NGS二代测序培训

NGS二代测序培训演讲人：2024-07-09FROMBAIDUNGS二代测序技术概述NGS实验操作流程与技巧数据质量控制与解读方法论述生物信息学在NGS数据分析中应用实验室安全与法规遵守要求说明实际操作演练与问题解答环节目录CONTENTSFROMBAIDU01NGS二代测序技术概述FROMBAIDUCHAPTERNGS技术原理简介高通量测序利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序，从而实现高通量测序，使得测序速度和通量大大提升。数据产出与分析测序完成后，会产生大量的数据，需要利用生物信息学方法进行数据分析和解读，包括质量控制、序列比对、变异检测等步骤。边合成边测序通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列，特有的技术体系包括可逆终止子、DNA聚合酶和荧光标记的dNTP。030201NGS技术起源于上世纪90年代，经历了从第一代到第二代的跨越式发展，测序通量和速度得到了极大的提升。技术起源与早期发展目前市场上主流的NGS测序平台包括Illumina、ThermoFisher等，它们各自具有独特的技术特点和优势。当前主流平台与技术特点随着NGS技术的不断进步，测序成本逐渐降低，同时数据产出和分析也面临着更大的挑战和机遇。技术进步带来的挑战与机遇发展历程及现状应用领域与市场需求基础科研领域NGS技术在基因组学、转录组学和表观遗传学等基础科研领域有着广泛的应用，为科学家提供了前所未有的研究手段。临床医学领域其他应用领域NGS技术在疾病诊断、精准医疗和药物研发等临床医学领域发挥着越来越重要的作用，为个体化医疗的实现提供了有力支持。此外，NGS技术还在农业育种、生态环境监测、法医鉴定等领域展现出广阔的应用前景。通过本次培训，使学员全面了解NGS二代测序技术的原理、发展历程、应用领域及市场需求，掌握基本的测序数据分析和解读能力，为今后的科研或临床工作打下基础。培训目标本次培训将围绕NGS技术原理、测序平台与操作流程、数据产出与分析方法、应用领域与前景等方面展开详细讲解，并结合实践操作和案例分析，使学员能够学以致用。内容安排本次培训目标与内容安排02NGS实验操作流程与技巧FROMBAIDUCHAPTER质量控制对采集的样本进行质量检测，包括DNA/RNA的浓度、纯度以及完整性等，以确保样本质量符合实验要求。样本采集根据实验需求，采集适当的样本，如血液、组织等，并确保采集过程中避免污染。样本保存与运输采用适当的保存方法，如低温保存，并确保在运输过程中样本的完整性和稳定性。样本准备及质量控制方法文库构建原理掌握文库构建过程中的关键步骤和操作技巧，以提高文库构建的成功率和质量。文库构建操作技巧质检标准了解文库质检的方法和标准，包括浓度、片段大小分布等，以确保文库质量满足测序要求。了解不同NGS平台的文库构建原理，包括片段化、末端修复、加A尾、连接接头等步骤。文库构建与质检标准介绍仪器准备检查测序仪的状态，确保其正常运行，并进行必要的维护和保养。试剂准备准备测序所需的试剂，如测序引物、酶等，并确保其质量和浓度符合要求。样本加载按照测序仪的要求，正确加载待测样本，并设置适当的测序参数。注意事项在测序前，应仔细检查所有步骤是否按照要求完成，以避免测序失败或数据质量不佳。上机测序前准备工作及注意事项数据下机后初步处理流程数据下载与解压从测序仪上下载原始数据，并进行解压操作，以便进行后续分析。数据质量评估对原始数据进行质量评估，包括读取质量、碱基质量等，以确保数据质量可靠。数据过滤与修剪根据质量评估结果，对数据进行过滤和修剪，以去除低质量或不可靠的读取。初步分析对数据进行初步分析，如统计读取数量、GC含量等，以了解数据的整体情况。03数据质量控制与解读方法论述FROMBAIDUCHAPTER原始数据质量评估指标讲解碱基质量值（QualityScore）01讲解如何通过碱基质量值评估测序数据的质量，包括Q20、Q30等质量指标的含义和重要性。测序深度（SequencingDepth）02介绍测序深度的概念及其对变异检测准确性的影响，探讨不同测序深度下变异检测的灵敏度和特异性。GC含量（GCContent）03分析GC含量对测序质量的影响，以及如何根据GC含量调整测序策略以提高数据质量。重复序列（DuplicateReads）04解释重复序列产生的原因及其对数据分析的影响，讨论去除重复序列的方法和必要性。去除低质量序列分享根据质量值、测序接头等信息去除低质量序列的技巧，以提高数据的准确性和可靠性。校正测序错误数据标准化处理数据清洗、过滤和校正技巧分享介绍使用工具对测序错误进行校正的方法，包括基于k-mer的校正、基于统计模型的校正等。讲解数据标准化处理的必要性和方法，以确保不同样本之间的数据具有可比性。变异检测和注释方法探讨变异检测算法介绍常用的变异检测算法及其原理，包括基于贝叶斯模型的算法、基于启发式搜索的算法等。变异注释数据库分享常用的变异注释数据库及其使用方法，如dbSNP、1000GenomesProject等，以帮助研究人员理解和解释检测到的变异。变异筛选和优先级排序探讨如何根据变异的类型、频率、功能影响等因素对变异进行筛选和优先级排序，以便后续分析和验证。报告撰写和结果解读要点介绍NGS二代测序报告撰写的规范和要点，包括实验设计、方法、结果、讨论等部分的撰写技巧。报告撰写规范分析在结果解读过程中常见的误区和注意事项，以提高研究人员对结果的准确理解和解释能力。结果解读误区通过具体案例分析和讨论，帮助研究人员更好地理解和掌握NGS二代测序数据的解读方法和技巧。个案分析与讨论04生物信息学在NGS数据分析中应用FROMBAIDUCHAPTER生物信息学基本概念及常用工具介绍01综合运用数学、计算机科学和生物学的知识，对生物数据进行获取、加工、存储、分配、分析和解释的科学。BLAST（序列比对工具）、Bowtie/BWA（短序列比对工具）、SAMtools（处理SAM/BAM格式数据）、GATK（基因组分析工具包）等。NCBI（美国国家生物技术信息中心）、ENSEMBL（欧洲生物信息学研究所基因组数据库）等。0203生物信息学定义常用生物信息学工具数据库资源01基因组组装将测序得到的短序列拼接成完整的基因组序列，包括重叠群（contig）构建和支架（scaffold）构建。基因组注释识别基因组中的基因、转录本、重复序列等元素，并对其进行功能注释，包括基因预测、转录本识别、功能域分析等。常用软件Velvet、ABySS等用于基因组组装；GeneMark、GlimmerHMM等用于基因预测；BLAST2GO、InterProScan等用于功能注释。基因组组装和注释原理讲解0203差异表达基因检测比较不同条件下基因表达量的变化，识别显著差异表达的基因，常用DESeq2、edgeR等R包进行分析。实验设计合理的实验设计对于准确识别差异表达基因至关重要，包括生物学重复、实验分组等因素。基因表达量分析通过测序数据计算基因的表达水平，常用RPKM/FPKM等指标进行量化。基因表达量分析和差异表达基因检测通过比对测序数据与参考基因组，识别单核苷酸变异（SNP）、插入/删除等变异类型。变异位点检测变异位点功能预测和验证方法利用生物信息学方法和数据库资源预测变异位点的功能影响，如SIFT、PolyPhen等工具。功能预测包括PCR扩增和测序验证、基因型与表型关联分析等，以确认变异位点的真实性和功能影响。验证方法05实验室安全与法规遵守要求说明FROMBAIDUCHAPTER实验室安全管理制度及操作规程实验室应制定详细的安全管理制度，包括实验室人员行为规范、设备使用规定、危险品存储与操作要求等。定期对实验室进行安全检查，确保各项安全设施完备且符合规范要求。实验室应设立安全警示标识，对潜在的安全风险进行提示。制定应急处理预案，对可能发生的安全事故进行预防和应对。根据实验操作的风险等级，选择适当的个人防护装备，如实验服、手套、护目镜、口罩等。掌握正确的穿戴方法和使用注意事项，避免因操作不当而导致的安全事故。定期对个人防护装备进行检查和更换，确保其处于良好的使用状态。对于特殊操作或高风险实验，需采取额外的防护措施，如使用全面罩或正压式呼吸器等。个人防护装备选择与使用指导危险品管理与废弃物处理流程实验室应对危险品进行严格管理，建立详细的台账和使用记录。危险品的存储应符合相关规范，分类存放、标识清晰，并确保存储环境的安全。定期对危险品进行检查和盘点，确保其数量和质量与台账相符。废弃物应按照相关规定进行分类处理，确保不会对环境造成污染。相关法规政策解读及合规性建议实验室应了解和遵守国家及地方关于实验室安全和环保的法规政策。01定期对相关法规政策进行学习和培训，确保实验室人员的合规意识和操作技能。02针对实验室的实际情况，制定符合法规要求的操作规程和管理制度。03与相关部门保持沟通，及时了解法规政策的更新和变化，确保实验室的合规运营。0406实际操作演练与问题解答环节FROMBAIDUCHAPTER030201DNA样本制备详细演示如何从生物样本中提取DNA，包括细胞裂解、蛋白质消化和DNA纯化等步骤。文库构建与质控展示如何将提取的DNA样本转化为可用于测序的文库，并进行质量检查以确保文库质量。上机测序流程介绍测序仪的基本操作，包括样本加载、测序程序设置和数据收集等。实验操作演示测序数据质量控制教授学员如何使用软件对测序数据进行质量评估，识别并去除低质量序列。序列比对与变异检测演示如何将测序数据比对到参考基因组，并识别单核苷酸变异、插入/删除等遗传变异。基因表达量分析介绍基因表达量分析的基本原理和方法，包括转录组组装、基因表达定量和差异表达分析等。数据分析软件使用教程学员针对实验操作演示和数据分析软件使用教程中遇到的问题进行提问。