684.355003positive13.9315.93687.688003positive13.9315.93713.433402positive18.6020.60716.433402positive18.6020.60849.968002positive19.6321.63852.968002positive19.6321.63587.322003positive14.8316.83589.322003positive14.8316.83623.297002positive5.817.81626.790002positive5.817.81844.420002positive13.6915.69849.420002positive13.6915.69518.250003positive13.8415.84520.916003positive13.8415.84707.868002positive8.9010.90711.368002positive8.9010.90测定定性和定量测定该方法能同时完成定性和绝对定量。按5