碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多

碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多第一页，共76页。一、核酸的分类DNA(脱氧核糖核酸)

主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）

存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。第二页，共76页。二、DNA提取的几种方法(一）非基因组DNA的提取

质粒DNA的提取碱裂解法煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取差速离心结合SDS裂解法第三页，共76页。质粒DNA－碱裂解法

碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第四页，共76页。质粒DNA－碱裂解法

碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液第五页，共76页。质粒DNA－煮沸法

煮沸法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第六页，共76页。细胞器DNA－差速离心法差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。第七页，共76页。（二）基因组DNA的提取－CTAB法

CTAB法原理CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。第八页，共76页。

CTAB提取缓冲液的经典配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABβ-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)0.1%（V/V）使用前加入Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除（二）基因组DNA的提取－CTAB法第九页，共76页。

CTAB提取缓冲液的改进配方组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClCTABPVP40β-巯基乙醇终浓度100mM20mM1.4M3%(W/V)5%(W/V)2%（V/V）使用前加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。（二）基因组DNA的提取－CTAB法第十页，共76页。

CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液（二）基因组DNA提取－CTAB法第十一页，共76页。SDS法原理（二）基因组DNA的提取－SDS法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度10mM20mM0.4M2%

SDS法DNA提取缓冲液第十二页，共76页。

SDS法流程图（以动物组织为例）动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液（二）基因组DNA的提取－SDS法第十三页，共76页。（三）基因组DNA－其它方法

物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法

根据细胞裂解方式的不同有：第十四页，共76页。（三）基因组DNA－其它方法

吸附材料结合法：

根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料

阴离子交换树脂磁珠

高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。第十五页，共76页。（三）基因组DNA－其它方法浓盐法：

有机溶剂抽提法：

密度梯度离心法：

利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物第十六页，共76页。（四）动物基因组DNA的提取

主要方法：(1)浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。1）用1M氯化钠提取,得到的DNP粘液2)与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡,使乳化3)离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中4)用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.第十七页，共76页。用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,而阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。（2）阴离子去污剂法:第十八页，共76页。（3）苯酚抽提法:苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA连接键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA的水相。利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。第十九页，共76页。1.材料、设备及试剂材料：冷冻或新鲜抗凝全血，组织样品设备：EP管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，涡旋振荡器试剂：裂解液ligsisbuffer（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇、NaAc、RNA酶、无水乙醇、灭菌水第二十页，共76页。1）在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。2）沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min

。3）彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h

。4）加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5）每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。2.操作步骤（血样）第二十一页，共76页。6）取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇（24：1），摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7）取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8）取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。9）以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。10）加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。第二十二页，共76页。核酸的理化性质在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在三、核酸制备的一般原则微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来第二十三页，共76页。分离纯化核酸总的原则：核酸纯化应达到的要求：①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂

和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染。①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。第二十四页，共76页。核酸制备时应注意的事项:

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。

第二十五页，共76页。降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制剂

第二十六页，共76页。①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。

②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。DNase抑制第二十七页，共76页。①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。

RNase抑制第二十八页，共76页。

常用的RNA酶抑制剂

焦磷酸二乙酯（DEPC）抑制强烈、不彻底

异硫氰酸胍有效抑制、分解核蛋白氧钒核糖核苷复合物有效抑制RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）有效抑制其它：SDS、尿素、硅藻土等有效抑制上述大部分试剂有致癌之嫌，应谨慎操作！第二十九页，共76页。核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。

去垢剂的作用：1、溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠核酸制备中常用的去垢剂第三十页，共76页。作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用

如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC核酸制备中常用的蛋白质变性剂第三十一页，共76页。DNase:降解DNA

RNase：降解RNA蛋白酶K：降解蛋白质溶菌酶：破碎细胞

核酸制备中常用的酶第三十二页，共76页。四、核酸制备的一般步骤：破碎组织细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第三十三页，共76页。1、材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）第三十四页，共76页。

微生物：溶菌酶、SDS裂解。

高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。

酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。

动物：液氮处理后用匀浆器或者研钵破碎。

细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂2）破碎细胞（防止核酸酶的作用）第三十五页，共76页。首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离使核酸与蛋白质分离除去脂类多糖的除去3）破碎抽提核酸除去杂质第三十六页，共76页。根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。

4）核酸的纯化第三十七页，共76页。核酸保存的主要条件是温度和介质

温度：

4℃样品经常使用-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存-20℃保存,避免反复冻融保存介质：

灭菌水

TE缓冲溶液(最常用)：

10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.05）核酸样品的保存第三十八页，共76页。6）注意事项——材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集第三十九页，共76页。6）注意事项——细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁高温温浴时，定时轻柔振荡第四十页，共76页。6）注意事项——核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法第四十一页，共76页。6）注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解

第四十二页，共76页。DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）五、.DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因对策第四十三页，共76页。材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染DNA样品反复冻融尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题二：DNA降解对策

原因第四十四页，共76页。实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；细菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少对策

原因第四十五页，共76页。（一）．材料：组织或者细胞（二）.方法：TRIzol法，试剂盒六.动物基因组总RNA的提取第四十六页，共76页。1、总RNA提取试剂盒亚硫氢胍，巯基乙醇，n-月桂肌氨酸：变性细胞内及核蛋白复合物，释放RNA；有效抑制核酸酶。苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（pH4.7）：酸平衡苯仿可抽提去除杂物。DNA及蛋白沉淀到有机相，RNA留在水相。酸性有机溶剂的抽提可免除用氯化锂选择沉淀RNA。用锂沉淀导致小于5.8sRNA的丢失，并不利于下游操作。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，及沉淀RNA。第四十七页，共76页。1．TRIzol试剂2．氯仿3．异丙醇4．75%乙醇（DEPC水配制）5．DEPC水2、TRIzol法提取RNA试剂准备:第四十八页，共76页。（三）操作步骤1、TRIzol法（组织）戴一次性手套将组织样品从液氮中取出，用干灭过的剪刀将样品外包裹用纱布及表层的肉样剪掉，然后放入干灭过的研钵中，往研钵中倒入液氮，快速研磨成细末状；用1ml一次性塑料吸头挑取细末装入灭过菌的7mL一次性塑料离心管中用电子天平进行称量，每管中称取0.2g肉样；往管中加入2mLTRIZOL，用力振荡后于15-30C温育5min以裂解细胞，再加入0.4mL三氯甲烷并剧烈振荡15s后于15-30C温育3min；第四十九页，共76页。将离心管置于冷冻离心机2-4C10000rpm/min离心15min，小心吸取上清转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后于15-30C温育15min以沉淀总RNA；将离心管置于冷冻离心机2-8C10000rpm/min离心15min，弃上清；加入2mL用冰预冷的75%乙醇漂洗，2-8C7000rpm/min离心5min，弃上清，于室温干燥10min；加入适量DEPC处理水并于55-60C水浴温育10

min以溶解总RNA，取适量用于DU640核酸蛋白测定仪测定浓度。余下总RNA样品的水溶液须保存在-80C。

第五十页，共76页。2、TRIzol法（细胞）将1mlTrizol加入1-5×105细胞（6孔板）中，室温放置3min。

将全部溶液转移到1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。4℃离心，12000g×15min，取上清液(约400ul)。加入0.4ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000g×10min，弃上清。加入1ml75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。晾干，加入适量的DEPCH2O溶解（65℃促溶10-15min）。第五十一页，共76页。（四）RNA电泳检测和定量

RNA电泳检测核酸浓度仪检测第五十二页，共76页。RNA电泳检测和定量1、核酸浓度仪检测纯度：OD260/OD280≥1.8

浓度：稀释倍数×读数比色皿需经浓盐酸：甲醇（1：1）溶液浸泡！第五十三页，共76页。

RNA电泳检测和定量2、琼脂糖电泳检测制备1.2%凝胶：将1.2g琼脂糖溶于63mLDEPC处理水，冷却至60C，加入20mL5甲醛凝胶电泳缓冲液和17mL37%甲醛，混匀后在通风橱内灌制凝胶，于室温放置30min，使凝胶凝固;制备总RNA样品：在一灭过菌的0.5mL的微量离心管中混合4.5μL总RNA，2μL5甲醛凝胶电泳缓冲液，3.5μL37%的甲醛和10μL去离子甲酰胺，于65C水浴温育15min，冰浴冷却，稍加离心使管内液体集中于管底。往管中加入2μL甲醛凝胶加样缓冲液和1μL1mg/mL的EB溶液，混匀;

第五十四页，共76页。电泳检测：将已凝固的凝胶浸入1甲醛凝胶电泳缓冲液中，5V/cm电压预电泳5min。然后将已制备好的总RNA样品加入点样孔，5V/cm电压电泳1h。结束电泳，将凝胶放入紫外透射仪内观察。通城猪肌肉组织总RNA电泳检测结果第五十五页，共76页。通城猪不同组织总RNA的电泳检测结果第五十六页，共76页。RNA检测结果第五十七页，共76页。（五）注意事项1.

所有玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤2hr或更长时间；2.

塑料器皿用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗；3.

有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干；第五十八页，共76页。4.

配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌；5.

操作人员戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换；6.

设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。第五十九页，共76页。（六）影响RNA提取的因素

1、材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存第六十页，共76页。影响RNA提取的因素

2、样品破碎及裂解：根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量第六十一页，共76页。3、纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素第六十二页，共76页。RNA提取常见问题

RNA的降解

OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳第六十三页，共76页。RNA降解

新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。第六十四页，共76页。RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。第六十五页，共76页。OD260/OD280比值偏低

蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第六十六页，共76页。OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，并且彻底去掉75%乙醇。解决办法:再沉淀一次后，溶解。