《DNA重组技术的基本工具》课件解读

《DNA重组技术的基本工具》课件解读第一页，编辑于星期六：八点三十五分。第1页，共39页。每100kg猪或牛的胰腺中仅可提取4~5g。1979年，美国将人的胰岛素基因重组到大肠杆菌内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。治疗糖尿病特效药——据WTO调查：2005年全世界约有糖尿病患者1.8亿人，我国约6000万。胰岛素思考：转基因技术实现了一种生物的某些性状在另一种生物中表达。这些性状的表达与我们学过的基因的什么过程有关？密码子在生物界是的！DNA(基因)mRNA蛋白质(性状)转录翻译共用第二页，编辑于星期六：八点三十五分。第2页，共39页。基因工程的产物第三页，编辑于星期六：八点三十五分。第3页，共39页。基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过

和

，赋予生物以

，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在

水平上进行设计和施工的，又叫做

技术。定向地改造生物的遗传特性。转基因技术体外DNA重组DNA分子DNA重组新的遗传特性第四页，编辑于星期六：八点三十五分。第4页，共39页。基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平剪切→拼接→导入→表达第五页，编辑于星期六：八点三十五分。第5页，共39页。问题探讨：苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？苏云金芽孢杆菌毒蛋白普通棉花抗虫棉第六页，编辑于星期六：八点三十五分。第6页，共39页。基因工程培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞一、DNA重组技术的基本工具第七页，编辑于星期六：八点三十五分。第7页，共39页。解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀”——限制性核酸内切酶关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：抗虫基因与棉花DNA“缝合”关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针”——DNA连接酶“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体1.1、DNA重组技术的基本工具第八页，编辑于星期六：八点三十五分。第8页，共39页。思考：⒈自然界是否存在一种生物的DNA进入另一生物的情况？2.单细胞生物并没有在进化中灭绝，有何保护机制？

可能产生了一些特殊的酶来防范。可而这种酶能识别外来侵入的DNA并将其分解，而对自身的DNA不能起作用。“分子手术刀”——限制性核酸内切酶第九页，编辑于星期六：八点三十五分。第9页，共39页。1.“分子手术刀”——限制酶（1）来源：主要是从

中分离纯化出来的。（2）功能：①能够识别双链DNA分子的某种特定的

，②并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的

断开.(切割部位一般都具有反向重复序列）因此具有专一性(特异性）。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：

和

。原核生物核苷酸序列磷酸二酯键黏性末端平末端第十页，编辑于星期六：八点三十五分。第10页，共39页。思考与探究P7（2）1、细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列；2：通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？第十一页，编辑于星期六：八点三十五分。第11页，共39页。T磷酸二酯键1234512345A第十二页，编辑于星期六：八点三十五分。第12页，共39页。Goback第十三页，编辑于星期六：八点三十五分。第13页，共39页。限制酶DNA解旋酶区别限制性内切酶与解旋酶的区别切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯键将DNA两条链的氢键打开形成两条单链第十四页，编辑于星期六：八点三十五分。第14页，共39页。限制酶的识别序列：能被限制酶特异性识别的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。第十五页，编辑于星期六：八点三十五分。第15页，共39页。限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。想一想限制酶所识别的序列有什么特点？第十六页，编辑于星期六：八点三十五分。第16页，共39页。

EcoRⅠ黏性末端黏性末端第十七页，编辑于星期六：八点三十五分。第17页，共39页。

EcoRⅠ黏性末端黏性末端第十八页，编辑于星期六：八点三十五分。第18页，共39页。什么叫黏性末端？被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第十九页，编辑于星期六：八点三十五分。第19页，共39页。SmaⅠ平末端平末端第二十页，编辑于星期六：八点三十五分。第20页，共39页。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平)末端？要切两个切口，产生四个黏性(平)末端。如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性(平)末端，然后让两者的黏性(平)末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。思考?第二十一页，编辑于星期六：八点三十五分。第21页，共39页。……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同来源的DNA片段混合将不同种来源的DNA片段连接起来生物A基因片段生物B基因片段……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……酶切第二十二页，编辑于星期六：八点三十五分。第22页，共39页。二、“分子缝合针”——DNA连接酶①作用:

把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来.②作用原理：催化

形成磷酸二酯键第二十三页，编辑于星期六：八点三十五分。第23页，共39页。③类型：类型E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源功能大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)相同点差别第二十四页，编辑于星期六：八点三十五分。第24页，共39页。可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，E·coliDNA连接酶（或T4DNA连接酶）即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键第二十五页，编辑于星期六：八点三十五分。第25页，共39页。

T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低T4DNA连接酶第二十六页，编辑于星期六：八点三十五分。第26页，共39页。DNA聚合酶DNA连接酶区别1区别2相同点DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板第二十七页，编辑于星期六：八点三十五分。第27页，共39页。三、“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体⒈载体需要的条件：⑴有1~多个限制酶切点⑵对受体细胞无害⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达⑷有某些标记基因，便于筛选⒉常用运载体：⑴细菌的质粒⑵噬菌体或某些动植物病毒⑶假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录，转基因生物能有预想的效果吗？⑴作为分子运输车——载体，如果没有切割位点将会怎样？⑵霍乱菌的质粒多个限制酶切点，你会用它来做分子运输车吗？

⑷目的基因有没有进入受体细胞，如何去发现？

第二十八页，编辑于星期六：八点三十五分。第28页，共39页。常用的载体：质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别第二十九页，编辑于星期六：八点三十五分。第29页，共39页。第三十页，编辑于星期六：八点三十五分。第30页，共39页。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：思考与探究P7第三十一页，编辑于星期六：八点三十五分。第31页，共39页。1）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。第三十二页，编辑于星期六：八点三十五分。第32页，共39页。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。第三十三页，编辑于星期六：八点三十五分。第33页，共39页。4、DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。思考与探究P7第三十四页，编辑于星期六：八点三十五分。第34页，共39页。什么是内含子和外显子？原核细胞基因的编码区是连续的，真核细胞基因的编码区是间隔的、不连续的.真核生物基因的结构特点是：“编码区是间隔的、不连续的。”也就是说：能够编码蛋白质的序列被不能编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。其中，能够编码蛋白质的序列叫外显子，不能编码蛋白质的序列叫内含子。真核基因包括编码区和非编码区，编码区又分为外显子和内含子,内含子不翻译蛋白质。知识拓展第三十五页，编辑于星期六：八点三十五分。第35页，共39页。什么是内含子和外显子？在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因。真核生物的结构基因是断裂的基因。一个断裂基因能够含有若干段编码序列，这些可以编码的序列称为外显子。在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开，这些间隔序列称为内含子。内含子（Interveningregion）是一个基因中非编码DNA片断，它分开相邻的外显子。更精确的定义是：内含子是阻断基因线性表达的序列。DNA上的内含子会被转录到前体RNA中，但RNA上的内含子会在RNA离开细胞核进行转译前被剪除。在成熟mRNA被保留下来的基因部分被称为外显子。真核生物的基因含有外显子和内含子，是前者区别原核生物的特征之一。